涂 丹 張益奇 葉 繁 戴志遠(yuǎn)

(1浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江杭州 310035；2浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室，浙江杭州 310035)

目前，治療高血壓的化學(xué)合成降壓藥物有卡托普利、依那普利等，這些藥物的降血壓效果顯著，但需要長期服用，且有一定的副作用，如引起咳嗽、喪失味覺、腎臟損傷等[1-2]，因此，研發(fā)更加安全、高效的降壓藥物，對高血壓的預(yù)防和治療顯得尤為必要。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotension converting enzyme，ACE)是一種膜結(jié)合的含鋅二肽羧基肽酶。它能夠催化血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化成具有強烈血管收縮作用的血管緊張素Ⅱ，同時能使具有血管擴(kuò)張作用的緩激肽失活，導(dǎo)致血壓上升[3-5]。因此，通過抑制ACE的活性，減少血管緊張素Ⅱ的生成，能夠降低血壓。ACE抑制肽因具有與血管緊張素Ⅰ相似的結(jié)構(gòu)，能夠與ACE結(jié)合位點結(jié)合，競爭性抑制血管緊張素Ⅱ的合成，從而起到降低血壓的作用[6]。天然來源的ACE抑制肽因具有安全性高、易吸收、無副作用等特點，受到人們廣泛關(guān)注[7]。目前，酶法降解是制備ACE抑制肽的最主要的方式，酶解制得的ACE抑制肽因具有安全性高、毒副作用小且可長期使用而備受關(guān)注。

魚鱗是水產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生的廢棄物，占到魚體重的1%～5%，含有豐富的蛋白質(zhì)(約占魚鱗的50%～70%)，但并未得到很好的開發(fā)利用。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年廢棄的魚鱗達(dá)30萬t[8]，造成了極大的資源浪費和環(huán)境污染。目前，采用魚源蛋白制備ACE抑制肽的研究，多以魚皮為原料[9-10]，而以魚鱗為原料制備ACE抑制肽及其純化、結(jié)構(gòu)分析等方面也已經(jīng)開展了一系列工作。與魚皮相比，魚鱗結(jié)構(gòu)更為致密，其豐富的Ⅰ型膠原主要分布在魚鱗內(nèi)層，外層被羥基磷灰石覆蓋，這些抗性屏障使得魚鱗難以被降解，通常需要加大酶使用量(6%左右)[11-12]或延長酶解周期[13]制備膠原蛋白肽。故針對生物活性肽的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，以提高其制備效率，是一項有價值的工作。

熱處理通過改變魚鱗蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響其酶解進(jìn)程，因而也可能會改變蛋白酶酶解的最優(yōu)條件。前期研究發(fā)現(xiàn)121℃處理15 min可顯著提高魚鱗的酶解效率。為獲得更多ACE抑制肽，本研究以羅非魚魚鱗為原料，對魚鱗進(jìn)行適當(dāng)?shù)母邷仡A(yù)處理，以魚鱗酶解產(chǎn)物水解度和ACE抑制率為評價指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上對酶解工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗優(yōu)化，確定制備酶解魚鱗蛋白ACE抑制肽的最佳工藝條件，進(jìn)一步探究最優(yōu)酶解條件下制得的酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布情況，以期為深入開發(fā)魚鱗蛋白資源、利用魚鱗制備膠原蛋白肽提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚魚鱗(蛋白質(zhì)含量55.87%)，湛江環(huán)球水產(chǎn)有限公司；堿性蛋白酶(alcalase 3.0T，標(biāo)稱活力為3.0 AU·g-1)、中性蛋白酶(neutral protease，標(biāo)稱活力為0.8 AU·g-1)、復(fù)合蛋白酶(protemax，標(biāo)稱活力為1.5 AU·g-1)、風(fēng)味蛋白酶(flavourzyme，標(biāo)稱活力為500 LAPU·g-1)，均購自諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶(trypsin，標(biāo)稱活力為250 000 U·g-1)、馬尿酸(hippuric acid，HA)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-hippuryl-histidyl-leucine，HHL)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)、鄰苯二甲醛(o-Phthalaldehyde，OPA)、絲氨酸(Ser)、抑肽酶、細(xì)胞色素C、碳酸酐酶、桿菌肽等均購自美國Sigma公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

