王曉芬 郜海燕 吳偉杰 徐非非 王紹金 陳杭君 寇莉萍

(1浙江省農(nóng)業(yè)科學院食品科學研究所/農(nóng)業(yè)部果品產(chǎn)后處理重點實驗室/浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點實驗室/中國輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點實驗室/浙江省植物有害生物防控重點實驗室，浙江杭州 310021；2西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100；3西北農(nóng)林科技大學機械與電子工程學院，陜西楊凌 712100)

辣椒(Capsicum annuumL.)，茄科辣椒屬一年或多年生草本植物，富含多種對人體有益的活性成分。辣椒紅素和辣椒堿是辣椒的特征成分，其中辣椒紅素是一種四萜類天然色素，具有色澤鮮艷、色價高、著色力強、保色效果好、安全性高等優(yōu)點，是天然紅色素中最好的色素之一，且兼具藥用價值；辣椒堿是辣椒的主要呈味物質(zhì)，天然辣椒堿具有鎮(zhèn)痛止癢、抗菌消炎、清除自由基、促進脂肪代謝、預防腫瘤和保護心血管系統(tǒng)等作用[1-3]。

LED藍光是指波長在430～470 nm范圍的短波光。研究發(fā)現(xiàn)，適量強度的藍光照射可以誘導果蔬中色素物質(zhì)(如葉綠素、花青素)的積累，且可以促進果實的成熟。 杜洪濤等[4]分別采用 30 μmol·m-2·s-1的紅、黃、藍、綠、白光照射不同品種的彩色甜椒幼苗，發(fā)現(xiàn)與其他光處理相比，LED藍光能有效促進各品種彩色甜椒幼苗的葉綠素含量的積累，這與李雯琳[5]、Hoffmann等[6]的研究結(jié)果相似。Shi等[7-8]、Xu等[9-10]發(fā)現(xiàn) 40 μmol·m-2·s-1藍光照射可誘導采后草莓、藍莓、楊梅等的花青素含量顯著增加；Gong等[11]發(fā)現(xiàn) 40 μmol·m-2·s-1藍光照射加快了碧桃果實中乙烯的生成速率，促進了碧桃成熟。目前，有關(guān)LED藍光對辣椒的研究多集中于照射辣椒種子、幼苗、未采收的辣椒等，以此來提高辣椒苗的質(zhì)量和辣椒的品質(zhì)及產(chǎn)量[12-15]，但對采后辣椒色澤和營養(yǎng)成分等方面的研究尚鮮見報道。 本試驗采用14 μmol·m-2·s-1LED藍光照射采后新鮮紅辣椒和綠辣椒，分析藍光照射對采后紅辣椒和綠辣椒的色澤、葉綠素含量、辣椒紅素含量、辣椒堿含量、Vc含量及 Caspsanthin/capsorubin synthase(Ccs)基因表達量的影響規(guī)律，以期為LED藍光照射對辣椒品質(zhì)影響提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮辣椒于2016年10月購自杭州市江干區(qū)楊家村農(nóng)貿(mào)市場，其中綠辣椒的品種為西洋大牛椒，紅辣椒的品種為大紅袍。綠、紅辣椒的大小基本一致(每顆鮮重50±2.5 g)、成熟度基本一致、無腐爛病害、無機械損傷。

辣椒紅素標準品(≥98%)，哈維生物科技有限公司；辣椒堿標準品(≥95%)，上海阿拉丁試劑有限公司；RNAplant plus，天根生化科技有限公司；丙酮(分析純)，上海凌峰化學試劑有限公司；乙醇(分析純)，上海凌峰化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

MRC-250B LED冷光源氣候培養(yǎng)箱，上海百典儀器設備有限公司；Cintra404紫外-可見分光光度計，澳大利亞 GBC公司；實時熒光定量 PCR儀，美國Applied Biosystems；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司；PAL-1型手持折射儀，日本SANYO公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 處理方法 試驗分為LED藍光處理組(LED)和對照組(CK)，其中LED又分為半光照組和整體光照組:半光照組:將250根辣椒平鋪在藍光箱中，貯藏溫度和相對濕度分別為 25℃、80%，上面用 14 μmol·m-2·s-1的 LED 藍光照射，每個辣椒的下面用錫箔紙包裹嚴實，背對藍光燈，形成避光對照組，每2 d取一次樣，每次取樣量為50根；整體光照組:試驗組辣椒(250 根)上、下面均用 14 μmol·m-2·s-1的 LED 藍光照射，對照組為避光貯藏(250根)，貯藏溫度和相對濕度分別為25℃、80%。半光照組取樣時以錫箔紙包裹邊緣位置為切割線，并與整體光照組混勻，分別對藍光處理及避光對照的紅(R)綠辣椒(G)色澤、葉綠素含量、辣椒紅素含量、辣椒堿含量、Vc含量及Ccs基因表達量等指標進行測定。

