殷朝敏 范秀芝 劉純友 史德芳 高 虹

(1湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所/國家食用菌加工技術(shù)

研發(fā)分中心，湖北武漢 430064；2廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州 545006)

側(cè)耳屬(Pleurotus)食用菌隸屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)傘菌綱(Agaricomycetes)傘菌目(Agaricales)側(cè)耳科(Pleurotaceae)，是世界第二大人工栽培的食用菌[1-2]。側(cè)耳屬食用菌不僅肉質(zhì)脆嫩、味道鮮美，還含有豐富的生物活性物質(zhì)，如多糖[3-4]、甾體類化合物[5]、洛伐他汀[6]和麥角硫因[7-8]等。研究表明，洛伐他汀能顯著降低人體血液中膽固醇的含量，而麥角硫因抗氧化活性強，具有提高機體免疫力、延緩衰老等功效，二者已引起人們的極大關(guān)注[9]。

洛伐他汀是一種次級代謝產(chǎn)物，主要存在于側(cè)耳屬(Pleurotus)、紅曲霉 (Monascusruber)、土曲霉(Aspergillus terreus)等真菌中[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)洛伐他汀化學(xué)結(jié)構(gòu)中開環(huán)羥基酸部分與3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A(HMG-CoA)的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分相似[11]。目前，洛伐他汀已被用于高血脂等疾病的治療。在膽固醇合成的早期階段，洛伐他汀可以競爭性地抑制膽固醇生物合成限速酶——HMG-CoA還原酶，繼而抑制內(nèi)源性膽固醇合成，調(diào)節(jié)體內(nèi)異常血脂的生成[13]。麥角硫因(巰基組氨酸三甲基內(nèi)鹽)是一種天然的氨基酸類強抗氧化劑，具有抗氧化、清除自由基、螯合金屬離子、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)等多種功能[14-15]，是機體內(nèi)的重要活性物質(zhì)。麥角硫廣泛存在于豆類及動物的肝、腎等器官中，而在人和動物體內(nèi)不能由機體自身合成，只能從食物中攝取[14，16]。研究表明，某些真菌、放線菌和藍細菌能夠通過自身代謝合成麥角硫因[17]。

為探究湖北省側(cè)耳屬食用菌常見栽培種的主要營養(yǎng)成分，利用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定了12株側(cè)耳屬菌絲中洛伐他汀和麥角硫因的含量，并用常規(guī)方法測定了菌絲中灰分、粗蛋白、粗脂肪和總糖的含量，以期為側(cè)耳屬食用菌生物活性物質(zhì)的合理開發(fā)與利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

側(cè)耳屬菌種:糙皮側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)P650、糙皮側(cè)耳P712、糙皮側(cè)耳P615、糙皮側(cè)耳P380、糙皮側(cè)耳 P49、糙皮側(cè)耳 P6、糙皮側(cè)耳 P803、糙皮側(cè)耳PH2、糙皮側(cè)耳P03；淡紅側(cè)耳(Pleurotus djamor)P719；姬菇(Pleurotus cornucopiae)P51；杏鮑菇(Pleurotus eryngii)P30，側(cè)耳屬菌種保存于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所功能食品實驗室。

試驗前將側(cè)耳屬菌種接種至馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上，25℃恒溫靜置培養(yǎng)數(shù)天，待白色菌絲鋪滿整個平板，用小勺刮下菌絲體，凍干后粉碎，過80目篩后保存于4℃冰箱中備用。

1.2 主要試劑與儀器

洛伐他汀(純度≥98%)、麥角硫因(純度≥98%)標準品，上海金穗生物科技有限公司；色譜級乙腈，上?；裟犴f爾公司；純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