400Y多功能粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司；DGG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；DSHZ-300A旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器，太倉市實驗設(shè)備廠；Fresco 21冷凍高速離心機，美國Thermo Fisher公司；QL-8bb-253旋渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；EVOLUTION 60S紫外分光光度計，美國Thermo Fisher公司；e2695高效液相色譜，美國Waters公司；K-360凱氏定氮儀、K-425快速消解儀，瑞士BUCHI公司；MLS-3781L高壓滅菌鍋，日本Panasonic公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 魚鱗前處理 將新鮮魚鱗用清水沖洗，瀝干，用0.4%氫氧化鈉溶液浸泡12 h(料液比為1∶5 g·mL-1)，除去脂肪、雜蛋白等，然后用1%HCl溶液浸泡，料液比為1∶10 g·mL-1，攪拌2 h進(jìn)行脫鈣處理，再用流水沖洗3 h，置于60℃恒溫烘箱烘烤24 h，最后粉碎即得脫鈣魚鱗粉(蛋白質(zhì)含量62.13%)，塑封袋保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 熱預(yù)處理及酶解試驗 取適量脫鈣魚鱗粉，加純水至料液比為2%，121℃熱處理15 min后進(jìn)行酶解。酶解工藝流程為:質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的羅非魚魚鱗溶液→121℃預(yù)熱處理15 min→酶解→沸水浴滅酶10 min→10 000 r·min-1離心20 min→上清液即為羅非魚魚鱗酶解液。

1.3.2.1 蛋白酶種類的篩選 以堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶為篩選對象，控制加酶量(E/S)0.1%、酶解時間2 h、酶解溫度和pH值為各蛋白酶的最適值(表1)的條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)。以酶解產(chǎn)物水解度和ACE抑制率為指標(biāo)篩選出最適蛋白酶。

表1 蛋白酶最適酶解條件Table1 Optimal enzymatic conditions for proteases

1.3.2.2 單因素試驗設(shè)計

1)酶解時間對羅非魚魚鱗酶解效果的影響:在酶解溫度50℃、pH值8.0、酶底比(E/S)0.1%條件下，設(shè)定不同的酶解時間:30、60、90、120、150、180、240 min。

2)酶底比(E/S)對羅非魚魚鱗酶解效果的影響:在酶解溫度50℃、pH值8.0、酶解時間2 h條件下，設(shè)定不同的酶底比:0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%。

3)酶解pH值對羅非魚魚鱗酶解效果的影響:在酶解溫度50℃、酶底比1%、酶解時間2 h條件下，設(shè)定不同的 pH 值:7.5、8.0、8.5、9.0、9.5。

4)酶解溫度對羅非魚魚鱗酶解效果的影響:在pH值8.0、酶底比1%、酶解時間2 h條件下，設(shè)定不同的酶解溫度:45、50、55、60、65℃。

1.3.3 魚鱗原料基本成分的測定 參照GB/T 5009.5-2016[14]的方法測定魚鱗原料的蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 羅非魚魚鱗酶解產(chǎn)物水解度的測定 采用OPA法，根據(jù)Spellman等[15]的方法并略作修改。配制OPA試劑(現(xiàn)用現(xiàn)配):將7.620 g四硼酸鈉和200 mg SDS用150 mL去離子水溶解，待完全溶解后加入4 mL溶有160 mg OPA的乙醇溶液，混勻后再加入176 mg二硫蘇糖醇(DL-Dithiothreitol，DTT)，定容至 200 mL。

水解度的測定:取400 μL樣品(羅非魚魚鱗酶解液稀釋20倍所得)，加入到裝有3 mL OPA的試管中，混勻后靜置2 min，測定其在340 nm波長處的吸光度值。以純水作為空白組，100 mg·L-1絲氨酸溶液代替樣品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算魚鱗酶解液中游離氨基含量，并按照公式計算水解度(hydroloysis degree，HD):

