王榮躍 魯文潔 邱海凡 戴芬

[摘要] 目的 探討智力障礙相關(guān)基因Cdk13對(duì)神經(jīng)軸突伸長(zhǎng)的影響。 方法 通過基因敲除模型、質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染等方法，熒光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元軸突的形態(tài)，觀察軸突伸長(zhǎng)的變化。 結(jié)果 Cdk12和Cdk13在神經(jīng)系統(tǒng)中有表達(dá)，在敲除Cdk12和Cdk13后軸突長(zhǎng)度比對(duì)照組減少，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），敲除Cdk12和Cdk13基因后Cdk5 mRNA水平降低。 結(jié)論 Cdk13和Cdk12的表達(dá)對(duì)神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)至關(guān)重要，其失活會(huì)引起神經(jīng)元軸突形態(tài)異常，可能是導(dǎo)致智力障礙的病理機(jī)制。

[關(guān)鍵詞] 智力障礙;Cdk13;Cdk12;神經(jīng)元;軸突伸長(zhǎng)

[中圖分類號(hào)] R446.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）33-0043-03

[Abstract] Objective To investigate the effect of mental retardation related gene Cdk13 on the axon elongation of neurons. Methods The gene knockout model， plasmid cell transfection and other methods as well as the fluorescence confocal microscopic imaging technique were used to detect the morphology of neuron axons and observe the changes of axon elongation. Results Cdk12 and Cdk13 were expressed in the nervous system. After knocking out Cdk12 and Cdk13， the length of axon was decreased compared with the control group， with statistically significant difference（P<0.05）. The Cdk5 mRNA level was decreased after knocking out Cdk12 and Cdk13 genes. Conclusion The expression of Cdk13 and Cdk12 is critical for the growth of neuronal axons and their inactivation leads to abnormal morphology of neuron axons， which may be the pathological mechanism leading to mental retardation.

[Key words] Mental retardation; Cdk13; Cdk12; Neuron; Axonal elongation

智力障礙（Mental retardation）是由多種因素引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為智力低于同齡小孩水平，并伴有社會(huì)適應(yīng)能力缺陷的一組疾病[1，2]。發(fā)病率高，全世界發(fā)病率為1%～3%[3]。隨著研究的深入，遺傳因素占的比重越來越高，包括染色體病、基因組病、單基因病或多基因突變等。目前已知Cdk13（cyclin-dependent kinase-13）與非綜合征型發(fā)育遲緩相關(guān)的遺傳基因[4，5]。Wang R等[6]在前期研究發(fā)現(xiàn)Cdk13基因缺失會(huì)導(dǎo)致智力低下，但是其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。

蛋白激酶是一種能影響細(xì)胞周期、分化、代謝、細(xì)胞死亡和各種其他關(guān)鍵細(xì)胞過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Cdk12和Cdk13具有92%的同一性的蛋白激酶結(jié)構(gòu)，并且已知與細(xì)胞周期蛋白L和細(xì)胞周期蛋白K相互作用[7]。在分子水平上，它們能夠促進(jìn)具有許多外顯子的長(zhǎng)基因的轉(zhuǎn)錄，并參與mRNA選擇性剪接。在細(xì)胞水平，Cdk12和Cdk13能夠在胚胎干細(xì)胞中維持自我更新[8]。本研究深入探討了Cdk12和Cdk13異常對(duì)神經(jīng)元軸突伸長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑

C57BL/6小鼠以及載體構(gòu)建購自廣州賽業(yè)科技生物公司。靶向敲除Cdk12和Cdk13小鼠均由廣州賽業(yè)科技生物公司合成。抗小鼠Cdk13的寡核苷酸合成序列以及克隆到載體中已獲得pCdk13-s，pCdk-i2和pCdk13-i1，小鼠Cdk5激活劑，p53通過PCR擴(kuò)增，所有構(gòu)建體通過限制性內(nèi)切酶測(cè)序。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

P19細(xì)胞購自于武漢博士德生物技術(shù)公司，脂質(zhì)體Lipofectamine3000購自Invitrogen公司。P19細(xì)胞于10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后，施用8 μg/mL嘌呤霉素7 h以選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后32 h，將培養(yǎng)基更換為含有1%血清的MEM。在轉(zhuǎn)染后80 h收獲細(xì)胞用于免疫細(xì)胞化學(xué)，RNA提取或蛋白質(zhì)提取。轉(zhuǎn)染后48 h收獲細(xì)胞用于蛋白質(zhì)提取。

