張麗麗 趙輝 郭靜遠(yuǎn) 夏啟玉 賀萍萍 霍姍姍 屈靜 符冬妹 郭安平

摘? 要? 為了研究應(yīng)用于狗尾草響應(yīng)不同干旱及鹽脅迫基因表達(dá)的內(nèi)參基因，本研究從網(wǎng)站https：//phytozome.jgi.doe. gov/pz/portal.html上獲得狗尾草A10品系8個(gè)actin基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，以不同程度的干旱及不同濃度鹽脅迫處理的狗尾草幼苗cDNA做模板，進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增片段電泳分析，擴(kuò)增曲線(xiàn)及溶解曲線(xiàn)綜合分析，結(jié)果表明登錄號(hào)Sevir.9G114100對(duì)應(yīng)的actin基因是8個(gè)actin基因中最合適的內(nèi)標(biāo)基因。并對(duì)所選內(nèi)標(biāo)的實(shí)用性進(jìn)行了驗(yàn)證，驗(yàn)證的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的結(jié)果保持一致，證明所選內(nèi)標(biāo)基因可用于后續(xù)狗尾草響應(yīng)不同干旱及鹽脅迫狗尾草轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)的驗(yàn)證工作，為深入研究狗尾草功能基因奠定分子基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞? 狗尾草;actin基因;干旱脅迫;鹽脅迫;熒光定量PCR

中圖分類(lèi)號(hào)? S544+.3? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

Internal Reference Gene Actin of Setaria viridis and Its Application in Response to Different Drought and Salt Stress

ZHANG Lili， ZHAO Hui， GUO Jingyuan， XIA Qiyu， HE Pingping， HUO Shanshan， QU Jing， FU Dongmei， GUO Anping*

Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of

Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Biosafety Monitoring and Molecular Breeding in Off-Season Reproduction Regions， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract? In order to study the internal reference genes applied to the expression of different drought and salt stress genes in S. viridis， the cDNA sequence of 8 actin genes of S. viridis （accession A10.1） was obtained from https：//phytozome.jgi.doe. gov/pz/portal.html. The primers for real time PCR were designed， and the templates of cDNA for the seedlings of S. viridis treated with different concentrations of drought and salt stress were used. Through the amplification fragment electrophoresis analysis， amplification curve and dissolution curve comprehensive analysis of RT-PCR， the results indicated that the actin gene corresponding to accession number Sevir.9G114100 was the most suitable internal standard gene among the eight actin genes. The practicability of the selected internal standard gene was verified. The results of the verification were consistent with the results of the transcriptome data， suggesting that the selected internal standard gene could be used in the verify experiments of S. viridis gene expression response to different drought and salt stress， giving a molecular base for further study of the functional gene of S. viridis.

Keywords? Setaria viridis; actin gene; drought stress; salt stress; RT-PCR

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.015

狗尾草（Setaria viridis）屬于單子葉植物綱禾本科黍亞科狗尾草屬，黍亞科一般常分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，該科植物具有熱帶植物的典型特征，高粱、甘蔗、玉米、谷子等都屬于黍亞科。擬南芥是典型的雙子葉模式植物，對(duì)擬南芥基因分子機(jī)理的研究，為改良農(nóng)作物、穩(wěn)定和提高糧食產(chǎn)量奠定了理論基礎(chǔ)。但由于在實(shí)際的應(yīng)用中，許多糧食作物比如玉米、水稻等是禾本科的單子葉植物，而擬南芥為雙子葉植物，與上述糧食作物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?？茖W(xué)家把水稻作為禾本科的模式生物。因?yàn)樗颈旧韺儆诤瘫究?，又是重要的糧食作物，具有基因組小、易于轉(zhuǎn)化等諸多優(yōu)點(diǎn)，但是，水稻作為模式植物也有其先天的缺點(diǎn)。水稻的生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境溫度的要求比較嚴(yán)格。并且在北方，每年只能種一季。因此急需一種生長(zhǎng)周期短的新型禾本科模式植物[1]。而狗尾草幾乎符合作為一種模式植物的所有要求：植株矮小、容易種植、能產(chǎn)生大量的自交系種子、基因組小、二倍體、生長(zhǎng)周期短、容易誘變、容易轉(zhuǎn)化，是非常優(yōu)良的單子葉模式植物[2-3]，另外，狗尾草是C4植物，具有C4光合作用系統(tǒng)，在研究C4植物的光合作用機(jī)理方面，具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)[4-5]。狗尾草和許多禾本科農(nóng)作物，如谷子、玉米等，具有較近的親緣關(guān)系，它們的基因功能應(yīng)該具有較高的保守性。狗尾草對(duì)非生物脅迫耐受能力強(qiáng)，抗性基因豐富，是研究耐旱、耐熱、耐鹽等脅迫反應(yīng)的重要模式植物[6]。

