茅燕勇，陳大兵，潘星，李文謙

（1.淮陰工學(xué)院，江蘇淮安223003；2.淮安市三商農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇淮安 223300）

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，資源匱乏的問題愈發(fā)嚴(yán)重。我國有74%耕地土壤缺磷，難溶性磷酸鹽不能被植物直接利用，占土壤磷酸鹽總量的95%～99%[1-2]。雖然磷肥在農(nóng)業(yè)中已經(jīng)有較長時間的應(yīng)用，但磷源供應(yīng)不足已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要限制因素，提高土壤磷的利用是解決磷資源匱乏的有效方法，而通過解磷微生物的高效解磷是關(guān)鍵[3-4]。然而，由于微生物解磷機(jī)制復(fù)雜，解磷微生物肥料在該領(lǐng)域的作用并不明顯。

與此同時，當(dāng)代農(nóng)業(yè)污染已經(jīng)成為環(huán)境污染的主要方面[5]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大量排放的氮素、磷素等物質(zhì)通過地表徑流和滲漏是造成農(nóng)業(yè)面源污染的主要原因，而且土壤中存在大量的磷元素因無法被植物吸收利用而造成環(huán)境污染。目前，大多數(shù)研究者通過大田試驗或模擬試驗來預(yù)測污染，科學(xué)指導(dǎo)農(nóng)民施肥來緩解磷污染[6]。利用解磷微生物制成的肥料或菌劑直接施入土壤，在磷酸酶的作用下，難溶性有機(jī)大分子磷分解為小分子的無機(jī)磷，植物可以高效利用磷資源，不但減少了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中磷素的過量投入，而且可以將土壤中難溶性的磷溶解供植物吸收利用，在一定程度上減少了農(nóng)業(yè)磷污染[7-8]。在磷素吸收過程中磷酸酶發(fā)揮著重要作用[9]。本文對篩選于淮安市三商農(nóng)業(yè)科技有限公司梨樹根際土壤的解磷菌發(fā)酵產(chǎn)磷酸酶的條件進(jìn)行初步研究，以期為解磷菌制劑在果園土壤中的施用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌，為實驗室篩選于淮安市三商農(nóng)業(yè)科技有限公司梨樹根際土壤的菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，加入去離子水定容至1000mL，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10g，硫酸銨0.5g，氯化鈉0.3g，氯化鉀0.3g，七水合硫酸鎂0.3g，七水合硫酸亞鐵0.03g，一水合硫酸錳0.03g，磷酸二氫鉀2g，加去離子水定容至1000mL，pH 7.0～7.5。

1.2 方法

1.2.1 碳源種類與磷酸酶活性的關(guān)系

分別配制含不同碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、糊精、淀粉）的發(fā)酵培養(yǎng)基，將活化的枯草芽孢桿菌按10%的接種量接種，28℃，180r/min搖床培養(yǎng)24h。24h后檢測發(fā)酵液的吸光度值（600nm）、離心后上清液酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性。

1.2.2 氮源種類與磷酸酶活性的關(guān)系

分別配制含不同氮源（硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉、胰蛋白胨、磷酸氫二銨）的發(fā)酵培養(yǎng)基，將枯草芽孢桿菌種子液按10%的接種量接種，28℃，180r/min搖床培養(yǎng)24h。24h后檢測發(fā)酵液的吸光度值（600nm）、離心后上清液酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性。

1.2.3 磷酸鹽種類與磷酸酶活性的關(guān)系

配制含不同磷酸鹽（磷酸鐵、大豆卵磷脂、磷酸鈣、植酸鈣、磷酸二氫鉀）的發(fā)酵培養(yǎng)基，按10%的接種量接種枯草芽孢桿菌，28℃，180r/min搖床培養(yǎng)24h。24h后檢測發(fā)酵液的吸光度值（600nm）、離心后上清液酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性。

1.2.4 無機(jī)鹽離子濃度（Fe2+、Mg2+、Mn2+）與磷酸酶活性的關(guān)系

配制FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O含量分別為0.01g/L、0.03g/L、0.05g/L、0.07g/L、0.09g/L的培養(yǎng)基，以及MgSO4·7H2O含量分別為0.1g/L、0.3g/L、0.5g/L、0.7g/L、0.9g/L的培養(yǎng)基，按10%的接種量接種枯草芽孢桿菌，28℃，180r/min搖床培養(yǎng)24h。檢測發(fā)酵液的吸光度值（600nm）、離心后上清液酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性。

