喬怡然 倪文麗 孫穎 王斌 靳蕾 李智文 王琳琳 任愛國

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一類由2個或2個以上苯環(huán)以稠環(huán)方式形成的化合物，主要來自于化石燃料(如煤炭、石油)和生物質(如木材、煙草、秸稈)的不完全燃燒。PAHs在環(huán)境中分布廣泛，主要通過呼吸道和消化道進入人體。大量研究顯示，PAHs具有廣泛的不良健康效應，如增加腫瘤發(fā)生風險、造成不良妊娠結局等[1,2]。唇腭裂(orofacial clefts)是發(fā)生于胚胎發(fā)育第4～12周的先天性口面部畸形。2011年我國圍產期出生缺陷監(jiān)測數(shù)據顯示，總唇裂出生患病率為11.43/萬，僅次于先天性心臟病和多指(趾)，位居第三[3]。美國一項針對PAHs職業(yè)暴露的病例對照研究發(fā)現(xiàn)，唇裂(伴或不伴腭裂)患兒母親PAHs職業(yè)暴露水平顯著高于對照組，且具有劑量反應關系；而單純腭裂則不存在這種關聯(lián)[4]。對山西省四縣的研究發(fā)現(xiàn)，被動吸煙、燃煤取暖與唇腭裂發(fā)生風險存在關聯(lián)，并且顯示出明顯的劑量反應趨勢[5]。煙草煙霧內含有PAHs、尼古丁、煙焦油等多種有害物質；煤炭燃燒的煙霧中還存在大量粉塵、硫化物、氮氧化物等。基于問卷中有關吸煙或煤炭燃燒的研究無法確定何種物質對后代唇腭裂存在影響。由于胎兒發(fā)育所處的宮內環(huán)境不直接暴露于外界環(huán)境，胎兒與母體通過胎盤屏障存在血液交換且具有個體差異，對孕婦外環(huán)境的暴露評估不能有效地評價胎兒的暴露情況。因此選擇適宜的生物樣品，通過檢測內暴露標志物，分析環(huán)境暴露與唇腭裂風險之間的關聯(lián)性更為客觀。本研究擬通過檢測胎盤組織內PAHs濃度，分析PAHs水平與唇腭裂風險之間的關聯(lián)性。

對象與方法

一、對象

本研究采用病例對照研究設計，病例為2003-2016年間在山西省六個縣/市募集的有胎盤組織標本的所有唇腭裂病例，共103例；從同期募集的有胎盤組織的509例無缺陷新生兒中隨機抽取103例作為對照。

納入條件為：病例為產前診斷引產或足月分娩時診斷的唇腭裂患兒，對照為無任何異常的、非醫(yī)學原因引產的胎兒或足月新生兒。病例與對照組母親均為當?shù)爻Ｗ【用?在當?shù)鼐幼　?年)，妊娠期間也在本地居住；簽署知情同意書，采集胎盤組織標本。本研究獲得北京大學生物醫(yī)學倫理委員會批準。

二、方法

1.問卷調查：調查員為當?shù)貗D幼保健院醫(yī)生，經過統(tǒng)一培訓，使用結構式調查表對病例和對照母親或家屬進行面對面調查，內容包括孕婦一般情況、末次月經日期、圍孕期(孕前3個月～孕早期)疾病和藥物使用、行為習慣、飲食與葉酸增補、環(huán)境污染物暴露、出生缺陷家族史、產前診斷、胎兒性別等信息。

2.生物樣品采集：研究對象簽署知情同意書后，在引產或足月產時收集胎盤組織標本。拭去母親面浮血，從胎兒面臍根處向外剪取約10 g胎盤組織，超純水清洗后剪碎，于凍干機中-51 °C，0.035 mbar凍干40 h。