有研究人員以狗尾草為模式植物，通過(guò)NMU（N-Nitroso-N-methylurea）誘變，篩選到了一個(gè)花絮稀疏的突變體。通過(guò)BSA （bulk segregant analysis）重測(cè)序方法，鑒定到了突變基因;玉米中的同源基因突變后也表現(xiàn)出與狗尾草突變體相同的表型。這一研究充分證明了以狗尾草為模式植物進(jìn)行玉米基因組功能研究的可行性[7]。

研究植物基因的表達(dá)情況是植物分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)已成為研究基因表達(dá)量的重要方法，研究植物基因的表達(dá)時(shí)需要選一個(gè)高度保守并且表達(dá)穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參。由于常用的內(nèi)參基因存在不穩(wěn)定性，因此根據(jù)具體的試驗(yàn)條件篩選穩(wěn)定合適的內(nèi)參基因極為重要。肌動(dòng)蛋白基因（actin）編碼的肌動(dòng)蛋白是真核生物細(xì)胞中一種普遍存在的組成型表達(dá)的看家基因，它參與細(xì)胞分裂、形態(tài)維持、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)等多種重要生理活動(dòng)[8-11]，除了有基因序列高度保守的特征外，還具有mRNA表達(dá)數(shù)量高，數(shù)量穩(wěn)定等特性，是用于基因表達(dá)分析的理想內(nèi)參基因[12-13]。目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用于研究狗尾草響應(yīng)不同干旱及鹽脅迫基因表達(dá)的內(nèi)參基因。本研究旨在狗尾草8個(gè)actin基因中篩選出一個(gè)表達(dá)最穩(wěn)定的用于后續(xù)對(duì)狗尾草響應(yīng)不同干旱及鹽脅迫基因表達(dá)的驗(yàn)證工作，也方便之后進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)得到更為精確可靠的結(jié)果，為深入研究狗尾草功能基因奠定分子基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

植物材料為已測(cè)序完成的狗尾草A10品系，材料由美國(guó)Donald Danforth Plant Science Center的Thomas P. Brutnell 實(shí)驗(yàn)室提供，以A10品系經(jīng)休眠處理的成熟種子為試驗(yàn)材料，研究適應(yīng)于模式植物狗尾草響應(yīng)不同干旱及鹽脅迫表達(dá)的內(nèi)參基因actin及其應(yīng)用。

1.2? 引物

本研究從網(wǎng)站https：//phytozome.jgi.doe.gov/ pz/portal.html上獲得狗尾草A10品系的8個(gè)actin基因及需要驗(yàn)證的2個(gè)目的基因的cDNA序列，然后用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，引物序列如表1所示。

1.3? 方法

1.3.1? 對(duì)狗尾草幼苗進(jìn)行干旱和鹽脅迫處理? 甘露醇模擬干旱脅迫處理培養(yǎng)基配制：1/2MS培養(yǎng)基，10 g蔗糖，pH 5.8，Gelzan植物凝膠4 g，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)分別添加甘露醇，甘露醇的濃度梯度為0、100、200、300、400 mmol/L 5個(gè)梯度。NaCl鹽脅迫處理培養(yǎng)基配制：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)分別添加NaCl，NaCl的濃度為0、40、80、120、160 mmol/L 5個(gè)梯度。

將狗尾草種子播種至上述培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件參照文獻(xiàn)執(zhí)行[14-15]。在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)一周后分別取樣0.2 g，在液氮中冷凍之后于70 ℃保存。

1.3.2? 干旱及鹽脅迫處理的狗尾草株系總RNA的提取及cDNA的合成? 取上一步試驗(yàn)中干旱及鹽脅迫處理的試驗(yàn)材料，用QIAGEN plant RNA

Kit試劑盒來(lái)提取狗尾草的總RNA。然后用Fermentas的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將上面提取的RNA為模板合成cDNA的第1條鏈。

1.3.3? 熒光定量PCR驗(yàn)證? 熒光定量PCR 反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq（2×）12.5 μL，Rox reference DyeⅡ（50×）0.5 μL，引物actin-F（10 pmol/L）和actin-R（10 pmol/L）各1 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 9.0 μL反應(yīng)體系總體積為25 μL。熒光定量PCR的引物序列如表1所示，以狗尾草看家基因actin為內(nèi)參。

