張善磊，岳紅亮，趙春芳，陳 濤，張亞?wèn)|，周麗慧，趙 凌，梁文化，王才林

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心，國(guó)家水稻改良中心南京分中心，江蘇 南京 210014)

水稻是我國(guó)最重要的糧食作物，其產(chǎn)量和品質(zhì)指標(biāo)直接關(guān)系到商品價(jià)值和種植推廣[1-2]。豐富優(yōu)異的種質(zhì)資源是新品種選育和遺傳改良工作的基礎(chǔ)，而種質(zhì)資源親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近和遺傳多樣性的高低則是育成品種產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性突破的關(guān)鍵[3]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)研究的深入，利用分子標(biāo)記從DNA水平對(duì)水稻群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性研究較多。鄧宏中等[4]發(fā)現(xiàn)，選育品種的等位基因數(shù)及稀有等位基因數(shù)顯著低于地方品種。陳錦文等[5]揭示云南哈尼族當(dāng)前栽培水稻的遺傳基礎(chǔ)較狹窄，多樣性較低。遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，可揭示不同材料的遺傳狀況，規(guī)避遺傳背景相似的親本組合，降低育種工作量，拓寬育成品種間的遺傳距離，同時(shí)也是重要農(nóng)藝性狀的優(yōu)異等位基因關(guān)聯(lián)挖掘工作的基礎(chǔ)。

胚乳中淀粉的品質(zhì)是稻米蒸煮食味品質(zhì)的主要決定因素，其生物合成的遺傳調(diào)控系統(tǒng)非常復(fù)雜，涉及的基因有20多個(gè)，包括ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大小亞基的編碼基因AGPlar、AGPsma、AGPis；顆粒結(jié)合淀粉合成酶的編碼基因Wx、GBSSⅡ；可溶性淀粉合成酶的編碼基因SSⅠ、SSⅡa、SSⅡb、SSⅡc、SSⅢa、SSⅢb、SSⅣa、SSⅣb；淀粉分支酶的編碼基因SBE1、SBE3、SBE4及脫分支酶的編碼基因ISA、PUL等[6-7]。已有研究表明，每個(gè)基因都存在數(shù)目不一的復(fù)等位基因變異，這些復(fù)等位基因?qū)Φ久椎耐庥^品質(zhì)，尤其是蒸煮食味品質(zhì)具有顯著影響。王才林等[8]將水稻蠟質(zhì)基因Wx的等位變異型Wx-mq在水稻育種中進(jìn)行廣泛應(yīng)用，育成一系列食味品質(zhì)優(yōu)良的粳稻品種南粳46、南粳5055、南粳9108等，在江蘇及周邊地域進(jìn)行了大面積推廣。水稻特別是栽培品種中淀粉合成相關(guān)基因優(yōu)異變異位點(diǎn)的發(fā)掘，對(duì)水稻優(yōu)質(zhì)育種中食味品質(zhì)性狀的改良具有重要意義。

本研究利用來(lái)源于18個(gè)淀粉合成相關(guān)基因的34個(gè)分子標(biāo)記對(duì)國(guó)內(nèi)外181份粳稻栽培品種的等位基因變異進(jìn)行檢測(cè)，并結(jié)合185個(gè)水稻基因組上均勻分布的SSR/Indel標(biāo)記，共219個(gè)分子標(biāo)記，對(duì)群體結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系進(jìn)行了詳細(xì)分析，以明確淀粉合成相關(guān)基因的遺傳多樣性及當(dāng)前粳稻栽培品種特別是江蘇省內(nèi)品種的遺傳結(jié)構(gòu)現(xiàn)狀，為粳稻新品種選育過(guò)程中親本的選配、優(yōu)質(zhì)基因的充分利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料181份粳稻，包括：江蘇地區(qū)粳稻品種76份；遼寧地區(qū)粳稻品種12份；山東地區(qū)粳稻品種10份；黑龍江地區(qū)粳稻品種9份；浙江地區(qū)粳稻品種8份；天津地區(qū)粳稻品種7份；河南、寧夏和云南地區(qū)粳稻品種各6份；吉林地區(qū)粳稻品種5份；新疆地區(qū)粳稻品種4份；貴州地區(qū)粳稻品種2份；北京、河北、陜西、上海地區(qū)粳稻品種各1份；國(guó)外粳稻品種26份，含23份日本粳稻、2份韓國(guó)粳稻和1份蘇聯(lián)粳稻。供試材料均種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所試驗(yàn)田。2016年5月13日播種，6月13日移栽，每個(gè)品種種植4行，每行12株，株行距13.3 cm×26.7 cm，常規(guī)栽培方式管理。

