葉凌赟 王林紅 張文濤 趙文妍

[摘要] 目的 探討 PDLSCs細胞膜片與納米級B-TCP復(fù)合疊層三維結(jié)構(gòu)對牙槽骨缺損的相關(guān)修復(fù)及治療作用。 方法 分離及培養(yǎng)牙周膜干細胞，制備牙周膜干細胞生物膜片，構(gòu)建PDLSCs細胞膜片與納米級B-TCP復(fù)合疊層三維結(jié)構(gòu)模型，將其植入新西蘭兔缺損骨模型內(nèi)，于術(shù)后第4周、第8周、第12周處死新西蘭兔并分離牙周組織，通過形態(tài)學(xué)分析評判修復(fù)效果。 結(jié)果 WB結(jié)果示，Runx2、ALP蛋白的表達量比對照組分別增加9.2倍和4.3倍;移植后第8周，蘇木精-伊紅染色示PDLSCs細胞膜片與納米級B-TCP復(fù)合疊層三維復(fù)合結(jié)構(gòu)組新骨形成的百分比顯著高于對照組及空白對照組（P<0.05）;免疫組化染色示構(gòu)建PDLSCs細胞膜片與納米級B-TCP復(fù)合疊層三維復(fù)合結(jié)構(gòu)組成骨相關(guān)標(biāo)志物OCN、ALP、Runx2蛋白表達高于對照組及空白對照組（P<0.05）。 結(jié)論 牙周膜干細胞膜片與B-TCP三維疊層結(jié)構(gòu)復(fù)合結(jié)構(gòu)可促進兔牙槽骨缺損部位的修復(fù)及再生，為臨床牙槽骨缺損的治療提供一種新的思路，有廣闊的應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞] 牙周膜干細胞;B-TCP;成骨標(biāo)志物;牙槽骨修復(fù)

[中圖分類號] R783.5? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）33-0071-04

[Abstract] Objective To investigate the repair and treatment effects of PDLSCs membrane and nano-scale B-TCP composite laminated three-dimensional structure for alveolar bone defects. Methods The periodontal ligament stem cells were isolated and cultured to prepare the biomembranes of periodontal ligament stem cells. The composite laminated three-dimensional structure model of PDLSCs membrane and nano-scale B-TCP was constructed and implanted into the New Zealand rabbit defect bone model. The New Zealand rabbits were sacrificed and the periodontal tissues were isolated in the 4th week， 8th week and 12th week after surgery. The repair effect was evaluated by morphological analysis. Results WB results showed that the expression levels of Runx2 protein and ALP protein were 9.2 times and 4.3 times higher than those in the control group. In the 8th week after transplantation， hematoxylin-eosin staining showed that the percentage of new bone formation in the PDLSCs membrane and nano-scale B-TCP composite laminated three-dimensional structure group was significantly higher than that in the control group and the blank control group（P<0.05）. Immunohistochemical staining showed that expression levels of the ossification related markers such as OCN， ALP and Runx2 in the PDLSCs membrane and nano-scale B-TCP composite laminated three-dimensional structure group were higher than those in the control group and the blank control group（P<0.05）. Conclusion Periodontal ligament stem cells membrane and nano-scale B-TCP composite laminated three-dimensional structure can promote the repair and regeneration of rabbit periodontal bone defect， which provides a new idea for the treatment of clinical alveolar bone defect and has a wide application prospect.

[Key words] Periodontal ligament stem cells; B-TCP; Osteogenic markers; Alveolar bone repair

先天的畸形、外傷、牙周病及腫瘤導(dǎo)致口腔及頜面部骨組織缺損是臨床上較復(fù)雜的一類疾病[1]。最常見的骨缺損主要是牙周病所致，這部分患者因骨量不足需植骨后方可進行治療[2-4]。骨組織缺損的修復(fù)是當(dāng)前研究熱點，臨床主要通過相關(guān)骨移植材料的植入，從而促進新骨形成[5]。

牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）作為來源于牙齒的間充質(zhì)干細胞，體外培養(yǎng)時可多向分化為牙周組織相關(guān)性細胞[6]，且將細胞凍存后相關(guān)性狀也不會出現(xiàn)較大改變[7]，故牙周膜干細胞被認為是牙周組織工程中首選的種子細胞。楊斯惠等[8]將牙周膜干細胞移植入小型豬缺損的牙周骨模型，證實其可有效提高骨缺損組織的再生及愈合。

合適的支架配合種子細胞，才能使細胞快速生長繁殖[9]。細胞膜片技術(shù)相對完整地保存了細胞外基質(zhì)，在犬類動物體內(nèi)也顯示出了一定的牙周組織再生能力[10]。故被廣泛應(yīng)用于骨組織等相關(guān)組織的再生中。B-磷酸三鈣（B-trical-cium phosphate，B-TCP）有良好生物降解性，骨組織填充在有機物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，較好地補充了細胞膜片不能承受應(yīng)力的缺點[11-14]，故本研究創(chuàng)新性地構(gòu)建PDLSCs細胞膜片于納米級B-TCP復(fù)合疊層三維結(jié)構(gòu)中，探討其對牙槽骨缺損的相關(guān)修復(fù)及治療作用，為人體牙周膜干細胞在牙槽骨缺損的修復(fù)及應(yīng)用中提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

隨機對照動物實驗。于2016年4月～2018年6月在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室完成。

1.2 所需材料

1.2.1 實驗動物? 健康3月齡SPF級新西蘭兔9只，體重2.4～2.7 kg，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2.2 主要試劑及儀器? DMEM、胰蛋白酶、青霉素、胎牛血清、茜素紅、倒置熒光顯微鏡（Sigma公司）;圓片狀B-磷酸三鈣生物陶瓷（B-TCP）（上海貝奧路生物材料有限公司）;蛋白檢測系統(tǒng)（Bio-Rad公司）;ALP、OCN、Runx2一抗、B-actin一抗、山羊抗兔二抗、蘇木精-以紅染色試劑盒（Abcam 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 牙周膜干細胞培養(yǎng)、PDLSCs膜片制備、成骨分化? 將成年健康的雄性新西蘭兔磨牙拔除，PBS沖洗后，刮取牙根終端1/3處的牙周膜組織，參照參考文獻[8]的方法來進行牙周膜干細胞的培養(yǎng)，用胰酶將第三代牙周膜干細胞消化，再制成單細胞懸液，調(diào)整其密度至5×105/mL，再將細胞接種至100 mL培養(yǎng)皿，添加10 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)液（內(nèi)含VC、谷氨酰胺、青霉素、胎牛血清等），每2天換一次液，培養(yǎng)12～14 d后，繼續(xù)觀察膜片成熟的過程。如果在底面出現(xiàn)白色的膜樣物質(zhì)，邊緣褶皺，則說明PDLSCs膜片已經(jīng)形成。

1.3.2 PDLSCs膜片與B-TCP三維疊層結(jié)構(gòu)復(fù)合結(jié)構(gòu)構(gòu)建? PDLSCs膜片與圓片狀的B-TCP三維疊層結(jié)構(gòu)復(fù)合形成三維立體結(jié)構(gòu)，進行體外細胞的培養(yǎng)。

1.3.3 茜素紅染色觀察結(jié)節(jié)情況? 選擇不同的時段進行茜素紅染色，主要用來觀察鈣化的結(jié)節(jié)是否形成及其具體情況，用多聚甲醛將細胞固定，后用40 mmol/L的茜素紅染料對細胞進行染色，室溫下放置6～10 min，觀察并拍照。

1.3.4 WB檢測Runx2及ALP蛋白的表達? 將對照組及成骨誘導(dǎo)組細胞內(nèi)的總蛋白提取出來以后，再檢測蛋白的具體濃度。然后再取出20 μg的總蛋白行PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏二乙烯膜上以后，用含有10%的脫脂奶粉加上TBST，封閉2 h后，再加入（1：10000）的一抗ALP、Runx2及1：20000的B-actin，4℃過夜后加入二抗，通過計算目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值之比，從而判斷出所測的目標(biāo)蛋白具體表達水平。