1.3.2 辣椒色澤的測定 采用手持色差儀，分別測定紅辣椒和綠辣椒光照組和避光組的L?、a?值，每個樣品處理測6個點，取平均值。

1.3.3 辣椒葉綠素含量的測定 葉綠素含量測定參照曹建康[16]的方法進行，結(jié)果以mg·g-1FW表示。每次取樣時測定辣椒中的葉綠素含量，用80%的丙酮作為提取溶劑，并測定652 nm處的史光值(A652)，重復測定3次，取平均值。

式中，Ⅴ:樣品提取液總體積，mL；m:樣品質(zhì)量，g；n:稀釋倍數(shù)。

1.3.4 辣椒辣椒紅素含量的測定 辣椒紅素的提取:準確稱取辣椒樣品1.000 0 g，加入10 mL 95%乙醇，設置超聲功率600 W、溫度60℃，超聲時間100 min，過濾得上清液，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

辣椒紅素含量的測定:參照錢宗耀等[17]的方法并略作改動。準確稱取一定量的辣椒紅素標準品，用95%的乙醇定容至 100 mL，配成 300 μg·mL-1的標準品溶液；分別準確移取標準品溶液2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL于25 mL容量瓶中，用乙醇定容至100 mL，95%乙醇調(diào)零，在460 nm波長下測定吸光值，然后以標準質(zhì)量為橫坐標，相對應的吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，簡稱A-G標準曲線。用95%乙醇溶液將超聲提取的辣椒濾液稀釋一定倍數(shù)后，在460 nm波長下測定吸光值。根據(jù)標準曲線獲得各樣品中的辣椒紅素含量，計算公式如下:

式中，G:從A-G標準曲線中查到的標準質(zhì)量，mg；m:測定所取樣品的質(zhì)量，g。

1.3.5 辣椒辣椒堿含量的測定 辣椒堿的提取:準確稱取辣椒樣品1 g，加入35 mL 95%乙醇，設置超聲功率為600 W，溫度60℃，超聲時間45 min，取上清液備用。

辣椒堿含量的測定:采用分光光度計法(鉬酸鈉-亞硝酸鈉法)，參照董力瑋等[18]的方法并略作改動。準確稱取辣椒堿標品0.011 8 g，用適量95%乙醇溶解并定容至 100 mL；準確吸取標液 0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于10 mL容量瓶中，然后依次加入2 mL 0.5 mol·L-1的鹽酸溶液和1 mL亞硝酸鈉-鉬酸鈉(亞硝酸鈉 0.5 mol·L-1，鉬酸鈉為 0.025 mol·L-1)，充分混勻，靜止15 min后加入2 mL 1.0 mol·L-1的氫氧化鈉溶液，再用95%乙醇定容至10 mL，顯色20 min，以0 mL瓶為參照，在436 nm處測定吸光度值。以標準質(zhì)量為橫坐標，相對應的吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，簡稱A-G標準曲線。取超聲所得辣椒上清液5 mL于10 mL容量瓶，依次加入2 mL鹽酸溶液和1 mL亞硝酸鈉-鉬酸鈉，充分混勻，靜止15 min后加入2 mL氫氧化鈉溶液，用95%乙醇定容至刻線，顯色20 min。以0 mL瓶為參照，在436 nm處測定吸光度值。按照公式計算辣椒堿含量:

式中，G:從A-G標準曲線中查到的標準質(zhì)量，mg；m:測定所取樣品的質(zhì)量，g。

1.3.6 辣椒紅素合成關(guān)鍵基因的表達Ccs基因是控制辣椒果實中辣椒紅素合成和果實紅色形成的關(guān)鍵基因，運用實時定量PCR技術(shù)可分析LED藍光對辣椒紅素合成關(guān)鍵基因表達的影響。利用RNAplant Plus試劑提取不同處理時間紅、綠辣椒中的總RNA，并以RNA為模板，參照 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa，大連)的操作，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以反轉(zhuǎn)錄獲得的 cDNA為模板，使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒 (TaKaRa，大連)在 ABI StepOne Plus實時定量PCR分析儀上進行實時熒光定量PCR分析。辣椒紅素合成關(guān)鍵基因Ccs的引物序列如下:CTTTGAACAAGTCGATCGGCTTCG(Ccs-F)；C AGATCTAGTATTCACCGGACACTC(Ccs-R)。具體反應程序及基因表達分析算法參照田士林[19]的方法，每個樣品均重復3次。