3.儀器及試劑：本研究采用氣相色譜-質譜法，檢測美國環(huán)保署提出的16種優(yōu)先控制的PAHs。所用儀器為Agilent GC-MS:7890B-5977A，使用電子電離轟擊源(Agilent，美國)；DB-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，弱極性色譜柱，Agilent，美國)。PAHs混合標準品包括：萘(NAP)、苊烯(ANY)、苊(ACE)、芴(FLU)、菲(PHE)、蒽(ANT)、熒蒽(FLO)、芘(PYR)、苯并[a]蒽(BAA)、艸屈(CHR)、苯并[b]熒蒽(BBF)、苯并[k]熒蒽(BKF)、苯并[a]芘(BAP)、茚并[1,2,3-cd]芘(I1P)、二苯并[a,h]蒽(DahA)、苯并[ghi]芘(BghiP)，產自Dr.Ehrenstorfer公司(德國)。PAHs的定量檢測使用三種內標分別為苊-D10 (ACE-D10)、蒽-D12 (ANT-D10)和艸屈-D12 (CHR-D12)，使用兩種回收率指示物菲-D10 (PHE-D10)和芘-D10 (PYR-D10)，均產自Dr.Ehrenstorfer公司(德國)，平均回收率在80%～120%之間視為有效。

試劑包括：正己烷(HEX，農殘級)和硅膠(色譜級，平均孔徑60A，0.063-0.100 mm)購于Merck試劑公司；二氯甲烷(DCM，色譜級)購于J.T.Baker公司；無水硫酸鈉(分析純)購于國藥集團化學試劑有限公司；中性氧化鋁購于MP Biomedicals公司。凝膠滲透色譜柱型號為CLNpak EV-2000(Shodex，日本)。所有玻璃儀器、鋁箔及玻璃纖維濾膜使用前在馬弗爐內450 ℃烘烤6 h，無水硫酸鈉需650 ℃烘烤6 h。

4.胎盤組織PAHs提取及檢測：凍干的胎盤組織置于脂肪提取器中，加入20 ng PAHs回收率指示物(PHE-D10 & PYR-D10)，使用120 ml DCM作為提取液，56 ℃水浴24 h，提取脂肪及目標化合物。提取后將溶劑蒸發(fā)至近干，通風櫥內敞口靜置1 h后稱量平底燒瓶和粗脂肪的總重量，總重與平底燒瓶質量之差即為粗脂肪質量。凝膠色譜儀(GPC)對樣品進行粗凈化，DH11 (DCM:HEX 1:1 v:v)作流動相，流速為5 ml/min，接取9～22 min流出液用于分析PAHs。使用氧化鋁-硅膠混合層析柱(內徑6 mm)凈化樣品，裝柱填料從下到上依次為氧化鋁(6 cm，2%水去活)、硅膠(6 cm,2%水去活)和無水硫酸鈉(1 cm)。使用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、電子電離轟擊源對特征離子及保留時間進行定性和定量分析。胎盤組織中PAHs的濃度以粗脂肪質量進行調整，表示為ng/g脂肪。對檢測含量在定性檢出限(LOD)和定量檢出限(LOQ)之間的物質，在統(tǒng)計分析時使用1/2 LOQ進行調整。

5.統(tǒng)計學處理：采用SPSS 24.0進行數(shù)據處理和分析。通過χ2檢驗比較唇腭裂病例組和對照組的母親一般特征。由于目標物質含量不服從正態(tài)分布，使用非參數(shù)檢驗比較病例組與對照組之間胎盤組織PAHs濃度的差異。以對照組胎盤組織PAHs中位濃度為界值進行分組，根據文獻中可能與唇腭裂發(fā)生存在關聯(lián)的因素進行調整，采用非條件Logistic回歸進行多因素分析，獲得調整混雜因素后污染物濃度與唇腭裂發(fā)病風險之間的關聯(lián)。PAHs水平與唇腭裂發(fā)生風險使用OR值和95%置信區(qū)間(95%CI)表示。使用Pearson相關或Spearman相關探究PAHs濃度的影響因素及PAHs濃度與孕周之間的關系。統(tǒng)計分析采用雙側檢驗，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、研究對象一般特征