LC-20AT高效液相色譜儀(自配SIL-20A自動進樣器、SPD-M20A二極管陣列檢測器)，日本島津公司；Inert-Sustain C18色譜柱，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司；UV1800紫外可見分光光度計，島津企業(yè)管理(中國)有限公司；LX-300型冷卻水循環(huán)機，北京長流科學(xué)儀器公司；HH-2數(shù)字顯示恒溫水浴鍋，常州市國華儀器有限公司；KQ5200E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制 精密稱取洛伐他汀、麥角硫因標準品，置于100 mL棕色容量瓶中，用色譜級甲醇定容，搖勻，即得洛伐他汀(濃度為200 μg·mL-1)和麥角硫因標準品(濃度為100 μg·mL-1)貯存液，4℃條件下保存?zhèn)溆?。分別吸取上述兩種貯存液配置成2、5、10、20、50 μg·mL-1等不同濃度的標準液。 0.45 μm 微孔濾膜過濾后各取20 μL進樣，以標準品質(zhì)量濃度x(μg·mL-1)為橫坐標，標準品峰面積y為縱坐標繪制標準溶液曲線。

1.3.2 樣品溶液制備 參考Chen等[18]的方法并略作改動。精密稱取側(cè)耳屬食用菌樣品粉末2 g，加入15 mL 75%乙醇，攪拌均勻后450 W超聲處理50 min，然后5 000 r·min-1離心 20 min，取上清液用75%乙醇定容至20 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾后獲得洛伐他汀和麥角硫因的供試溶液。

1.3.3 色譜條件 洛伐他汀測定條件參考Chen等[18]的方法；麥角硫因測定條件參考Lin等[19]的方法。試驗所用色譜柱為Inert-Sustain C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相:乙腈-水[洛伐他汀70∶30(v/v)；麥角硫因 3 ∶97(v/v)]；流速 1.0 mL·min-1；洛伐他汀檢測波長238 nm，麥角硫因檢測波長254 nm；檢測時間 15 min；柱溫 30℃；進樣量 20 μL。

1.3.4 樣品中水分含量的測定 精密稱取樣品粉末0.5 g，平鋪于干燥的扁形稱量瓶中，打開瓶蓋在100～105℃干燥3 h，然后將瓶蓋蓋好，移置干燥器中冷卻30 min，精密稱量，再于上述溫度條件下干燥1 h，冷卻稱重，至連續(xù)2次稱重的差異不超過5 mg為止，根據(jù)減失的重量，計算樣品中的水分含量。

1.3.5 洛伐他汀和麥角硫因含量的計算 依照上述方法測定各供試樣品中水分含量及洛伐他汀、麥角硫因的濃度，按照公式計算各樣品中洛伐他汀和麥角硫因的含量:

洛伐他汀和麥角硫因的含量(μg·g-1)=

式中，C:供試品中洛伐他汀/麥角硫因的濃度(μg·mL-1)；M:樣品的質(zhì)量(g)；V:樣品溶液體積(20 mL)；W:樣品的水分含量(%)。

1.3.6 方法學(xué)驗證

1.3.6.1 精密度試驗 分別吸取質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1的洛伐他汀和麥角硫因標準品溶液，設(shè)定進樣量20 μL，重復(fù)進樣5次，測定色譜峰面積，計算相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)值。

1.3.6.2 重復(fù)性試驗 稱取糙皮側(cè)耳P380菌絲樣品5份，每份2 g，按照1.3.2所述方法制備待測溶液，按照1.3.3方法測定洛伐他汀和麥角硫因的含量并計算RSD值。

1.3.6.3 穩(wěn)定性試驗 稱取糙皮側(cè)耳P380菌絲樣品2 g，按照1.3.2所述方法制備待測溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h后進樣測定色譜峰面積，計算RSD值。

1.3.6.4 加標回收試驗 取已知洛伐他汀和麥角硫因含量的糙皮側(cè)耳P380菌絲樣品2份，每份2 g，分別加入相當于樣品中洛伐他汀和麥角硫因含量80%、100%、120%的標準品溶液，按照1.3.2所述方法制備待測溶液，按照1.3.3所述方法測定洛伐他汀和麥角硫因的含量。