1.2 DNA提取和標(biāo)記檢測(cè)

水稻分蘗盛期采集各品種幼嫩的新鮮葉片，采用盧揚(yáng)江等[9]的CTAB法并略作修改提取基因組DNA。選取均勻分布于水稻12條染色體上的185個(gè)多態(tài)性SSR/Indel標(biāo)記和34個(gè)淀粉合成相關(guān)基因分子標(biāo)記(強(qiáng)新濤等[10])對(duì)供試材料進(jìn)行遺傳分析。引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

1.3 PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)

10 μL的PCR反應(yīng)總體系包含：ddH2O 7.2 μL，模板DNA(20 ng/μL)1 μL，10×Buffer(25.0 mmol/L)1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)0.2 μL，正反向引物(10 μmol/L)0.4 μL，TaqDNA聚合酶(2 U/μL)0.2 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，46～58 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

SSR/Indel引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在9%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，銀染后在膠片觀察燈上拍照、統(tǒng)計(jì)多態(tài)性條帶；CAPS標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后在2%～3%濃度的瓊脂糖凝膠上電泳分離，DuRed核酸燃料染色后，在紫外凝膠成像儀上觀察記載。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增圖譜，按多態(tài)性條帶遷移位置不同次序編號(hào)(如“1/1”、“2/2”等)，無(wú)條帶記為“?/?”。標(biāo)記統(tǒng)計(jì)結(jié)果使用PowerMarker v3.25軟件[11]進(jìn)行遺傳多樣性分析，分別計(jì)算等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、多態(tài)信息含量(PIC)及品種間的Nei′s遺傳距離，采用Nei′s遺傳距離按非加權(quán)配對(duì)法(UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)分析[11-12]，使用NTSYSpc version 2.1軟件[13]對(duì)181份粳稻栽培品種進(jìn)行基于Nei′s遺傳距離的主成分分析。

使用Structure 2.3.4軟件[14]對(duì)181份粳稻栽培品種進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，粳稻群體亞群數(shù)K值設(shè)為1～15，將軟件運(yùn)行時(shí)的參數(shù)迭代(Length of burn-in period)設(shè)為50 000，蒙特卡羅迭代(Marko chain monte carlo, MCMC)設(shè)為100 000，每個(gè)K值重復(fù)運(yùn)行5次，依據(jù)似然值最大的原則,分析群體最佳亞群數(shù)K值。計(jì)算所有品種在各個(gè)亞群中的Q值，以Q值大于0.5作為亞群歸類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，若某一品種在所有亞群中的Q值均小于0.5，表明該品種的遺傳組分較豐富，應(yīng)歸類(lèi)到混合亞群中[15]。

基于219個(gè)分子標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果，使用SPADiGe version 1.4c軟件[16]對(duì)181份粳稻栽培品種進(jìn)行親緣關(guān)系分析。親緣關(guān)系矩陣中的負(fù)值表明，這2份品種間的親緣關(guān)系小于其他任意2份品種，故統(tǒng)計(jì)時(shí)將其值設(shè)為0[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記檢測(cè)及淀粉合成相關(guān)基因標(biāo)記的多態(tài)性分析

利用219個(gè)分子標(biāo)記對(duì)181份粳稻栽培品種進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，結(jié)果表明,所有分子標(biāo)記在供試材料中均可檢測(cè)到多態(tài)性(圖1)。219個(gè)標(biāo)記共檢測(cè)到665個(gè)等位變異，平均為3.037個(gè)?；蚨鄻有灾笖?shù)變幅為0.011～0.766，平均為0.264。多態(tài)信息含量(PIC)變幅為0.011～0.727，平均為0.235，中度多態(tài)位點(diǎn)(0.250.50)有20個(gè)。

