朱小輝 關碩 王玉倩 邵敏杰 廉穎 黃錦 李蓉 劉平 閆麗盈 喬杰

出生缺陷是指嬰兒出生前發(fā)生的身體結構、功能以及代謝的異常。出生缺陷通常是嚴重致殘致死類疾病,缺乏治療手段。除嚴重胎兒畸形外，出生后的缺陷兒中30%會在五歲前死亡，40%的缺陷兒會有終身殘疾，給患兒的家庭甚至社會造成了沉重的精神和經濟負擔[1]。造成出生缺陷的原因很多，主要有遺傳因素和環(huán)境因素。原衛(wèi)生部2012年發(fā)布的《中國出生缺陷防治報告(2012)》統計，我國出生缺陷高達5.6%，每年新增出生缺陷數約90萬例，其中20%～30%與遺傳因素相關。目前已知的屬于出生缺陷類的疾病有8 000種以上，其中屬于孟德爾單基因遺傳病的有5 208種，3 575個已經發(fā)現相關基因[2]。

在所有出生缺陷中，與遺傳因素相關的出生缺陷有80%左右，包括染色體結構異常，單個基因或多基因異常甚至基因甲基化異常等[3]；隨著高通量測序技術(包括外顯子組和全基因組測序技術)的發(fā)展和人類基因組計劃的實施、結合基礎醫(yī)學對基因功能的研究，有力地推動了遺傳性出生缺陷的病因學研究[4]。對于大多數遺傳性疾病，目前還沒有有效的治療藥物和手段。遺傳阻斷的有效方式主要有兩種：產前診斷和胚胎植入前遺傳診斷，這兩種方式均包括染色體和致病基因的診斷。PGD在1990年成功應用于臨床，為一個X連鎖隱性遺傳病家系挑選女性胚胎[2]。隨著單細胞基因組擴增方法的出現和不斷改進，以及芯片技術和高通量測序技術在診斷中的應用，大大提高了胚胎診斷的準確性和應用范圍，目前國際上有報道超過200個單基因病經PGD進行胚胎診斷[5]。我們中心在染色體和單基因的PGD診斷中，開發(fā)了MARSALA技術[6]，為單基因遺傳病家系病人進行胚胎診斷，目前450余例病人進入診斷流程，包括156種遺傳病，準確診斷了386個取卵周期，已分娩61名PGD新生兒，還有38例處于妊娠期。

無論是產前診斷，還是胚胎移植前基因診斷，基因檢測報告的準確性是關鍵，決定著PGD的結局和胎兒的命運。家系中患者的疾病臨床診斷的準確性，疾病與基因的相關性以及基因突變位點的致病性等因素決定著基因檢測結果的可靠性。?？漆t(yī)生大多可以做出疾病診斷，而檢測機構的技術和生物信息人員負責對基因和位點進行判讀，而把兩者聯系在一起的是有臨床背景和遺傳知識的遺傳專家。遺傳咨詢，作為遺傳學信息與臨床癥狀聯系的紐帶，在婚前、胚胎植入前以及產前各階段均對病人的生育有指導作用，對于防止缺陷兒出生，降低出生缺陷率有不可低估的作用。 病人進入流程前的預實驗，是減小診斷風險，防止患兒出生的更關鍵一步。我中心胚胎診斷流程中病人進入取卵周期前，均需進行預實驗：目的是遺傳病基因檢測結果家系驗證，同時為后續(xù)的胚胎診斷做準備。遺傳咨詢和預實驗是我們中心胚胎基因診斷流程的起始環(huán)節(jié)，也是發(fā)現問題、糾正錯誤、制定檢測策略、提高胚胎診斷準確性的關鍵步驟。