1.3.7 樣品常規(guī)指標的測定 側(cè)耳屬食用菌菌絲中灰分的測定參照國標GB 5009.4-2016[20]的測定方法；菌絲中總糖的測定參照國標GB/T 15672-2009[21]的測定方法；菌絲中粗蛋白的測定參照國標GB/T 15673-2009[22]的測定方法；菌絲中粗脂肪的測定參照國標GB/T 15674-2009[23]的測定方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 洛伐他汀和麥角硫因標準曲線的繪制

以峰面積y對標準品的質(zhì)量濃度x(μg·mL-1)進行線性回歸[24]，繪制洛伐他汀、麥角硫因標準品的標準曲線。由圖1可知，洛伐他汀、麥角硫因濃度在2～50 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積相關(guān)性均較好，其標準曲線方程分別為y=59 879x＋2 112.5(R2=0.999 9)和y=59 190x-101 040(R2=0.999 1)。

圖1 洛伐他汀(A)及麥角硫因(B)標準品的標準曲線圖Fig.1 Standard curve of lovastatin(A)and ergothioneine(B)

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 試驗儀器精密度分析 由表1可知，連續(xù)進樣5次，洛伐他汀和麥角硫因峰面積的RSD值分別為0.41%和0.36%，表明在設(shè)定的色譜條件下儀器精密度良好。

表1 方法的精密度試驗結(jié)果Table1 Precision results of the methods

2.2.2 試驗方法重現(xiàn)性分析 由表2可知，樣品糙皮側(cè)耳P380中洛伐他汀和麥角硫因平均含量分別為42.00 μg·g-1和 52.25 μg·g-1，RSD 值分別為 2.13%和1.69%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

表2 方法的重現(xiàn)性試驗結(jié)果Table2 Repeatability results of the methods

2.2.3 試驗方法的穩(wěn)定性分析 由表3可知，樣品溶液放置不同時間后，洛伐他汀和麥角硫因峰面積的RSD值分別為1.57%和2.03%，表明在12 h內(nèi)供試樣品溶液穩(wěn)定性良好。

表3 方法的穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table3 Stability results of the methods

2.2.4 加標回收試驗 由表4可知，洛伐他汀的平均加標回收率為98.35%，RSD值為0.84%，樣品加標回收率在97.08%～99.63%之間；麥角硫因的平均加標回收率為98.54%，RSD值為0.74%，樣品加標回收率在97.62%～100.10%之間，表明試驗采用的HPLC法準確度良好。

2.3 側(cè)耳屬食用菌主要成分分析

由表5可知，12株側(cè)耳屬菌絲中灰分含量最高的是P615(6.65%)，含量最低的是P712(3.81%)，其他菌絲灰分含量在4.13%～6.11%之間。況丹[25]和韓志平等[26]分別測得平菇灰分為6.40%和7.78%，與本試驗結(jié)果差別不大。12株側(cè)耳屬菌絲中粗蛋白含量為11.18%～21.40%，其中 PH2的粗蛋白含量最高(21.40%)，其次是 P49(20.58%)、P380(19.89%)和P615(19.27%)，這4株菌絲中粗蛋白含量均高于況丹[25]的測定結(jié)果(19.08%)。12株側(cè)耳屬菌絲中粗脂肪的含量為0.65%～3.45%，況丹[25]測定平菇中粗脂肪為1.71%，于士軍等[27]測定平菇中粗脂肪為2.28%，這表明粗脂肪含量可能與菌株有關(guān)。12株側(cè)耳屬菌絲中總糖含量為15.18%～24.70%，顯著低于香菇(32.40%)、金針菇(47.89%)和杏鮑菇(52.1%)等[25]。

表4 樣品加標回收率試驗結(jié)果Table4 Adding standard recovery results of lovastatin and ergothioneine