1.南粳46；2.南粳49；3.南粳5055；4.南粳9108；5.常農(nóng)粳5號(hào)；6.華粳3號(hào)；7.蘇香粳1號(hào)；8.鹽豐47；9.鐵粳7號(hào)；10.龍粳25號(hào)；11.津稻263；12.圣稻15；13.臨稻13；14.浙粳59；15.蘇秀10號(hào)；16.寧粳12號(hào)；17.伊粳12號(hào)；18.畢粳44號(hào)；19.中國(guó)91；20.農(nóng)林24；21.農(nóng)林229；22.一品；23.京稻2號(hào)；24.遼粳10號(hào)。

群體內(nèi)34個(gè)淀粉合成相關(guān)基因分子標(biāo)記共檢測(cè)到74個(gè)等位變異，變幅為2～4個(gè)，平均每個(gè)標(biāo)記檢測(cè)到的等位基因數(shù)為2.176個(gè)，在Wx基因第一內(nèi)含子剪切點(diǎn)上游的(CT)n微衛(wèi)星序列的標(biāo)記L05中，可檢測(cè)到4個(gè)等位基因。L10、L11等29個(gè)標(biāo)記均只檢測(cè)到2個(gè)等位基因。基因多樣性指數(shù)變幅為0.011～0.494，平均為0.148，Wx、SSSⅢ-2、PUL基因變異率較高，而SSSⅠ基因的等位變異率最低。多態(tài)信息含量(PIC)變幅為0.011～0.399，平均為0.128，中度多態(tài)位點(diǎn)(0.250.50)(表1)。

2.2 粳稻栽培品種群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于219個(gè)分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果，對(duì)181份粳稻栽培品種進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。發(fā)現(xiàn)LnP(D)值隨著K=1～15持續(xù)增大，無(wú)明顯峰值，不能確定最佳亞群數(shù)K(圖2-A)。根據(jù)Evanno等[17]方法，當(dāng)K=3和5時(shí)，ΔK分別取得第1峰值和第2峰值，即181份粳稻品種可分成3或5個(gè)亞群(圖2-B)。根據(jù)各品種在不同亞群中的Q值，以遺傳成分值大于0.5作為亞群歸類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明，98.34%的品種遺傳結(jié)構(gòu)比較單一，分別歸類(lèi)到3個(gè)相應(yīng)的亞群中，1.66%的品種遺傳背景比較復(fù)雜，被歸類(lèi)到一個(gè)混合亞群中(圖2-C)。在亞群分布上，歸類(lèi)于第1亞群(POP1)的粳稻品種有中國(guó)91(日本)、農(nóng)林229(日本)和一品(韓國(guó))，占供試材料的1.66%。歸類(lèi)于第2亞群的粳稻品種有79份，占供試材料的43.65%，主要來(lái)源于長(zhǎng)江中下游地區(qū)和貴州；歸類(lèi)于第3亞群的粳稻品種有96份，占供試材料的53.04%，除貴州外，來(lái)源地區(qū)相對(duì)廣泛。歸類(lèi)于混合亞群的品種有TD70(江蘇)、農(nóng)林24(日本)和香血糯(江蘇)，占供試材料的1.66%。

表1 粳稻栽培品種中淀粉合成相關(guān)基因分子標(biāo)記的遺傳變異Tab.1 Genetic variation of molecular markers of starch synthesis-related genes in Japonica rice cultivars

2.3 粳稻栽培品種聚類(lèi)和主成分分析

基于Nei′s遺傳距離的聚類(lèi)分析表明，粳稻品種可被分成離散程度較好的4大類(lèi)。來(lái)自云南的楚粳27單獨(dú)聚為Ⅰ類(lèi)；類(lèi)群Ⅱ包含12份粳稻品種，占供試材料的6.63%，其中，63.9%的品種來(lái)源于東北和日本；類(lèi)群Ⅲ由龍粳24號(hào)、松遼1號(hào)、鹽粳48號(hào)等36份品種組成，占供試材料的19.89%，包含22份國(guó)內(nèi)品種、13份日本品種和1份韓國(guó)品種；類(lèi)群Ⅳ由132份品種組成，占供試材料的72.93%，其中，長(zhǎng)江中下游地區(qū)(江蘇、浙江、山東等)粳稻品種大多聚于此類(lèi)群的左側(cè)分支中，而遼寧、天津及日本等地區(qū)的粳稻品種大多聚于此類(lèi)群的右側(cè)分支中。結(jié)合Structure分析，同一亞群的粳稻品種大多聚集在同一類(lèi)群分支上，而混合亞群的粳稻品種分布較為分散(圖2-D)。因此，181份粳稻品種可分成3個(gè)亞群和一個(gè)混合群，即K=3為該粳稻群體的最佳亞群數(shù)。