103例病例(單純唇裂40例，單純腭裂6例，唇裂合并腭裂57例)及103例對照的一般特征如表1所示。病例組母親平均年齡(26.1±4.8)歲，對照組平均年齡(26.5±4.6)歲。將年齡按<25、25～29、30～34及≥35歲分為四組，病例組與對照組年齡分布無統(tǒng)計學差異(P=0.590)。病例組婦女孕前平均BMI為(23.1±4.3)kg/m2，對照組平均BMI為(22.6±3.8)kg/m2，按<18.5、18.5～23.9、≥24.0分為三組，病例組與對照組不同營養(yǎng)狀況之間分布無統(tǒng)計學差異(P=0.565)。研究對象的孕周均在19～46周之間，病例組孕婦平均孕周為(36.7±5.6)周，對照組平均孕周為(39.5±2.8)周，以孕37周為界分為兩組，病例組與對照組之間平均孕周存在統(tǒng)計學差異(P<0.001)。此外，病例組與對照組相比在胎兒性別方面男性多于女性(P=0.022)；在出生缺陷胎兒生育史、圍孕期感冒發(fā)熱、吸煙/被動吸煙方面病例組高于對照組；在做飯燃料類型分布上病例組更多使用煙煤作為燃料(P=0.001)。病例組與對照組之間母親職業(yè)、受教育程度、孕期是否采暖不存在統(tǒng)計學差異。

表1唇腭裂病例和健康對照的一般特征

Table1Characteristics of demographic and environmental exposure among orofacial cleft cases and controls [n(%)]

CharacteristicControlsCasesMaternal age (years) <2544 (43.1)46 (46.0) 25～2932 (31.4)36 (36.0) 30～3419 (18.6)12 (12.0) ≥357 (6.9)6 (6.0)Body mass index (kg/m2) <18.513 (12.9)10 (10.1) 18.5～23.958 (57.4)53 (53.5) ≥24.030 (29.7)36 (36.4)Occupation Farmer77 (74.8)66 (64.1) Other26 (25.2)37 (35.9)Education Primary or lower4 (3.9)7 (6.8) Junior high60 (58.3)60 (58.3) High school or above39 (37.9)36 (35.0)Gestational week# 19～365 (5.0)24 (24.7) ≥3795 (95.0)73 (75.3)Infant sex* Male46 (46.9)62 (63.3) Female52 (53.1)36 (36.7)History of birth-affected pregnancy* Yes0 (0.0)5 (5.0) No102 (100.0)96 (95.0)Maternal flu or fever in early pregnan-cy# Yes15 (14.7)36 (35.6) No87 (85.3)65 (64.4)Smoking or passive smoking# None68 (66.0)48 (46.6) Sometimes25 (24.3)24 (23.3) Daily10 (9.7)31 (30.1)Primary fuel used for cooking# Coal11 (11.5)31 (30.4) Other85 (88.5)71 (69.6)Conceiving during the heating season Yes51 (52.0)54 (53.5) No47 (48.0)47 (46.5)

*Compared with control group,P<0.05;#Compared with control group,P<0.01

二、胎盤組織PAHs濃度

根據定量檢出限進行定量，五環(huán)及六環(huán)PAHs(BBF、BKF、BAP、I1P、DahA、BghiP)檢出率均低于60%，四環(huán)PAHs中CHR檢出率低于80%。由于五環(huán)及六環(huán)PAHs定量檢出率過低，僅對四環(huán)及以下的PAHs進行描述及統(tǒng)計分析(表2)。PAHs濃度不服從正態(tài)分布，使用中位數(shù)及四分位數(shù)(P25～P75)進行描述。從總體來看，低分子量PAHs (L-PAHs)濃度高于高分子量PAHs (H-PAHs)；不論是∑L-PAHs、∑H-PAHs還是∑PAHs，病例組胎盤組織PAHs水平低于對照組，但差異不具有統(tǒng)計學意義。L-PAHs中，病例組NAP水平低于對照組，存在統(tǒng)計學差異(P=0.019)；在H-PAHs中，病例組BAA水平低于對照組，存在統(tǒng)計學差異(P=0.048)。