對象與方法

一、對象

我中心遺傳門診接診的遺傳病家系夫婦，生育過患兒(包括引產過患病胎兒)，或者無患兒但有遺傳病家族史。根據遺傳病的類型不同，遺傳咨詢后，采集夫妻雙方、患兒、以及攜帶突變基因一方的父母的血液樣本。如為常染色體顯性遺傳家系，還需采集攜帶突變一方其他家系成員血液樣本。X連鎖隱性遺傳病家系，如無患兒，需采集女方家系中相關成員血液樣本，包括家系中患病男性、正常男性以及患病男性的母親等等(圖1)。如果夫妻為新發(fā)病例或無家系樣本，則考慮用單個精子、極體、或含致病位點胚胎用于連鎖分析，預實驗結束后，根據實驗結果簽署胚胎植入前基因診斷知情同意書，把風險和有可能出現的問題充分告知病人。

二、方法

預實驗包括以下幾方面： (1)基因檢測報告上基因突變位點家系驗證。(2)單細胞致病位點擴增：單細胞基因組擴增后，設計引物，突變位點擴增，為胚胎診斷做準備。(3)家系連鎖分析：部分特殊家系進入周期后，先行尋找家系可用SNP位點，評估胚胎檢測的風險，并為后續(xù)胚胎診斷做準備。具體實驗方法如下：

1、家系樣本采集：男女雙方、患兒和其他家系成員采集EDTA抗凝血4 ml，分裝后按照標準化流程入生殖中心樣本庫的PGD庫，留0.5 ml提取基因組DNA，用于預實驗。樣本如為組織樣本(如先證者的臍帶或其他組織)，分裝成小塊后，液氮速凍，存入樣本庫，留一份提取基因組DNA。留取先證者或者基因突變攜帶者的口腔黏膜細胞，顯微鏡下挑取單個細胞，放入裂解液中(億康公司-MALBAC單細胞全基因組擴增試劑盒)，3～5個細胞/管。某些男方攜帶基因突變的家系需留取精液，顯微鏡下挑取單個精子，放入裂解液中備用。

2、血液及組織基因組DNA提取：實驗流程遵循試劑盒(Qiagen 69504)說明書。

3、家系突變位點驗證：用家系基因組DNA作為擴增模板，根據家系攜帶基因突變的類型，進行突變位點驗證。突變位點驗證的方法包括：(1)PCR-Sanger測序適用于點突變，單堿基或多堿基插入缺失突變驗證；(2)PCR擴增后毛細管電泳適合基因中堿基重復數異常的突變類型驗證；(3)多重連接探針擴增(multiples ligation-dependent probe amplification，MLPA)適合外顯子缺失的突變類型驗證；(4)高通量基因組測序或者SNP芯片適用于驗證大片段缺失和重復。

4、單細胞基因組擴增、基因突變位點檢測：擴增實驗方法遵循試劑盒說明書(億康公司-MALBAC單細胞全基因組擴增試劑盒)。設計特異性引物(擴增產物長度不能過長，適于單細胞基因組擴增產物的長度)挑選適合的引物和擴增條件用于后續(xù)的胚胎檢測。

5、某些病例，由于家系不全(基因突變攜帶者一方父母去世，或者攜帶者為新發(fā)突變，家系中無其他攜帶者)男方攜帶者，可將單個精子用于胚胎診斷中連鎖分析，預實驗時將單精子全基因組擴增，產物經全基因組測序后，在致病基因所在的染色體接近基因附近處尋找可用于家系連鎖分析的SNP位點[6]。

圖1 遺傳家系模式圖。模式圖中*代表預實驗需留取樣本的家系成員Figure 1 Schema chart of hereditary disorder pedigree* Representing essential family members whose samples are necessary in Pre-experiment

結 果

一、單基因遺傳病胚胎植入前基因診斷前的遺傳咨詢

在本中心單基因PGD標準化流程中，生殖遺傳咨詢是流程的第一步，病人由臨床遺傳病接診大夫接收，針對病人的基因檢測結果和胚胎基因篩選的訴求，遺傳咨詢將分為兩部分：

1、遺傳咨詢(常規(guī)遺傳咨詢)：針對病人提供的基因檢測報告和家系情況，推薦病人去?？漆t(yī)院遺傳學專家門診進行遺傳咨詢，咨詢內容主要包括基因檢測報告的可靠性，家系中患者癥狀與基因及基因突變的相關性，基因突變的致病性分析，?？七z傳專家給出咨詢意見。