1.3.5 免疫熒光染色檢測角蛋白、波形絲蛋白及STRO-1表達? 如發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)PDLSCs角蛋白陰性，波形絲蛋白陽性，則說明克隆的細胞是間充質(zhì)干細胞，并且沒有被來源于外胚層的細胞所污染。若熒光染色STRO-1表達為陽性，說明細胞有干細胞特性。

1.3.6? PDLSCs膜片與B-TCP三維疊層結(jié)構(gòu)復(fù)合結(jié)構(gòu)的動物模型制備? 雄性新西蘭兔動物模型制備：9只健康成年雄性新西蘭兔，3%戊巴比妥1 mL/kg經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉后，固定于手術(shù)臺，消毒后制備直徑為10 mm、深5 mm的骨缺損3個。前孔為空白對照組，中間填入PDLSCs細胞膜片作為對照組，后孔填入PDLSCs與B-TCP三維疊層結(jié)構(gòu)復(fù)合結(jié)構(gòu)作為實驗組?？p合黏膜后常規(guī)肌注青霉素鈉40萬U，每天2次，共3 d，以防感染。

1.3.7 標(biāo)本采集和組織學(xué)相關(guān)分析? 術(shù)后隨機分成三組，每組3只，分別于第4、8、12周各處死一組動物，切取標(biāo)本。每組所有新西蘭兔麻醉后，用200 mL生理鹽水及400 mL多聚甲醛固定24 h，加入19%乙二四乙酸脫鈣，置于室溫下4周，每3天進行一次脫鈣液的更換，然后用不同濃度的乙醇脫水，石蠟進行包埋2 h，再切成薄度約3 μm的切片，放入62℃的烤箱內(nèi)20 min，然后行蘇木精-伊紅染色或者免疫組織化學(xué)進行染色。

蘇木精-伊紅染色主要是用來分析兔牙槽缺損區(qū)的具體組織形態(tài)學(xué)狀況。倒置顯微鏡拍攝、分析后，再對新骨形成的百分比進行計算，計算公式為新生骨面積/總?cè)睋p面積×100%。

免疫組織化學(xué)染色主要是用來分析牙周膜干細胞對骨再生方面的作用，倒置顯微鏡拍攝，分析后對Runx2、OCN、ALP的表達量進行測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS21.0進行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牙周膜干細胞的形態(tài)及成骨的誘導(dǎo)活性

茜素紅染色結(jié)果表明，成骨進行誘導(dǎo)，14 d后牙周膜干細胞就可以形成鈣化性的結(jié)節(jié)。WB結(jié)果顯示，Runx2、ALP蛋白的表達量比對照組分別增加9.2倍和4.3倍。見圖1。

2.2 新生骨組織形態(tài)學(xué)比較

為了檢測骨缺損的骨再生，分別于術(shù)后第4、8、12周各處死一組動物，切取兔牙周骨的標(biāo)本，蘇木精-伊紅進行染色，相關(guān)的組織形態(tài)學(xué)進行測量，對兔骨缺損的部位進行分析，見圖2。第4周，三組新西蘭兔新骨形成的百分比顯示，差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;第8周時，PDLSCs膜片與B-TCP三維疊層結(jié)構(gòu)復(fù)合結(jié)構(gòu)組（實驗組）新骨形成的百分比顯著高于空白對照組和對照組（P<0.05）;第12周時，三組兔的愈合程度較好，新骨形成的百分比差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 對ALP、Runx2及OCN免疫組化染色評價牙周膜干細胞對牙周組織再生作用

Runx2為成骨早期的標(biāo)志物，第4周和第8周實驗組和空白對照組及對照組相比，PDLSCs膜片與B-TCP三維疊層結(jié)構(gòu)復(fù)合組Runx2陽性表達增強顯著（P<0.01），見圖3。第12周時三組陽性細胞數(shù)表達量均較少。

ALP為成骨早期的標(biāo)志物，第4周，和其他兩組相比，PDLSCs膜片與B-TCP三維疊層結(jié)構(gòu)復(fù)合組（實驗組）ALP陽性表達增強顯著（P<0.01），見圖4。第8周，PDLSCs膜片與B-TCP三維疊層結(jié)構(gòu)復(fù)合組（實驗組）ALP表達高于空白對照組，但實驗組與對照組相比，無顯著性差異。到第12周時三組的陽性細胞表達量均較少。