熒光定量PCR程序?yàn)?4 ℃，3 min;94 ℃，15 s;60 ℃，30 s;72 ℃，35 s;共40個(gè)循環(huán)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 狗尾草幼苗在干旱和鹽脅迫處理下的生長(zhǎng)情況

狗尾草幼苗在干旱和鹽脅迫處理下第7天的生長(zhǎng)情況如圖1A和圖1B所示，從圖1中可以看出，隨著干旱和鹽脅迫濃度的加大，狗尾草幼苗的發(fā)芽率逐漸降低，長(zhǎng)勢(shì)越來(lái)越弱。

a1～e1 的甘露醇濃度梯度分別為0、100、200、300、400 mmol/L;a2～e2 的氯化鈉濃度梯度分別為0、40、80、120、160 mmol/L。

Mannitol concentration gradients of a1–e1 were 0， 100， 200， 300 and 400 mmol/L， respectively. NaCl concentration gradients of a2–e2 were 0， 40， 80， 120 and 160 mmol/L， respectively.

2.2? 肌動(dòng)蛋白基因actin的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)與產(chǎn)物特異性、通用性驗(yàn)證

用狗尾草8個(gè)肌動(dòng)蛋白基因，根據(jù)各自的引物（表1）分別進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，PCR擴(kuò)增片段電泳分析如圖2所示，從圖4中可以看出，5～8號(hào)泳道條帶單一且清晰，并且片段大小與預(yù)期一致。從電泳結(jié)果可以看出5～8號(hào)泳道對(duì)應(yīng)的基因更適宜做熒光定量的內(nèi)標(biāo)基因。

從狗尾草8個(gè)肌動(dòng)蛋白基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)（圖3）中可以看出，4、5和7號(hào)泳道對(duì)應(yīng)的基因Ct值較低，所謂Ct值，就是最先

出現(xiàn)超過(guò)閾值信號(hào)的循環(huán)數(shù)，或者說(shuō)是到了第幾個(gè)循環(huán)才出現(xiàn)超過(guò)閾值的信號(hào)。C代表的是cycle（循環(huán)數(shù)目），t代表的是threshold（閾值）。所以表達(dá)量越少的話(huà)，需要越多的循環(huán)才能擴(kuò)增出來(lái)。也就是Ct值越高。因此4，5和7號(hào)泳道對(duì)應(yīng)的基因更適宜做熒光定量的內(nèi)標(biāo)基因。

從狗尾草8個(gè)肌動(dòng)蛋白基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的溶解曲線(xiàn)（圖4）中可以看出，1、3、4、6、7、8號(hào)基因?qū)?yīng)的溶解曲線(xiàn)均為單峰，說(shuō)明其對(duì)應(yīng)引物的特異性強(qiáng)。其中峰值高則說(shuō)明PCR擴(kuò)增效率好，從圖4中可以看出，7號(hào)基因（Sevir.9G 114100）對(duì)應(yīng)的溶解曲線(xiàn)峰值單一，曲線(xiàn)平滑且峰值最高。

綜上所述，登錄號(hào)Sevir.9G114100對(duì)應(yīng)的actin基因是8個(gè)actin基因中最合適的內(nèi)標(biāo)基因。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該基因在狗尾草響應(yīng)不同干旱及鹽脅迫時(shí)的表達(dá)穩(wěn)定性，做了該基因在9個(gè)不同處理?xiàng)l件下的分析檢測(cè)。

用肌動(dòng)蛋白基因actin（Sevir.9G114100）的PCR引物對(duì)9個(gè)不同處理?xiàng)l件下的狗尾草進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如圖5A所示，肌動(dòng)蛋白基因actin的引物在PCR擴(kuò)增時(shí)只擴(kuò)增出一個(gè)條帶，并且在不同處理?xiàng)l件下的狗尾草均能擴(kuò)增出同一條帶，大小為315 bp，與預(yù)期PCR片段長(zhǎng)度一致，符合基因組內(nèi)標(biāo)基因特異性和通用性原則。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）結(jié)果如圖5B所示，Sevir.9G114100基因在9個(gè)不同處理?xiàng)l件下的TPM（Transcript Per Million）值在5%水平上沒(méi)有顯著差異，符合作為內(nèi)標(biāo)基因在各個(gè)處理階段表達(dá)水平保持基本一致的標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 溶解曲線(xiàn)的分析實(shí)質(zhì)上是產(chǎn)物的特異性分析。如果溶解曲線(xiàn)為單峰說(shuō)明引物的特異性強(qiáng)，峰值高說(shuō)明PCR擴(kuò)增效率好。肌動(dòng)蛋白基因actin（Sevir.9G114100）在響應(yīng)不同程度干旱及鹽脅迫時(shí)的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 溶解曲線(xiàn)均為單峰（圖6），且與其他7個(gè)actin（圖4）相比峰值均較高，說(shuō)明引物特異性強(qiáng)，PCR擴(kuò)增效率好。