2、生殖遺傳咨詢：由具有遺傳學背景的生殖醫(yī)學臨床醫(yī)生對病人進行生殖遺傳咨詢。內容包括：(1)全面了解胚胎診斷的過程。(2)告知病人遺傳病阻斷的方法和可能的選擇，包括產前診斷和胚胎植入前遺傳診斷各自的優(yōu)勢和缺點。(3)胚胎診斷的結局。需要告知病人幾方面的內容：根據技術的局限性，告知病人胚胎診斷有誤差存在。雖然很小，但有可能。告知病人胚胎診斷中的囊胚期活檢的滋養(yǎng)層細胞的染色體狀況不能完全代表胎兒染色體的情況，雖然進行了染色體整倍性篩查，但不排除胎兒染色體異常的可能性。(4)對胚胎存在染色體嵌合現象告知風險。移植胚胎需中期羊水穿刺進行基因驗證。(5)根據疾病遺傳方式對經PGD的胚胎在移植前進行遺傳咨詢：如常染色體隱性遺傳病，攜帶一方突變的胚胎可移植。理論上將來孩子不患病。對于X-連鎖隱性遺傳病家系雜合攜帶突變的女性胚胎，移植前需告知其此女性胚胎的后代生育患病風險等等。病人充分了解PGD的細節(jié)和風險后，簽署胚胎植入前基因診斷知情同意書，隨后進入PGD流程。

二、預實驗可能出現的結果及分析

在PGD病人的預實驗過程中，我們發(fā)現以下幾類問題值得關注：(1)經家系驗證，由于基因檢測公司的失誤，基因檢測報告有誤。(2)常染色體顯性遺傳病致病基因突變家系驗證后，不符合家系疾病與基因共分離現象。(3)X連鎖隱性遺傳病家系，病人的基因檢測結果未得到家系里的先證者的驗證。(4)在做預實驗時發(fā)現病人一些特殊的問題。預實驗結果驗證了病人是否具有充分的PGD指征，并在我們制定胚胎檢測策略時發(fā)揮重要作用。以下為代表性病例展示：

1、病例一：常染色體顯性遺傳病家系-- PGD指征基因，如馬凡綜合征-FBN1[7]

(1)對象：夫妻雙方及男方母親一起來中心就診，提供基因檢測報告顯示在常染色體顯性遺傳病馬凡綜合征致病基因FBN1上有一突變，c.698G>A。要求男方采集家系中其他人員的血液樣本。

(2)預實驗結果：對FBN1的基因突變c.698G>A在全家系基因組DNA中進行驗證，結果如圖(圖2)。基因突變攜帶情況和家系成員的癥狀不相符，家系中除男方和其母親外，妹妹和小舅均為患者，卻不攜帶此突變。建議病人再次進行基因檢測，經第二次基因檢測，結果顯示在FBN2基因上找到一錯義突變 c.3719G>A。我們對此位點再次進行全家系驗證，此位點與家系成員癥狀存在完全的共分離現象(圖3)，只有患病的家系成員攜帶此突變。支持此位點為致病性位點的其他證據還有文獻類似突變位點報道[8]。

(3)結局：經遺傳咨詢后，病人進入PGD試管周期，以FBN2的突變位點c.3719G>A 為依據進行胚胎診斷。目前成功分娩健康后代，新生兒體檢顯示各方面檢測均正常。

2、病例二：X連鎖隱形遺傳病家系--PGD指征基因，如血友病F8[9]

(1)對象：夫妻雙方來中心就診，女方為血友病F8因子基因突變攜帶者，女方家系中有患者(同母異父的大姐的孫子和二姐的兒子均為患兒) 。家系成員除女方外均未做基因檢測?；驒z測報告顯示女方在F8基因上攜帶一錯義突變c.3169G>A，有文獻報道。