1.2.5 磷酸酶活性測定

將發(fā)酵液離心取上清，加入4mLMUB（檢測酸性磷酸酶時所用MUB試劑pH值為6.5，堿性磷酸酶時所用MUB試劑pH值為11），再加用相同緩沖液配制成的1 mL對硝基苯磷酸二鈉溶液，振蕩幾秒鐘，塞住瓶塞，37℃培養(yǎng)1h。培養(yǎng)后，加入lmL 0.5mol/L的氯化鈣和4mL 0.5mol/L氫氧化鈉，振蕩后用折疊濾紙過濾懸液，將澄清濾液在420nm比色。吸取標(biāo)準(zhǔn)對硝基酚溶液 0、l、2、3、4、5ml并定容至 5ml。加入1mL的0.5mol/L的氯化鈣溶液和4mL的0.5mol/L氫氧化鈉溶液,420nm比色。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及R2值：Y=0.6688X-0.0008 (R2=0.9997)。以每小時1L發(fā)酵液中作用于底物并釋放出產(chǎn)物的微摩爾數(shù)稱為1個酶活力單位，記為μmol/(L·h)[10]，通過上述回歸方程計算得磷酸酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源種類與磷酸酶活性的關(guān)系

碳源分為快速利用和緩慢利用的碳源。選擇不同種類的碳源培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，發(fā)酵液中的磷酸酶活性如圖1所示。由圖1可知，在以快速利用的葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的磷酸酶活性較高；在以緩慢利用的糊精和淀粉為碳源的培養(yǎng)基中，枯草芽胞桿菌產(chǎn)生的磷酸酶活性較低，原因是糊精和淀粉較難吸收利用，導(dǎo)致產(chǎn)生的磷酸酶活性較低。

圖1 不同碳源培養(yǎng)基條件下的磷酸酶活性

2.2 氮源種類與磷酸酶活性的關(guān)系

分別選擇有機(jī)氮源胰蛋白胨和無機(jī)氮源硫酸銨、氯化銨等作為氮源進(jìn)行枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在不同種類無機(jī)氮源的培養(yǎng)基中，枯草芽胞桿菌產(chǎn)生的磷酸酶活性變化不是很大，當(dāng)以胰蛋白胨培養(yǎng)時，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性都較高，可能胰蛋白胨是有機(jī)氮源，含有較多能夠提高磷酸酶活性的微量元素或有益離子。

圖2 添加不同氮源培養(yǎng)后產(chǎn)生的磷酸酶活性

2.3 磷酸鹽種類與磷酸酶活性的關(guān)系

分別選擇無機(jī)和有機(jī)磷源培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)基中的磷酸鹽為植酸鈣和磷酸二氫鉀時，產(chǎn)生的酸性和堿性磷酸酶活性都較高，且含菌量較高，因此，溶磷效果較高；培養(yǎng)基中添加磷酸鐵后，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的磷酸酶活性都較低，可能磷酸鐵對枯草芽孢桿菌有毒性效果，影響了菌株正常生長，或其對磷酸酶活性有抑制作用，導(dǎo)致磷酸酶活性較低。

圖3 添加不同磷酸鹽培養(yǎng)后產(chǎn)生的磷酸酶活性

2.4 Fe2+離子對磷酸酶活性的影響

不同F(xiàn)e2+離子濃度條件下的酸性和堿性磷酸酶活力如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)基中Fe2+的含量在0.01～0.05g/L時，菌株產(chǎn)生的磷酸酶活性隨著培養(yǎng)基中Fe2+含量的增加而提高，當(dāng)培養(yǎng)基中Fe2+的含量在0.05g/L時，菌體生長最好，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性最高，酸性磷酸酶活性最高達(dá)到436.2μmol/(L·h)，堿性磷酸酶活性最高達(dá)到376.4μmol/(L·h)；隨著培養(yǎng)基中Fe2+的含量的繼續(xù)增加，菌體的量開始減少，產(chǎn)生的磷酸酶活性也開始降低。

圖4 添加不同濃度Fe2+產(chǎn)生的磷酸酶活性

2.5 Mg2+離子對磷酸酶活性的影響

由圖5可知，在含有不同濃度Mg2+的培養(yǎng)基中，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的酸性磷酸酶活性變化不是很大，當(dāng)Mg2+含量的為0.7g/L時，酸性磷酸酶活性最高，達(dá)到239.6μmol/(L·h)，堿性磷酸酶活性最高達(dá)182.8μmol/(L·h)。

圖5 添加不同濃度Mg2+產(chǎn)生的磷酸酶活性

2.6 Mn2+離子對磷酸酶活性的影響

添加不同濃度的Mn2+進(jìn)行枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)，測定其酸性和堿性磷酸酶活性結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，在含有不同濃度Mn2+的培養(yǎng)基中，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的磷酸酶活性較低。在Mn2+的含量為0.07g/L時，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的堿性磷酸酶活性最高，達(dá)到115.6μmol/(L·h)。

圖6 添加不同濃度Mn2+產(chǎn)生的磷酸酶活性

3 結(jié)論

本文對枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)磷酸酶的條件進(jìn)行了研究，在以葡萄糖為碳源、胰蛋白胨為氮源、Fe2+、Mg2+和Mn2+的濃度分別為0.05g/L、0.7g/L、0.07g/L的條件下，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生磷酸酶活性最高，其中酸性磷酸酶活性最高達(dá)436.2μmol/(L·h)，堿性磷酸酶活性最高達(dá)376.4μmol/(L·h)。