1.3 免疫熒光和神經(jīng)軸突計(jì)數(shù)

將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min，并用37℃ PBS清洗，0.1% Triton X-100通透20 min，用合適的一抗封閉樣品，然后用熒光二抗山羊抗小鼠抗體避光孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察照相。封固前加入DAPI（1 μg/mL）避光孵育5 min。具有TuJ-1陽性信號(hào)的細(xì)胞被認(rèn)為是分化的神經(jīng)元。軸突長(zhǎng)度采用Image J軟件進(jìn)行測(cè)量，采用最長(zhǎng)的分支神經(jīng)突長(zhǎng)度來代表細(xì)胞的神經(jīng)突向外生長(zhǎng)。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野內(nèi)選取5個(gè)最長(zhǎng)的軸突進(jìn)行測(cè)量，長(zhǎng)度單位為μm[9]。

1.4 蛋白質(zhì)印跡分析

將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌一次，并溶于放射免疫沉淀測(cè)定（RIPA）裂解緩沖液（20 mM HEPES，pH 7.8，150 mM NaCl，1mM EDTA，0.1%Triton X-100，50 mM NaF，1 mM二硫蘇糖醇）中和蛋白酶抑制劑雞尾酒）。通過兩次以14 000 rpm離心10 min清除細(xì)胞裂解物，并將上清液用于Western印跡分析。將等量的細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶封閉后，加入一抗4℃孵育過夜。洗滌膜并在室溫下與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗孵育1 h，用化學(xué)發(fā)光法將蛋白印跡曝光到膠片上。

1.5 RT-PCR測(cè)定

Tirzol法提取經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的至細(xì)胞培養(yǎng)第3天（DIV3）的神經(jīng)元RNA，用病毒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用Invitrogen公司的核酸提取試劑盒，擴(kuò)增用的引物和探針序列由Invitrogen公司合成。PCR擴(kuò)增引物由武漢博士德生物技術(shù)公司合成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cdk12和Cdk13在神經(jīng)發(fā)育系統(tǒng)中的表達(dá)

使用原位雜交和蛋白質(zhì)印跡來檢測(cè)Cdk12和Cdk13在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)模式。Cdk12 mRNA存在于E6.5胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞中，在E7～E7.5期間，Cdk12在所有細(xì)胞中表達(dá)，但在原條（PS）中表達(dá)更強(qiáng)。在E8.5和E9.5胚胎中，在前腦、中腦中檢測(cè)到更強(qiáng)的信號(hào)，Cdk13也普遍表達(dá)，但在所檢查的各種發(fā)展階段都沒有在心臟中表達(dá)。見封三圖4。

2.2 Cdk12或Cdk13對(duì)維持神經(jīng)軸突伸長(zhǎng)的作用

在體外培養(yǎng)3 d后，在Cdk12和Cdk13耗盡的皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中，軸突的平均長(zhǎng)度減少[對(duì)照為（101.00±5.25）μm]，Cdk12耗盡細(xì)胞中軸突長(zhǎng)度為（42.00±3.30）μm，Cdk13耗盡細(xì)胞中軸突長(zhǎng)度為（41.00±2.05）μm（P<0.05）。見封三圖5。

2.3 Cdk5的表達(dá)受Cdk12和Cdk13的調(diào)控

發(fā)現(xiàn)Cdk12或Cdk13的敲減將Cdk5 mRNA水平降低至對(duì)照水平的約40%（圖1A），Cdk5蛋白表達(dá)也降低至對(duì)照組約50%（圖1B，C）（P<0.05），這表明Cdk12和Cdk13對(duì)Cdk5的調(diào)節(jié)主要作用在RNA水平。