主成分分析表明，181份粳稻栽培品種可分成3個(gè)亞群(POP1、POP2、POP3)和一個(gè)混合群(Mixed)，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)分別解釋了48.2%和12.5%的遺傳變異，與群體聚類(lèi)結(jié)果基本一致，進(jìn)一步對(duì)群體遺傳結(jié)構(gòu)中亞群的劃分進(jìn)行了驗(yàn)證(圖2-E)。

A.對(duì)數(shù)似然函數(shù)值LnP(D)隨亞群數(shù)增加的變化；B.隨亞群數(shù)增加ΔK值的變化；C.K=3和5時(shí)，基于219個(gè)分子標(biāo)記的粳稻群體遺傳結(jié)構(gòu)；D.粳稻群體基于Nei′s遺傳距離的系統(tǒng)聚類(lèi)，紅色、綠色、藍(lán)色和紫色分別代表亞群1(POP1)、亞群2(POP2)、亞群3(POP3)和混合亞群(Mixed)；E.粳稻群體主成分分析。

2.4 粳稻栽培品種親緣關(guān)系分析

親緣關(guān)系分析表明,品種間親緣關(guān)系系數(shù)小于0.5的占99.7%，多數(shù)系數(shù)在0.1以下。其中，品種間親緣關(guān)系系數(shù)為0的占56.0%；親緣關(guān)系系數(shù)為0.0～0.1的占27.2%；親緣關(guān)系系數(shù)為0.1～0.2的占11.7%；親緣關(guān)系系數(shù)為0.2～0.3的占3.6%；親緣關(guān)系系數(shù)為0.3～0.4的占0.9%；親緣關(guān)系系數(shù)為0.4～0.5的占0.3%；親緣關(guān)系系數(shù)大于0.5的僅占0.3%(圖3)。表明供試材料來(lái)源較廣，群體內(nèi)個(gè)體間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

不同品種間的遺傳多樣性差異和親緣關(guān)系遠(yuǎn)近是評(píng)價(jià)作物種質(zhì)資源狀況、培育突破性品種的重要依據(jù)。前人對(duì)粳稻遺傳多樣性已有較多研究，張科等[18]利用62個(gè)SSR標(biāo)記分析黑龍江省近年審定的73個(gè)水稻品種，遺傳相似性均值為0.759。羅兵等[19]利用24個(gè)SSR標(biāo)記分析太湖地區(qū)42份粳稻品種，遺傳相似性系數(shù)均值為0.610。樊傳章等[20]利用77個(gè)SSR標(biāo)記分析云南及不同地理分布的粳稻，多態(tài)信息含量均值為0.62。本研究中，219個(gè)分子標(biāo)記共檢測(cè)到665個(gè)等位變異，基因多樣性指數(shù)均值為0.264，多樣性較低。多態(tài)信息含量均值為0.235，其中，中度以上的多態(tài)位點(diǎn)有93個(gè)。

圖3 181份粳稻栽培品種的親緣關(guān)系系數(shù)分布Fig.3 Distribution of kinship coefficients in 181 Japonica rice cultivars