OCN為成骨晚期的標(biāo)志物，隨時間延長，OCN表達漸增高。第4周時，三組間OCN陽性細胞表達量較少，組間無顯著差異（P>0.05），第8周及12周時，實驗組OCN顯著高于另外兩組（P<0.05）。見圖5。

3 討論

為了研究牙周膜干細胞在牙周組織中再生作用的應(yīng)用，本研究將牙周膜干細胞膜片與B-TCP三維疊層結(jié)構(gòu)復(fù)合，制造新西蘭兔牙槽骨缺損模型，將其植入骨缺損模型內(nèi)，用于體內(nèi)移植的研究。

PDLSCs因無支架降解的殘余毒性及炎癥反應(yīng)、細胞外基質(zhì)良好的抗張能力、細胞膜片良好的可塑性以及可分泌自分泌細胞生長因子等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于缺損修復(fù)。該研究的體外實驗研究結(jié)果顯示，牙周膜干細胞誘導(dǎo)成骨分化，2周以后即出現(xiàn)極其顯著的鈣化性結(jié)節(jié)，使用茜素紅進行染色，結(jié)果顯示為陽性，早期骨形成的相關(guān)基因，如ALP、Runx2在成骨誘導(dǎo)以后也有所提高，均說明牙周膜干細胞可以作為牙槽骨缺損修復(fù)的種子細胞。

但是因為牙周組織的結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，具有牙周膜軟組織及牙骨質(zhì)的硬組織，傳統(tǒng)的PDLSCs不能抗各種形式的應(yīng)力，故單純的牙周膜干細胞膜片較難達到穩(wěn)定完整的牙周復(fù)合體再生。本課題組創(chuàng)新性地構(gòu)建PDLSCs細胞膜片與納米級B-TCP復(fù)合疊層三維結(jié)構(gòu)，旨在檢測該復(fù)合材料的成骨作用。研究表明，納米相陶瓷支架可以作為成骨細胞載體促進骨生成[15-18]。本研究將納米級B-TCP復(fù)合疊層作為載體，構(gòu)建牙周膜干細胞膜片及納米級B-TCP復(fù)合疊層三維結(jié)構(gòu)，將其移植進所造的兔牙槽骨缺損模型，繼續(xù)觀察其促骨修復(fù)的作用。

成骨細胞作為較為重要的功能性細胞，在骨質(zhì)的生長以及骨量的平衡和維持中發(fā)揮著較為顯著的作用。成骨細胞的發(fā)育主要分為增殖及基質(zhì)形成、成熟和礦化這三個階段。相關(guān)基因表達在其調(diào)節(jié)和控制中起著比較重要的作用。ALP作為成骨分化的標(biāo)志性基因，主要表達于干細胞或者成骨前體細胞的分化早期。Runx2作為特異性的轉(zhuǎn)錄因子，分化早期即有一定量的表達，從而起到調(diào)節(jié)和控制其他相關(guān)成骨基因表達的作用。本研究免疫組化顯示，牙周膜干細胞膜片與B-TCP三維疊層結(jié)構(gòu)復(fù)合組在第4周時Runx2及ALP蛋白表達均顯著高于空白對照組及對照組，說明牙周膜干細胞在早期就有促骨分化及成骨形成的作用。OCN作為骨的基質(zhì)性蛋白，被廣泛視為骨形成晚期的特異性標(biāo)記物。本研究顯示，移植后第8周和12周，牙周膜干細胞膜片與B-TCP三維疊層結(jié)構(gòu)復(fù)合組內(nèi)OCN表達顯著比對照組及空白對照組高，說明牙周膜干細胞膜片及其復(fù)合結(jié)構(gòu)可在骨形成的晚期促進骨缺損部位的生長及發(fā)育[19-20]。

綜上，移植后的牙周膜干細胞膜片與B-TCP三維疊層結(jié)構(gòu)復(fù)合結(jié)構(gòu)可促進兔牙槽骨缺損部位的修復(fù)及再生，牙周膜干細胞可作為牙周組織中骨缺損的種子細胞，對其進行修復(fù)，為臨床牙槽骨缺損的治療提供一種新的思路，有廣闊的應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2019-07-30）