M：DNA分子標(biāo)準(zhǔn)DL2000;泳道1～9依次為：未作任何處理、100 mmol/L甘露醇處理、200 mmol/L甘露醇處理、300 mmol/L甘露醇處理、400 mmol/L甘露醇處理、40 mmol/L氯化鈉處理、80 mmol/L 氯化鈉處理、120 mmol/L 氯化鈉處理、160 mmol/L 氯化鈉處理。圖B中標(biāo)有相同小寫(xiě)字母者表示組間差異不顯著（P>0.05）。

M： DL2000 marker; The corresponding cDNA template for 1–9 was followed by untreated Setaria viridis， 100 mmol/L mannitol-treated， 200 mmol/L mannitol-treated， 300 mmol/L mannitol-treated， 400 mmol/L mannitol-treated， 40 mmol/L sodium chloride-treated， 80 mmol/L sodium chloride-treated， 120 mmol/L sodium chloride-treated and 160 mmol/L sodium chloride-treated Setaria viridis. The data in the figure B with the same lowercase letters indicate no significant difference between groups （P>0.05）.

從上述實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物擴(kuò)增條帶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR溶解曲線(xiàn)分析結(jié)果可以看出，肌動(dòng)蛋白基因actin（Sevir.9G114100）具備作為狗尾草基因組響應(yīng)不同干旱及鹽脅迫條件下的基因表達(dá)內(nèi)標(biāo)基因的特點(diǎn)，利用本研究所述PCR引物序列及擴(kuò)增方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)狗尾草響應(yīng)不同干旱及鹽脅迫條件下目的基因的相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)。

2.3? 狗尾草響應(yīng)不同干旱及鹽脅迫時(shí)RNA- seq篩選基因結(jié)果驗(yàn)證

為了驗(yàn)證所選內(nèi)標(biāo)基因actin（Sevir.9G 114100）的實(shí)用性，我們對(duì)狗尾草響應(yīng)不同干旱及鹽脅迫時(shí)的RNA-Seq結(jié)果所篩選到的目的基因任選2個(gè)Sevir.1G249200和Sevir.J003400進(jìn)行9種不同處理?xiàng)l件下的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖7A、圖7B所示，圖7A和圖7B代表通

過(guò)RNA-Seq篩選的需要驗(yàn)證的目的基因，引物如表1所示。驗(yàn)證的結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果圖7C和圖7D保持一致。證明所選的actin內(nèi)標(biāo)基因適用于狗尾草響應(yīng)不同干旱及鹽脅迫時(shí)的基因表達(dá)驗(yàn)證工作。

1～9對(duì)應(yīng)的cDNA模板依次為未作任何處理、100 mmol/L甘露醇處理、200 mmol/L甘露醇處理、300 mmol/L甘露醇處理、400 mmol/L 甘露醇處理、40 mmol/L氯化鈉處理、80 mmol/L氯化鈉處理、120 mmol/L氯化鈉處理、160 mmol/L氯化鈉處理的狗尾草;A和B分別代表基因Sevir.1G249200和Sevir.J003400在9種不同處理?xiàng)l件下的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證;C和D分別代表基因Sevir.1G249200和Sevir.J003400在9種不同處理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗(yàn)證。

The corresponding cDNA template for 1–9 was followed by untreated Setaria viridis， 100 mmol/L mannitol-treated， 200 mmol/L mannitol-treated， 300 mmol/L mannitol-treated， 400 mmol/L mannitol-treated， 40 mmol/L sodium chloride-treated， 80 mmol/L sodium chloride-treated， 120 mmol/L sodium chloride-treated， 160 mmol/L sodium chloride-treated Setaria viridis; A and B represent the real-time PCR of Sevir.1G249200 and Sevir.J003400 under 9 different treatment conditions; C and D represent the transcriptome data validation of Sevir.1G249200 and Sevir.J003400， respectively， in 9 different treatment conditions.

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