34個(gè)淀粉合成相關(guān)基因的分子標(biāo)記共檢測(cè)到74個(gè)等位變異，基因多樣性指數(shù)均值為0.148，多態(tài)信息含量均值為0.128，低于強(qiáng)新濤等[10]基于秈稻栽培品種的研究結(jié)果，可見(jiàn)粳稻栽培品種中淀粉合成相關(guān)基因的遺傳多樣性明顯小于秈稻。Wx基因的CT重復(fù)序列可在基因表達(dá)水平上影響胚乳中直鏈淀粉的合成，而SSSⅡ-3和PUL基因?qū)ε呷橹ф湹矸鄣暮铣杉胺种ф溠由炱鹬匾饔?，其中SSSⅡ-3是決定糊化溫度的主效基因。本研究中，這3個(gè)基因位點(diǎn)均表現(xiàn)出較高的等位變異率，在Wx的(CT)n位點(diǎn)檢測(cè)到4個(gè)等位基因，在SSSⅡ-3(Y12)和PUL(Y37)位點(diǎn)上均檢測(cè)到3個(gè)等位基因，高于敖雁等[21]的檢測(cè)結(jié)果。Wx(CT)n位點(diǎn)在鹽糯12、南粳9108、日本晴、一品等江蘇和日本粳稻品種中的變異率較其他地區(qū)高。SSSⅡ-3(Y12)位點(diǎn)的稀有變異主要存在于南粳46、鎮(zhèn)稻16號(hào)、武運(yùn)粳19號(hào)等江蘇育成品種中。PUL(Y37)位點(diǎn)的稀有變異主要存在于農(nóng)林229、遼粳10號(hào)、龍粳24號(hào)等具有日本粳稻血緣的品種中。后期將通過(guò)分析這些位點(diǎn)與供試材料中的稻米食味品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性，從而評(píng)估這些多態(tài)位點(diǎn)的育種利用價(jià)值。

通過(guò)群體遺傳結(jié)構(gòu)、聚類(lèi)和主成分分析，181份粳稻栽培品種的群體分類(lèi)結(jié)果是相似的，呈現(xiàn)明顯的地域傾向性，地理位置相近的品種大都聚于同一大類(lèi)群中，地理位置相同或處在同一積溫帶的品種大都聚于同一類(lèi)群的亞類(lèi)群中，如類(lèi)群Ⅱ包含的品種63.9%來(lái)源于東北和日本，類(lèi)群Ⅳ包含的品種主要來(lái)源于遼寧、天津和長(zhǎng)江中下游地區(qū)，類(lèi)群內(nèi)左側(cè)亞類(lèi)群的粳稻品種大多來(lái)源于長(zhǎng)江中下游地區(qū)(江蘇、浙江、山東等)，而右側(cè)亞類(lèi)群以東北、天津和日本粳稻為主。較其他品種，歸類(lèi)于混合亞群(Mixed)的TD70(江蘇)、農(nóng)林24(日本)和香血糯(江蘇)具有更為豐富的遺傳多樣性，后期可作育種親本加以利用。

受自然環(huán)境和生產(chǎn)需求的影響，不同地區(qū)的育種目標(biāo)有所不同，導(dǎo)致育成品種在農(nóng)藝性狀、生理生化和遺傳基礎(chǔ)上存在較大差異[22]。馬作斌等[23]發(fā)現(xiàn)，水稻品種之間的遺傳差異與緯度和地理距離有很大關(guān)系，緯度相近的國(guó)家或地區(qū)的水稻品種之間的遺傳距離較近，而緯度較遠(yuǎn)的國(guó)家或地區(qū)的水稻品種之間的遺傳距離較遠(yuǎn)。徐振華等[22]認(rèn)為，地理位置相對(duì)較近的材料間，具有較近親緣關(guān)系，反之，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本研究中親緣關(guān)系系數(shù)大于0.5的僅占0.3%，其中，江蘇育成品種間親緣關(guān)系系數(shù)大于0.5的占0.6%，可見(jiàn)，粳稻群體內(nèi)大部分品種間存在較大的遺傳差異，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而少數(shù)來(lái)源于同一地區(qū)或地理分布上臨近的品種，親緣關(guān)系較近，同一育種單位育成品種間的親緣關(guān)系系數(shù)會(huì)更高，如江蘇的鎮(zhèn)稻14號(hào)與鎮(zhèn)稻16號(hào)，鹽粳9號(hào)與淮稻5號(hào)，其親緣關(guān)系系數(shù)值均大于0.7，這可能與骨干親本來(lái)源有關(guān)。因此，針對(duì)省內(nèi)品種遺傳基礎(chǔ)狹窄性，要強(qiáng)化省外、國(guó)外等地理位置較遠(yuǎn)地區(qū)粳稻品種的引進(jìn)和利用，尤其注意發(fā)掘和利用淀粉合成相關(guān)基因的優(yōu)異等位變異，在粳稻育種過(guò)程中，考慮育種材料目標(biāo)性狀的同時(shí)，應(yīng)盡量拓寬親本材料間的遺傳基礎(chǔ)，培育出遺傳多樣性豐富的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)多抗廣適水稻新品種。