1.3.7 辣椒Vc含量的測定 參照曹建康[16]的方法，結(jié)果以mg·100 g-1表示。 用5 mL 50 g·L-1的三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)溶液提取Vc。測定時取1 mL提取液的上清液，再分別加入1 mL 50 g·L-1TCA溶液、1.0 mL無水乙醇、0.5 mL 0.4%磷酸-乙醇溶液、1.0 mL 5g·L-1紅菲羅啉-乙醇溶液、0.5 mL 0.3 g·L-1FeCl3-乙醇溶液，30℃水浴 60 min，于 534 nm 波長下測定吸光值，重復3次。

式中，Ⅴ:提取液總體積，mL；m′:由標準曲線求得的 VC質(zhì)量，μg；Vs:測定時提取液體積，mL；m:樣品質(zhì)量，g；n:稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用Microsoft Excel 2003和Minitab 16.2.3軟件進行數(shù)據(jù)處理，并對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LED藍光對辣椒色澤的影響

由圖1可知，綠辣椒在貯藏初期(0 d)為綠色，貯藏8 d內(nèi)，對照組(避光面，CK)色澤變化不顯著，而LED藍光組(LED)的綠辣椒從第2天開始變紅，到第8天時整個光照面全部變紅；紅辣椒在貯藏初期為黃紅色，經(jīng)過8 d貯藏后，均逐漸變紅，且LED從第2天開始紅色明顯深于CK。

圖1 LED藍光處理對辣椒色澤影響Fig.1 Effect of light-emitting diode blue light treatment on the color of peppers

由圖2-A、C可知，隨著貯藏時間的延長，辣椒的亮度(L?)值呈下降趨勢。與CK相比，LED藍光處理加快了綠辣椒和紅辣椒L?值的下降速率。CK(G)和LED(G)均在第4天表現(xiàn)出L?值明顯下降。CK(R)和LED(R)均在第2天表現(xiàn)出L?值明顯下降。其中CK(G)的L?值變化程度最小。除第0、第2天外，綠辣椒L?值在LED(G)和 CK(G)(第 4、第 6、第 8天)之間均存在顯著差異。在第0、第4、第6和第8天時，紅辣椒L?值在LED(R)和CK(R)之間無顯著差異，在第2天時差異顯著，說明紅辣椒中辣椒紅素的加速積累主要發(fā)生在第2天。

由圖2-B、D可知，LED藍光處理促進了綠辣椒和紅辣椒的快速變紅，尤其是綠辣椒。LED藍光處理組在第4天時，綠辣椒a?值由負值變?yōu)檎?，?天時a?值達到33.2，接近紅辣椒的a?值，CK(G)的a?值變化較小，第8天也僅為-18.1，說明LED藍光對綠辣椒色澤影響極顯著(P＜0.01)。對紅辣椒而言，0～6 d時LED(R)的a?值高于CK(R)，但差異不顯著，直到第8天時LED(R)a?值顯著高于CK(R)(P＜0.05)，這一變化規(guī)律與色澤(圖1)變化完全相符。此外，L?值的下降與辣椒a?值的上升是相對的，即a?值越高，L?值越低。

圖2 LED藍光處理對辣椒色澤的影響Fig.2 Effect of light-emitting diode blue light treatment on the color of peppers

2.2 LED藍光對辣椒葉綠素含量的影響

辣椒在綠果期主要呈色物質(zhì)為葉綠素。本研究中，紅辣椒的葉綠素含量極低，幾乎無法檢測到，故僅對綠辣椒的葉綠素含量進行分析。由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，LED(G)和CK(G)的葉綠素含量均呈下降趨勢。LED(G)的葉綠素含量下降速率非常快，葉綠素每2天的含量變化差異顯著(P＜0.01)，到第8天時下降至0.033 mg·g-1，僅為初始值(0 d)的17%；CK(G)葉綠素含量下降速率相對緩慢，從第0～第2天葉綠素含量下降相對較快，之后變化不明顯，至第8天時葉綠素含量仍然為初始值(0 d)的82%。在整個過程中，LED(G)的葉綠素含量均顯著低于同一時期CK(G)的含量，說明LED(G)的綠辣椒退綠速度顯著高于同一時期CK(G)的退綠速度(P＜0.01)。由此可知，LED(G)可顯著加快綠辣椒的退綠，降低綠辣椒中葉綠素含量，此結(jié)果與LED藍光對綠辣椒a?值的影響規(guī)律一致(圖2-B)。