1.3.5 羅非魚魚鱗酶解產(chǎn)物ACE抑制率的測定 參照Wu等[16]的方法并略作修改。用0.1 moL·L-1硼酸緩沖液(pH值8.3，含有0.3 moL·L-1NaCI)配制反應(yīng)底物 N-馬脲酰組氨酰亮氨酸(N-hippuryl-histidylleucine，HHL，6.5 mmoL·L-1)和 ACE(100 U·L-1)。 取適量魚鱗酶解液稀釋至40 μL，與25 μL ACE溶液混合并于振蕩器中混勻，37℃水浴保溫10 min，然后加入40 μL HHL溶液啟動反應(yīng)，37℃水浴繼續(xù)保溫30 min，最后加入85 μL 1 moL·L-1HCl溶液終止反應(yīng)。反應(yīng)溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，用于HPLC分析測定反應(yīng)中產(chǎn)生的HA的量。

色譜條件:采用Waters2695 HPLC系統(tǒng)和UV/Vis檢測器，SunFire C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。上樣量10 μL，檢測波長228 nm，流動相為乙腈—0.1%TFA水溶液 (30∶70，v/v)，流速為 0.8 mL·min-1。按照公式計算ACE抑制率:

式中，A為用純水代替酶解物參與反應(yīng)條件下所產(chǎn)生的HA的量；B為酶解物參與反應(yīng)的條件下所產(chǎn)生的HA的量。

1.3.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用堿性蛋白酶對樣品進(jìn)行酶解一定時間(2 h)，選取酶解溫度(A)、pH值(B)和酶底比(C)3個考察因素為自變量，ACE抑制率(%)為響應(yīng)值，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗設(shè)計，研究各考察因素對羅非魚魚鱗酶解效果的影響。響應(yīng)面試驗設(shè)計與因素水平編碼表見表2。

表2 響應(yīng)面法的因素水平編碼Table2 Factor and level of the response surface method

1.3.7 羅非魚魚鱗酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布測定 參照黃丹丹等[17]的方法并略作修改。取適量魚鱗酶解液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上樣分析。色譜條件為:采用 Waters2695 HPLC系統(tǒng)和 UV/Vis檢測器，TSKgel G2000-SWxl(7.8 mm ×300 mm，Tosoh)色譜柱，檢測波長220 nm，洗脫液為45%乙腈-55%水溶液(0.1%TFA)，流速 0.5 mL·min-1，進(jìn)樣量 10 μL。 相對分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品分別為:HHL(429 Da)、桿菌肽(1 422 Da)、抑肽酶(6.5 kDa)、細(xì)胞色素C(12.4 kDa)、碳酸酐酶(29 kDa)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，用Duncan多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗(P＜0.05)；應(yīng)用Origin7.5進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、作圖，并用 Design Expert 8軟件對響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚魚鱗酶解蛋白酶的篩選

圖1 不同蛋白酶種類對魚鱗酶解產(chǎn)物水解度和ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of different protease on the hydrolysis degree and ACE inhibition rate of fish scale hydrolysates

由圖1可知，不同種類的蛋白酶對羅非魚魚鱗蛋白的酶解效果差異較大，且ACE抑制率大小與水解度高低呈正相關(guān)，二者由大到小的順序均為:堿性蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶＞復(fù)合蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶，這可能是因為不同種類的蛋白酶能夠作用的特定的酶切位點不同，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物水解度不同，產(chǎn)生ACE抑制肽的量也不同。堿性蛋白酶的酶解效果較好，故選用堿性蛋白酶作為酶制劑進(jìn)行后續(xù)羅非魚魚鱗酶解條件的優(yōu)化。

2.2 單因素試驗結(jié)果分析

由圖2-A可知，隨著酶解時間的延長，羅非魚酶解產(chǎn)物水解度呈不斷上升趨勢；ACE抑制率在前120 min內(nèi)呈增大趨勢，酶解 120 min時達(dá)到最大值(77.79%)，繼續(xù)延長酶解時間，魚鱗酶解液的ACE抑制率開始下降。Bougatef等[18]和Wu等[19]研究發(fā)現(xiàn)ACE抑制率隨水解度增大呈先升高后降低趨勢，這可能是因為酶解時間越長，水解度越大，同時釋放出更多的ACE抑制肽；但酶解時間過長，一些已經(jīng)形成的ACE抑制肽會在蛋白酶的作用下被進(jìn)一步水解為無活性的分子[20]，使得ACE抑制率降低。因此，選用120 min作為羅非魚魚鱗的最佳酶解時間。