由圖2可知，供試樣品中洛伐他汀、麥角硫因各自的出峰時間與標準品出峰時間接近，附近不存在干擾峰，分離度良好，檢測結(jié)果準確可靠。由表5可知，12株側(cè)耳屬菌絲均含有洛伐他汀(12.94～42.10 μg·g-1)和麥角硫因(13.59～61.25 μg·g-1)，但不同菌株菌絲中洛伐他汀和麥角硫因的含量差異較大，這表明洛伐他汀和麥角硫因的含量與菌種有較大關(guān)系。糙皮側(cè)耳P380 菌絲中洛伐他汀含量最高(42.10 μg·g-1)，P6 菌絲中洛伐他汀含量最低(12.94 μg·g-1)，二者相差3倍以上。麥角硫因含量最高的是 P49菌絲(61.25 μg·g-1)，其次是 P380 菌絲(51.70 μg·g-1)。 Chen等[18]測定了不同食藥用菌菌絲中洛伐他汀和麥角硫因的含量，發(fā)現(xiàn)不同菌種中洛伐他汀和麥角硫因含量差距較大，這與本研究結(jié)果相一致。

3 討論

洛伐他汀在側(cè)耳屬食用菌的子實體和菌絲中含量豐富，動物試驗顯示喂食一定量糙皮側(cè)耳干粉能顯著降低小鼠和兔子血液中膽固醇的含量[28-29]。此外，研究表明，洛伐他汀還具有一定的抗菌性及治療癌癥、骨骼疾病等功能[11，30]。麥角硫因作為一種水溶性硫醇化合物，具有良好的抗氧化活性，其抗氧化能力可與還原型谷胱甘肽、水溶性維生素E等相媲美[31]。Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)糙皮側(cè)耳子實體中含有豐富的麥角硫因，且動物試驗證實糙皮側(cè)耳的抗氧化活性與麥角硫因有關(guān)。本研究中，12株側(cè)耳屬食用菌菌絲中均檢測到洛伐他汀和麥角硫因，但不同菌株中洛伐他汀和麥角硫因含量差異較大，這可能是由于食用菌菌株不同引起的。12株側(cè)耳屬食用菌菌絲中，菌株P(guān)380洛伐他汀含量最高(42.10 μg·g-1)，麥角硫因含量(51.70 μg·g-1)僅次于菌株P(guān)49。此外，菌株P(guān)380菌絲中粗

脂肪含量最高(3.45%)，且粗蛋白和總糖含量均在20%左右，是12株側(cè)耳屬食用菌菌絲中營養(yǎng)成分含量相對較高的一個菌株，推測菌株P(guān)380可能是洛伐他汀和麥角硫因合成優(yōu)勢菌株。Sánchez[1]認為菌株品種、培養(yǎng)條件等因素對側(cè)耳屬食用菌的生長及次級代謝產(chǎn)物的積累影響較大。Atli等[32]和Alarcón等[33]研究發(fā)現(xiàn)側(cè)耳屬真菌中洛伐他汀等次級代謝產(chǎn)物的生成與培養(yǎng)基中C/N比例密切相關(guān)。因此，下一步研究可以菌株P(guān)380為目標菌株，通過優(yōu)化培養(yǎng)基營養(yǎng)比例、合理控制生長條件，進一步提高菌絲中洛伐他汀和麥角硫因的含量，為功能型飲品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

表5 側(cè)耳屬食用菌菌絲的主要成分Table5 The main nutrient components in different samples of Pleurotus mushroom

圖2 洛伐他汀和麥角硫因標準品及樣品的高效液相色譜圖Fig.2 The HPLC chromatography of lovastatin standard，ergothioneine standard and text samples

4 結(jié)論

本研究建立了側(cè)耳屬食用菌菌絲中洛伐他汀和麥角硫因含量的高效液相色譜檢測法，該方法簡便、快捷、結(jié)果準確。利用該方法對12株湖北省側(cè)耳屬常見栽培種菌絲中洛伐他汀和麥角硫因含量進行了測定，其中菌株P(guān)380中洛伐他汀和麥角硫因含量較高，分別為 42.10、51.70 μg·g-1，表明菌株 P380 是洛伐他汀和麥角硫因合成的優(yōu)勢菌株。此外，菌株P(guān)380營養(yǎng)成分含量在12株側(cè)耳屬食用菌中也相對較高，因此，菌株P(guān)380可作為菌絲液體發(fā)酵的優(yōu)良品種。