圖3 LED藍光貯藏對綠辣椒葉綠素含量的影響Fig.3 Effect of light-emitting diode blue light treatment on chlorophyll content of green peppers

2.3 LED藍光對辣椒果實辣椒紅素含量的影響

由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，綠辣椒和紅辣椒中辣椒紅素的含量均呈上升趨勢。與對照組相比，LED藍光可顯著提高紅辣椒和綠辣椒中辣椒紅素的含量。LED藍光處理綠辣椒，前2 d對其辣椒紅素含量影響不大，但從第4天開始辣椒紅素含量顯著高于CK(G)，到第8天時，其辣椒紅素含量已達到初始值(0 d)的7.47倍，而CK(G)僅為初始值的1.34倍。CK(R)和LED(R)中辣椒紅素含量在貯藏期間均穩(wěn)步上升，LED(R)辣椒紅素含量從第2天開始(2、4、6和8 d)顯著高于CK(R)(P＜0.01)，在第8天時，LED(R)的辣椒紅素含量達到CK(R)的1.60倍。上述結(jié)果與LED藍光對綠辣椒、紅辣椒色澤及a?值的影響相符。

圖4 LED藍光處理對辣椒中辣椒紅素含量的影響Fig.4 Effect of light-emitting diode blue light treatment on capsanthin content of peppers

2.4 LED藍光對辣椒果實辣椒堿含量的影響

由圖5可知，綠辣椒和紅辣椒中辣椒堿含量在貯藏過程中均呈上升趨勢，且LED藍光處理可加速辣椒堿的生成。LED藍光處理綠辣椒，前4 d對辣椒堿含量影響不顯著，但從第6天開始，LED(G)中辣椒堿含量顯著高于CK(G)，到第8天時辣椒堿含量達到CK(G)的1.85倍(P＜0.01)。LED藍光處理紅辣椒，前2 d對其辣椒堿含量影響不顯著，但從第4天開始，LED(R)中辣椒堿含量快速增加，且含量顯著高于 CK(R)，到第 8天時，LED(R)中辣椒堿含量已達到0.420%，而CK(R)僅為0.274%，LED(R)辣椒堿含量為 CK(R)的1.53倍(P＜0.01)。

2.5 LED藍光對辣椒果實中Ccs基因表達

辣椒果實紅色的深淺是由果實中辣椒紅素及其含量決定的，而Ccs基因被認為是控制辣椒果實紅色形成的關(guān)鍵基因，該基因的表達與否制約著辣椒果實中辣椒紅素的合成[19]。由圖6可知，從貯藏第2天開始，LED(G)果實中Ccs基因的表達水平就一直顯著高于CK(G)的表達水平，而CK(G)的Ccs基因表達水平隨著貯藏時間的延長一直保持在極低的水平。對紅辣椒的Ccs基因而言，無論CK(R)組還是LED(R)，在果實逐漸轉(zhuǎn)紅的過程中，Ccs基因的表達水平總體呈增加趨勢，且LED(R)中Ccs基因的表達量顯著高于CK(R)。

圖5 LED藍光處理對辣椒中辣椒堿含量的影響Fig.5 Effect of light-emitting diode blue light treatment on capsaicin content of peppers

圖6 LED藍光處理對辣椒中Ccs基因相對表達量的影響Fig.6 Effect of light-emitting diode blue light treatment on relative expression level of Ccs gene in peppers

2.6 LED藍光對辣椒果實Vc含量的影響

Vc又名抗壞血酸，是一種水溶性的維生素，一般紅辣椒中的Vc含量高于綠辣椒。由圖7可知，在整個貯藏期間，CK和LED組的Vc含量均呈上升趨勢，與相比，LED處理促進了綠辣椒和紅辣椒中Vc含量的積累。CK(G)和LED(G)分別在第2、第4天表現(xiàn)出對Vc的顯著積累，從第2天開始，LED(G)Vc含量顯著高于CK(G)(P＜0.01)，到第8天時，LED(G)的Vc含量已達到20.208 mg·100g-1，相當于CK(G)的1.58倍。CK(R)和LED(R)分別在第2、第8天表現(xiàn)出對Vc的顯著積累，且從第2天開始，LED(R)的Vc含量顯著高于CK(R)(P＜0.01)，到第8天時，LED(R)的Vc含量是對照組含量的1.25倍。表明在采后貯藏過程中，LED藍光處理能顯著提高綠辣椒和紅辣椒中Vc含量(P＜0.01)。