由圖2-B可知，隨著酶底比的增大，羅非魚酶解產(chǎn)物的水解度呈上升趨勢；當(dāng)酶底比為0.1%～1.0%時，魚鱗酶解產(chǎn)物的ACE抑制率隨酶底比增大而升高，酶底比為1.0%時達(dá)到最大值(86.09%)，繼續(xù)增大酶底比，魚鱗酶解產(chǎn)物的ACE抑制率無明顯變化。因此，選取1.0%作為羅非魚魚鱗酶解的最佳酶底比。

由圖2-C可知，隨著pH值的增大，魚鱗酶解產(chǎn)物水解度和ACE抑制率均呈先升高后下降的趨勢。其中，當(dāng)pH值為7.5～8.0時，魚鱗酶解產(chǎn)物水解度顯著升高(P＜0.05)，pH值為8.0～8.5變化不明顯，繼續(xù)增大pH值，水解度明顯開始下降(P＜0.05)；pH值為7.5～8.0時，魚鱗酶解產(chǎn)物ACE抑制率顯著升高(P＜0.05)，pH值大于8.0時，ACE抑制率明顯下降(P＜0.05)。在不同pH值條件下，蛋白質(zhì)的解離狀態(tài)不同，蛋白底物與蛋白酶的接觸位點也不同，因而導(dǎo)致酶解產(chǎn)物不同[21]。綜上，pH值為8.0時，堿性蛋白酶酶解魚鱗制備ACE抑制肽的酶解效率最高，故選用8.0作為魚鱗酶解的最佳pH值。

由圖2-D可知，隨著酶解溫度的升高，羅非魚魚鱗酶解產(chǎn)物水解度和ACE抑制率均呈先上升后下降的趨勢，且都在酶解溫度為55℃時達(dá)到最大值，此時魚鱗酶解產(chǎn)物水解度為14.11%，ACE抑制率為86.09%。綜上，選用55℃作為魚鱗酶解的最適酶解溫度。

圖2 單因素條件對魚鱗酶解產(chǎn)物水解度和ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of single factors on the hydrolysis degree and ACE inhibition rate of fish scale hydrolysates

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.3.1 二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析 采用Design-Export 8.0.6軟件，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取酶解溫度(A)、pH值(B)和酶底比(C)3個因素為自變量，以酶解產(chǎn)物ACE抑制率(Y)為目標(biāo)函數(shù)，作三因素三水平共15個試驗點，包括5個中心點和10個析因點。響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

對表3進(jìn)行回歸分析得到相應(yīng)的二次響應(yīng)面回歸方程:

Y=87.54＋2.39A＋1.81B＋0.64C-7.18AB＋5.56AC＋3.90BC-6.05A2-8.85B2-5.79C2。

由表4可知，回歸模型P＜0.000 1，極顯著(P＜0.01)；模型的一次項A，二次項A2、B2、C2及交互項AB、AC、BC，對魚鱗酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響極顯著(P＜0.01)，一次項B對魚鱗酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響顯著(P＜0.05)，說明各因素對魚鱗酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響不是簡單的線性關(guān)系，存在一定的交互作用。失擬項P=0.418 7，不顯著，表明失擬誤差相對于純誤差是不顯著的，模型擬合程度良好；F值可評價各因素其對試驗指標(biāo)的影響程度，根據(jù)F值得出各因素對魚鱗酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響順序為A＞B＞C。相關(guān)系數(shù)R2=99.84%，說明響應(yīng)值的變化有99.84%與所選變量有關(guān)。模型的校正系數(shù)R2Adj=99.56%，說明不確定因素對試驗結(jié)果的干擾較小，該模型與數(shù)據(jù)擬合度較好，比較可靠[22～24]，可以用此模型分析和預(yù)測魚鱗蛋白酶解制備ACE抑制肽的情況。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table3 Design and results of the response surface experiments