表2唇腭裂病例組和健康對照組胎盤組織PAHs濃度(ng/g)

Table2Concentrations of PAHs in placental tissues of orofacial cleft cases and controls [Median (P25～P75) ](ng/g lipid)

PAHsControlsCasesL-PAHs NAP#129.4(101.7～153.6)111.1(96.4～136.7) ANY4.2(3.0～5.1)4.3(3.3～4.8) ACE34.0(27.5～41.6)32.9(26.7～38.9) FLU80.6(61.8～94.0)75.8(59.3～92.1) PHE166.3(137.0～221.0)163.8(120.2～227.7) ANT8.8(6.4～11.4)7.7(5.3～10.8)H-PAHs FLO21.2(17.5～26.7)21.8(16.5～25.9) PYR10.3(8.3～12.7)9.5(7.5～12.2) BAA#2.0(1.7～2.6)1.9(1.6～2.3) CHR3.4(2.0～4.4)3.0(1.5～4.2)∑L-PAHs*424.7(363.0～503.2)400.1(335.0～529.6)∑H-PAHs*37.1(30.7～47.3)35.8(28.2～43.8)∑PAHs*468.1(393.5～545.4)441.6(364.5～570.0)

*∑L-PAHs:Sum of NAP,ANY,ACE,FLU,PHE and ANT,∑H-PAHs:Sum of FLO,PYR,BAA and CHR,∑PAHs:Sum of all 10 detectable PAHs above;#Compared with control group,P<0.05.

以對照組胎盤組織PAHs中位濃度為界值分組進行分析，獲得粗OR值(crude OR,cOR)及95%CI。調整胎兒性別、孕周分組、孕婦職業(yè)、吸煙與被動吸煙、圍孕期感冒發(fā)熱后，使用非條件Logistic回歸，分析PAHs與唇腭裂的關聯(lián)，獲得調整后的OR值(adjusted OR,aOR)及95%CI，結果見表3。盡管NAP的cOR值為0.47 (0.26～0.82)，但調整混雜因素后NAP的水平與唇腭裂之間不存在統(tǒng)計學關聯(lián)(P=0.124)。∑L-PAHs、∑H-PAHs、∑PAHs的aOR值(95%CI)分別為0.74 (0.38～1.44)、1.17 (0.60～2.25)、0.71 (0.37～1.38)，PAHs高暴露與唇腭裂發(fā)生風險之間不存在統(tǒng)計學上的關聯(lián)。

表3胎盤組織PAHs水平與唇腭裂風險的關聯(lián)

Table3Risk in association with a concentration above the median of PAHs of controls

PAHscOR (95%CI)aOR# (95%CI)L-PAHs NAP0.47 (0.26～0.82) △0.59 (0.30～1.16) ANY1.15 (0.66～1.99)1.06 (0.60～2.24) ACE0.84 (0.48～1.45)0.90 (0.46～1.75) FLU0.74 (0.43～1.29)0.90 (0.46～1.75) PHE0.94 (0.55～1.63)1.04 (0.53～2.06) ANT0.74 (0.43～1.29)0.82 (0.42～1.57)H-PAHs FLO1.10 (0.64～1.91)1.29 (0.66～2.49) PYR0.81 (0.47～1.40)1.08 (0.56～2.09) BAA0.74 (0.43～1.29)0.88 (0.45～1.70) CHR0.69 (0.40～1.19)0.84 (0.44～1.62)∑L-PAHs*0.69 (0.40～1.19)0.74 (0.38～1.44)∑H-PAHs*0.91 (0.52～1.57)1.17 (0.60～2.25)∑PAHs*0.66 (0.38～1.15)0.71 (0.37～1.38)

*∑L-PAHs:Sum of NAP,ANY,ACE,FLU,PHE and ANT,∑H-PAHs:Sum of FLO,PYR,BAA and CHR,∑PAHs:Sum of all 10 detectable PAHs above;#Adjusted for infant sex,gestational week,maternal occupation,smoking and passive smoking and flu or fever during early pregnancy.△P<0.05.