圖7 LED藍光處理對綠辣椒Vc含量的影響Fig.7 Effect of light-emitting diode blue light treatment on Vc content of peppers

3 討論

LED藍光作為一種新型處理方式備受關(guān)注，但較多應用于辣椒幼苗的增壯和果實的增產(chǎn)中，在采后辣椒品質(zhì)保持方面的應用尚鮮見報道。本試驗采用LED藍光照射處理采后紅、綠辣椒，不僅操作簡單，安全無污染，還具有改善辣椒色澤，提高辣椒營養(yǎng)成分含量等作用。

色澤是反映果蔬品質(zhì)的重要指標。本研究中，LED藍光能有效地促進紅、綠辣椒的退綠和變紅速率；貯藏第8天時LED(G)中葉綠素含量僅為0.033 mg·g-1，辣椒完全變紅，辣椒紅素含量遠高于CK(G)；LED(R)中辣椒紅素也顯著高于CK(R)。此外，LED藍光處理可誘導辣椒Ccs基因的顯著增量表達(P＜0.01)，從而有效調(diào)控辣椒紅素的合成。王超等[20]、高波等[21]、李寧等[22]、伍新齡等[23]利用LED藍光照射處理西芹、西蘭花等綠色蔬菜時發(fā)現(xiàn)，10 μmol·m-2·s-1的藍光照射可有效地保持西芹和西蘭花中葉綠素的含量，延緩黃化速度，這與本試驗結(jié)果不符，可能是因為西芹、西蘭花中呈色物質(zhì)比較單一，以葉綠素為主，而辣椒最終的呈色物質(zhì)還包括辣椒紅素和類胡蘿卜素等。LED藍光照射處理可誘導綠辣椒成熟，使其葉綠素的降解速度大于合成速度，并促使葉綠素最終含量下降，被葉綠素所掩蓋的類胡蘿卜素、辣椒紅素的顏色隨即顯現(xiàn)，從而使整個辣椒色澤逐漸呈現(xiàn)紅色。

Vc和辣椒堿是辣椒中主要的營養(yǎng)物質(zhì)和呈味物質(zhì)，辣椒因富含Vc，被稱為蔬菜中的Vc之王[24]。任邦來等[25]、朱圓圓等[26]、李文文等[27]發(fā)現(xiàn)涂膜、保鮮劑、低溫貯存等技術(shù)能有效延緩辣椒中Vc含量的下降速率。 本研究中，14 μmol·m-2·s-1LED 藍光照射能有效提高采后辣椒中的Vc含量，紅、綠辣椒中Vc含量在第8天時分別為CK的1.25倍和1.58倍，依次為初始值(0 d)的1.72倍和2.51倍。辣椒堿的積累與遺傳背景有關(guān)，同時還受光照、溫度、肥料、水分等環(huán)境因素的影響[28]。本試驗中LED藍光照射顯著增加了紅、綠辣椒中辣椒堿的合成，使得辣椒堿的含量在貯藏第8天時遠高于CK，這與前人研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，運用 14 μmol·m-2·s-1LED 藍光照射采后辣椒，可有效促進紅辣椒和綠辣椒的變紅和成熟，顯著提高紅、綠辣椒果實中辣椒紅素含量，使紅、綠辣椒在貯藏第8天時的辣椒紅素含量分別達到CK的1.60倍和5.59倍，Ccs基因的表達量分別為CK的1.35倍和4.01倍；LED藍光處理可促使綠辣椒退綠，顯著降低綠辣椒中葉綠素含量。此外，LED藍光照射處理能顯著增加紅、綠辣椒中辣椒堿和Vc含量，貯藏第8天，紅、綠辣椒中辣椒堿含量分別為CK的1.53、1.85倍，Vc含量分別是CK的1.25倍和1.58倍。14 μmol·m-2·s-1的LED藍光照射處理在提高采后辣椒的色澤和營養(yǎng)品質(zhì)方面具有較好的應用前景。