表4 回歸模型方差分析結(jié)果Table4 Variance analysis results of regression model

2.3.2 各因素交互作用對羅非魚魚鱗酶解效果的影響 由圖3可知，酶解溫度(A)的響應(yīng)面曲線坡度較大，表明其對魚鱗蛋白酶解物ACE抑制率的影響最為顯著；pH值(B)次之，而酶底比(C)的響應(yīng)面曲線較平滑，說明酶底比對ACE抑制率的影響相對較小，這與回歸模型方差分析中的一次項顯著性結(jié)果一致。

圖3 各因素交互作用對魚鱗酶解物ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of interaction of various factors on ACE inhibition rate of fish scale hydrolysates

2.3.3 驗證試驗 采用Design-Export 8.0.6軟件，以最高ACE抑制率為目標(biāo)進(jìn)行分析，得到堿性蛋白酶酶解魚鱗制備ACE抑制肽的最佳酶解條件為:酶解溫度56.33℃，pH值8.02，酶底比1.1%，此條件下魚鱗酶解產(chǎn)物ACE抑制率理論值為87.95%。為驗證響應(yīng)面模型的有效性，根據(jù)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行3次平行試驗，實際驗證試驗條件為:2%的魚鱗原料采用堿性蛋白酶酶解2 h，酶解溫度56.3℃，pH 值8.0，酶底比1.1%，測得酶解產(chǎn)物ACE抑制率實際值為88.26%，與理論值接近，且重復(fù)性較好，說明響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果可靠。

2.4 羅非魚魚鱗酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布情況

以各標(biāo)準(zhǔn)品保留時間(t)為橫坐標(biāo)，分子質(zhì)量的對數(shù)[lg(M)]為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，分子質(zhì)量的對數(shù)[lg(M)]與保留時間(t)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為:lg(M)=-0.219t＋7.192，決定系數(shù)R2=0.996。根據(jù)回歸方程計算出樣品相對分子質(zhì)量在各范圍的分布情況。

圖4 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of relative molecular mass

由圖5可知，羅非魚魚鱗經(jīng)最優(yōu)酶解條件下酶解制得的酶解產(chǎn)物，相對分子質(zhì)量分布整體較小，主要集中在300～3 000 Da之間，不存在3 000 Da以上分子，其中相對分子質(zhì)量為2 568、1 396、731、302 Da的肽段分別占11.92%、21.61%、34.48%和28.57%，還存在3.43%相對分子質(zhì)量在300 Da以下的小分子。說明在優(yōu)化后的酶解條件下，羅非魚魚鱗蛋白酶解比較徹底，酶解效果較好。

圖5 魚鱗酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布色譜圖Fig.5 Chromatogram of relative molecular mass distribution of fish scale hydrolysate

3 討論

酶解法反應(yīng)條件溫和，綠色高效，能很好地保存氨基酸的營養(yǎng)價值，且無毒無害，安全性極高，是當(dāng)前制備降血壓活性肽的主要手段之一。曾健輝等[11]運用響應(yīng)面法優(yōu)化了堿性蛋白酶酶解魚鱗直接制備ACE抑制肽的工藝條件，其最優(yōu)條件為加酶量6.1%、pH值8.9、酶解溫度54.7℃、酶解時間2 h。研究表明，85℃/1.5 h熱處理結(jié)合粉碎處理能顯著提高魚鱗膠原蛋白肽的產(chǎn)率及產(chǎn)物特性[25]，但有關(guān)魚鱗在更高溫度下的酶解過程鮮有報道。通過適度的高溫處理破壞蛋白質(zhì)分子的高級結(jié)構(gòu)，使其剛性結(jié)構(gòu)柔性化[26]，從而形成利于提取或酶解的解離狀態(tài)，是蛋白質(zhì)物理改性研究中的熱點。如Yang等[27-28]研究了高溫條件下制備羅非魚皮明膠水解液；Min等[29]研究發(fā)現(xiàn)水熱處理(150～250℃)可用于生產(chǎn)豬皮副產(chǎn)物蛋白質(zhì)水解物；王彥蓉等[30]研究了高溫處理下羅非魚皮魚鱗混合物的酶解特性；沙小梅等[31]采用高溫水對魚骨進(jìn)行軟化處理。本研究采用121℃熱預(yù)處理魚鱗蛋白，一方面利于魚鱗內(nèi)部的膠原蛋白從表層羥基磷灰石等抗性屏障中溶出，另一方面適度熱處理可使蛋白質(zhì)分子間的疏水鍵、氫鍵和某些共價鍵斷裂，使其蛋白結(jié)構(gòu)，尤其是致密的膠原三螺旋結(jié)構(gòu)變得松散，從而暴露出更多的酶切位點，提高酶解效率，但對高溫處理過程中魚鱗膠原蛋白構(gòu)效關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。高溫處理會改變魚鱗蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響其酶解進(jìn)程，因而也就可能會改變蛋白酶酶解的最優(yōu)條件，為了獲得更多魚鱗酶解液ACE抑制肽，有必要對其酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。