3 討論

智力障礙嚴(yán)重危害社會(huì)生活，給家庭帶來災(zāi)難，而缺氧引起的腦神經(jīng)損傷是引起智力障礙的重要原因。然而臨床上尚無特效的治療方法，因此尋求新的治療策略具有重要的科學(xué)意義。Cdk13是最晚發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期依賴性激酶（Cyclin-dependent kinases，CDKs）家族成員，又名CDC2L5，普遍存在于人體組織中，目前研究比較少。其家族蛋白C端有一特殊結(jié)構(gòu)，20個(gè)ATP依賴的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)，可通過整合細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)循環(huán)和基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控功能。Cdk12和Cdk13具有較多的重復(fù)同源序列，最近發(fā)現(xiàn)其可能在轉(zhuǎn)錄和RNA加工過程中發(fā)揮重要作用[10]。人類Cdk13蛋白分子量較大，為165 kDa，Cdk13、Cdk12與周期蛋白Cyclin K結(jié)合形成蛋白復(fù)合物發(fā)揮生物學(xué)功能[11]。Cdk13主要定位于細(xì)胞核，尤其集中在存儲(chǔ)RNA剪接因子的核斑。Cdk13除了C端具有ATP依賴的蛋白激酶用于磷酸化RNA多聚酶Ⅱ，促使基因的轉(zhuǎn)錄和RNA的延伸外，還有三個(gè)功能域，用于參與CDK13與目標(biāo)蛋白的相互作用：一個(gè)是位于N端的包含200～435個(gè)氨基酸殘基的富絲氨酸-精氨酸（Serine-arginine Rich，SR）模體，此模體可促使Cdk13與SR蛋白家族成員相互作用，參與RNA加工和前提mRNA剪接的調(diào)控[12，13]。國(guó)外研究[14]同時(shí)報(bào)道Cdk13的錯(cuò)義變異會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)和語言發(fā)育遲緩、智力障礙。

本研究發(fā)現(xiàn)Cdk12和Cdk13有助于軸突生長(zhǎng)，同時(shí)在Cdk12或Cdk13耗盡后，培養(yǎng)的P19細(xì)胞和原代皮質(zhì)神經(jīng)元失去了將軸突延伸到更遠(yuǎn)距離的能力，軸突受Cdk12和Cdk13影響的一種蛋白質(zhì)是Cdk5，研究發(fā)現(xiàn)敲除Cdk12和Cdk13后Cdk5的mRNA含量降低，提示通過Cdk5調(diào)控軸突的伸長(zhǎng)（圖3）。其還參與了許多類似的生物學(xué)過程[15]。CDK12敲除后的小鼠表現(xiàn)小頭畸形，通過DNA損傷影響神經(jīng)細(xì)胞的改變，增加了自發(fā)凋亡[16]。非功能性CDK13敲除小鼠可表現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)損壞導(dǎo)致智力障礙[17]。Cdk12和Cdk13在維持小鼠胚胎干細(xì)胞的多能性方面發(fā)揮著不可或缺的作用[8]。Cdk12和Cdk13都參與RNA剪接調(diào)節(jié)[18]。Cdk12和Cdk13的表達(dá)發(fā)生在早期發(fā)育階段，比如在E6.5小鼠胚胎。Cdk12和Cdk13之間表達(dá)模式和功能的相似性詳見圖1。此外，Cdk13通過RNAPII的羧基末端結(jié)構(gòu)域的Ser2的磷酸化參與蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)[19]。CDK13能介入翻譯和mRNA進(jìn)程，從而在基因表達(dá)上發(fā)揮重要作用[20，21]。

最新研究[22]顯示，軸突結(jié)構(gòu)異常與遺傳性智力低下的學(xué)習(xí)障礙相關(guān)，常見的是21三體導(dǎo)致的Down綜合征，表現(xiàn)為智力低下，特殊面容，伴有心臟異常等。Cdk12和Cdk13的敲除不影響3DIV的SMI312陽性皮質(zhì)神經(jīng)元。這表明Cdk12和Cdk13都能夠調(diào)節(jié)軸突特異性微管組織，促進(jìn)神經(jīng)元軸突伸長(zhǎng)。然而，Cdk12和Cdk13產(chǎn)生這種差異效應(yīng)的潛在機(jī)制仍不清楚。Cdk12和/（或）Cdk13的沉默也可能導(dǎo)致異常的微管重塑和軸突中微管動(dòng)力學(xué)的變化。下游Cdk12和Cdk13底物蛋白是如何對(duì)軸突的長(zhǎng)度變化具體機(jī)制仍需要進(jìn)行更深入的研究。

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（收稿日期：2019-07-03）