三、PAHs濃度相關因素分析

為進一步研究影響胎盤組織PAHs濃度的相關因素，對母親職業(yè)、胎兒性別、做飯主要燃料、孕期采暖等二分類變量使用Pearson相關分析，對母親年齡、孕前BMI、孕周等非正態(tài)分布的連續(xù)變量以及受教育程度、吸煙/被動吸煙等級變量使用Spearman相關分析，分析這些因素對∑L-PAHs、∑H-PAHs、∑PAHs濃度的影響。如表4所示，孕期采暖與∑L-PAHs及∑PAHs升高有關，但與∑H-PAHs不存在相關性(P=0.191)；孕婦職業(yè)為農民，其胎盤組織∑H-PAHs濃度較高(P=0.046)。

四、孕周與PAHs濃度的關系

由于對照組標本絕大多來自于足月產胎兒，而部分病例來自產前診斷引產胎兒。因而，如果污染物水平隨孕周有較大變化，則會影響研究結論。因對照組孕周分布差異較小，因此僅對病例組分析孕周與胎盤組織PAHs濃度的關系。將孕周按“20～27周”、“28～36周”“≥37周”分為三個等級，使用Spearman等級相關分析∑L-PAHs、∑H-PAHs、∑PAHs的濃度與孕周的關聯(lián)(表5)。結果發(fā)現(xiàn)，胎盤組織內∑L-PAHs、∑H-PAHs、∑PAHs水平隨著孕周的增加而升高，差異具有統(tǒng)計學意義(分別為P=0.005、P=0.025和P=0.006)。

表4 研究對象一般特征與PAHs濃度的關系Table 4 Correlation between PAH concentrations and maternal characteristics of demographic and environmental exposure

*Education was coded as:“Primary or lower”-1,“Junior high”-2,“High school or above”-3;#Smoking or passive smoking was coded as:“None”-1,“Sometimes”-2,“Daily”-3;△∑L-PAHs:Sum of NAP,ANY,ACE,FLU,PHE and ANT,∑H-PAHs:Sum of FLO,PYR,BAA and CHR,∑PAHs:Sum of all 10 detectable PAHs above.▲P<0.05.

表5 唇腭裂病例組胎盤組織PAHs濃度(ng/g)與孕周的關系Table 5 Relationship between concentrations (ng/g lipid) of PAHs in placental tissues of orofacial cleft cases and gestational weeks

*∑L-PAHs:Sum of NAP,ANY,ACE,FLU,PHE and ANT,∑H-PAHs:Sum of FLO,PYR,BAA and CHR,∑PAHs:Sum of all 10 detectable PAHs above.#Compared within the age group,P<0.05;△Compared within the age group,P<0.01.

討論

本研究對胎盤組織內16種目標PAHs進行檢測，10種高于定量檢出限。唇腭裂病例組和對照組間10種PAHs總濃度中位數(shù)的差異無統(tǒng)計學意義；單因素分析時對照組萘(NAP)的濃度顯著高于病例組，但調整混雜因素后，這一聯(lián)系不再存在。按照PAHs分子量分組分析，也未發(fā)現(xiàn)病例組和對照組之間差異存在統(tǒng)計學意義。

脂溶性有機污染物PAHs可通過胎盤屏障進入胎兒體內。Yu等[6]對北京地區(qū)非吸煙婦女母乳、胎盤組織、臍帶血中的PAHs含量進行檢測發(fā)現(xiàn)，胎盤組織PAHs濃度低于臍帶血，但二者PAHs濃度之間存在正相關關系，說明胎盤組織PAHs的濃度能夠從一定程度上反映胎兒PAHs的暴露情況。盡管有研究發(fā)現(xiàn)臍帶血BKF、BAP、DahA水平高于母親血[7]，表明有機污染物可能在胎兒體內富集，但對孕周較小的病例組較難獲取到足夠量的臍帶血標本，因此胎盤組織是能夠獲取的與胎兒暴露較為接近的生物樣品。