賀江等[32]采用酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶3種蛋白酶酶解草魚魚鱗膠原蛋白制備ACE抑制肽，發(fā)現(xiàn)酸性蛋白酶酶解效果最佳，這與本研究結(jié)果不同。本試驗通過比較5種不同的蛋白酶對魚鱗的酶解效果，確認(rèn)最佳蛋白酶為堿性蛋白酶，這可能是因為不同的蛋白酶只能作用于特定的酶切位點，而本試驗采用的羅非魚鱗與賀江等[32]使用的草魚鱗具有不同的氨基酸組成與氨基酸序列，因此具有最佳酶解效果的蛋白酶不同。除原料和蛋白酶種類外，魚鱗蛋白的酶解效果也與酶解溫度、pH值、酶添加量及酶解時間等工藝參數(shù)有關(guān)。張豐香等[33]采用中性蛋白酶酶解草魚魚鱗制備ACE抑制肽，優(yōu)化得到最佳工藝條件為:pH值6.4、酶解溫度50℃、加酶量([E]/[S])5%、水解時間3 h；吳靖娜等[13]研究復(fù)合蛋白酶酶解羅非魚魚鱗膠制備ACE抑制肽，得到最佳工藝條件為:pH值7.5、酶解溫度50℃、加酶量([E]/[S])1.5%、水解時間6 h。本研究結(jié)果表明，堿性蛋白酶酶解魚鱗蛋白制備ACE抑制肽效果最佳，通過單因素及響應(yīng)面試驗優(yōu)化最佳酶解條件為:酶解時間 2 h、酶解溫度56.3℃、pH值8.0、酶底比1.1%，該工藝參數(shù)與前人研究結(jié)果相比，酶的添加量更少，酶解效率更高，這主要是因為預(yù)先對魚鱗采用了高溫?zé)犷A(yù)處理，使魚鱗部分蛋白質(zhì)溶出，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，更易于被酶切，因此，在酶解時只需要較短的時間和較少的蛋白酶添加量就能達(dá)到較好的酶解效果。ACE抑制肽一般具有較小的相對分子質(zhì)量，本試驗所制得的羅非魚魚鱗酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布集中在300～3 000 Da，普遍較小，表明制得的酶解產(chǎn)物中ACE抑制肽含量較高。

4 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面法對酶法制備羅非魚魚鱗蛋白降血壓活性肽的工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳蛋白酶種類為堿性蛋白酶，最優(yōu)酶解工藝條件為:酶解時間2 h、酶解溫度56.3℃、pH值8.0、酶底比1.1%，此條件下羅非魚魚鱗酶解產(chǎn)物ACE抑制率為88.26%，酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量集中在300～3 000 Da之間。本試驗結(jié)果可為魚鱗蛋白降血壓活性肽的實際生產(chǎn)提供一定理論依據(jù)，但本研究只對魚鱗蛋白降血壓肽的制備工藝進(jìn)行了初步研究，制備的ACE抑制肽也為粗提物，故今后可對ACE抑制肽粗提物做進(jìn)一步分離純化，以制備更高純度的降血壓活性肽。