本研究中唇腭裂病例組與對照組中位PAHs濃度分別為441.6 ng/g和468.1 ng/g，與同一項目組對神經管缺陷病例及對照的胎盤組織PAHs濃度檢測的中位濃度值(597 ng/g和392 ng/g)[8]相近，低于母親血清PAHs中位濃度(5 839 ng/g和2 668 ng/g)[9]。對PAHs母嬰傳遞關系的研究均顯示，胎盤組織PAHs濃度低于母親血清PAHs濃度，胎盤組織PAHs濃度低于臍帶血PAHs濃度[10,11]。

對于總PAHs濃度，L-PAHs占比較大，而五環(huán)及以上PAHs的定量檢出率均較低。這種分布情況可能與PAHs暴露來源及人體吸收、代謝有關，也可能與胎盤屏障對不同種類PAHs的阻隔作用不同有關。在Yu等[6]的研究中，胎盤組織PAHs的濃度同樣存在L-PAHs占比明顯高于H-PAHs的現(xiàn)象。敬燁[12]對上海地區(qū)PAHs母嬰暴露及傳遞情況的研究發(fā)現(xiàn)，胎盤組織H-PAHs含量明顯低于母血及臍血，認為胎盤對H-PAHs的阻隔作用較弱。

在胎盤組織PAHs濃度影響因素的分析中，孕期采暖與∑L-PAHs和∑PAHs濃度成正相關關系。Downward等[13]發(fā)現(xiàn)不同種類煤炭燃燒產生的PAHs種類及含量具有差異，貧瘦煤燃燒能夠顯著增加空氣顆粒物中NAP水平。Geng等[14]發(fā)現(xiàn)在燃煤產生的PAHs中氣相PAHs占95%，NAP占比最大；顆粒相PAHs以三環(huán)及四環(huán)PAHs為主。本研究發(fā)現(xiàn)孕期采暖與∑L-PAHs之間具有顯著的正相關關系，可能提示孕期采暖會增加L-PAHs的暴露，且L-PAHs可能主要來自于煤炭的燃燒。

本研究的優(yōu)勢在于研究納入唇腭裂病例及對照各103例，與其他使用胎盤組織樣品進行的研究相比，本研究樣本量較大，具有較好的統(tǒng)計學功效[11,15]。本研究探討了以胎盤組織PAHs作為內暴露標志物與唇腭裂之間的關系，使用內暴露劑量作為評價指標，避免了單純問卷調查可能存在的回憶偏倚和報告偏倚。實驗中使用標準樣品、空白對照、平行樣品測定、病例與對照均勻檢測等方法進行質量控制，同時在濃度計算過程中隱去研究對象的分組，避免了研究人員可能的暴露懷疑偏倚。

研究的局限性包括：(1)由于PAHs能夠部分通過胎盤屏障進入胎兒，且胎盤對不同物質的阻隔作用不同，胎盤組織中不同種類PAHs的濃度可能與胎兒體內的分布情況存在一定差異。(2)病例組與對照組母親職業(yè)存在明顯差異，對照組母親職業(yè)為農民的比例較大，但社會階層或職業(yè)與污染物的暴露存在關聯(lián)[16]，可能會使胎盤組織PAHs水平較高。病例與對照組母親職業(yè)的差異也可能存在類似健康工人效應的選擇偏倚，即母親職業(yè)為農民，可能暴露于高水平的PAHs中，但由于個體敏感性差異其胎兒出生缺陷率可能更低。(3)由于樣本獲取的限制，病例組胎盤組織多在胎兒引產時收集，而對照組多為足月產胎兒的胎盤組織，因此病例組孕周顯著小于對照組。理論上對照組胎盤組織具有更長的蓄積時間，可能是導致對照組胎盤組織PAHs濃度較高的另一個原因。

總之，本研究采用胎盤組織內PAHs作為暴露標志，未發(fā)現(xiàn)孕期PAHs暴露與唇腭裂風險存在關聯(lián)性。今后可考慮采集唇腭裂診斷時的母親尿液，檢測PAHs的代謝產物，進一步研究孕期PAHs暴露與唇腭裂風險之間的關聯(lián)性。