(2)預實驗結果: 全家系驗證，結果顯示患兒并不攜帶該突變。家系中患者重新基因檢測，發(fā)現患者在 F8基因上存在一無義突變 c.5550 delC ，全家驗證支持此突變?yōu)榧蚁抵虏⌒酝蛔儯讲粩y帶(圖4)。

(3)結局：女方并不攜帶家系致病性突變，不具備單基因PGD指征，建議自然妊娠。

3、病例三：常染色體隱形遺傳家系-PGD指征基因脊肌萎縮癥(spinal muscular atrophy,SMA)遺傳家系+平衡易位[10-11]

(1)對象：夫妻雙方曾有一個脊肌萎縮癥(SMA)患兒，出生后4個月夭折，夫妻雙方均為SMN1基因的外顯子7和外顯子8雜合缺失，患兒為兩個外顯子純合缺失。男方家系不全，胚胎基因診斷策略中用單個精子做家系分析，故留取男方精子。

(2)預實驗結果：除留取家系成員血液樣本，采用MLPA的方法進行SMN1突變位點驗證外。因男方母親去世，男方母親突變攜帶情況不詳，故留取男方精液，顯微鏡下挑選單個精子作為輔助診斷依據。單個精子進行全基因組擴增后，判斷缺失突變的攜帶情況，同時進行全基因組測序，尋找基因附近家系分析可用的SNP位點，用于胚胎診斷中染色體分型的依據。單精子全基因組擴增后測序結果分析發(fā)現，幾乎所有精子都存在染色體異常，主要集中在5號和14號染色體上(圖5)，因此懷疑男方很有可能是平衡易位的攜帶者。經過染色體核型檢查，輔助以染色體FISH檢測，確定男方為5號染色體短臂與14號染色體長臂的平衡易位攜帶者(圖5)。

(3)結局：制定PGD檢測策略，對單基因SMN1行PGD外，同時行染色體PGD。利用攜帶突變的精子進行染色體分型，從而區(qū)分平衡易位與完全正常胚胎，病人經一周期PGD，有不攜帶SMN1雙方突變，染色體完全正常的可移植胚胎。

4、病例四：常染色體顯性遺傳病家系-- PGD指征基因神經纖維瘤II型NF2[12]+染色體平衡易位

(1)對象：夫妻雙方因男方家系攜帶神經纖維瘤II型NF2基因突變來中心就診，接診后詢問病人孕產史時，發(fā)現這對夫妻有兩次不良妊娠史，均在孕20周時因發(fā)現畸形胎兒引產。其中一次引產胎兒進行了染色體檢測，發(fā)現胎兒13號染色體末端缺失，18號染色體末端重復，推測夫妻中一方存在染色體的平衡易位的可能性。夫妻在我院再次染色體核型檢查并結合FISH檢測進行診斷。

(2)結果：最終男方診斷為攜帶13號染色體長臂末端與18號染色體長臂末端的平衡易位(圖6)。

(3)結局：制定PGD檢測策略，利用患者引產胎兒樣本作為先證者，胚胎可同時進行單基因NF2基因和染色體PGD，挑選染色體正常且不攜帶基因突變的胚胎。

圖5 病例三男方為染色體平衡異位攜帶者a. 男方單個精子擴增后染色體整倍性分析結果；b. 左側男方血液細胞染色體核型檢查結果，右側血液細胞FISH結果Figure 5 Case three: Male chromosome balanced translocation carrier diagnosed by single sperm genomic sequencing, chromosome karyotype and FISH analysis. a. chromosome number variation (CNV) analysis by single sperm genomic sequencing. b. Peripheral blood chromosome karyotype analysis. c. Peripheral blood chromosome FISH analysis

圖6 病例四男方染色體檢查結果，男方為平衡易位攜帶者a. 染色體核型檢查結果；b. FISH檢查結果Figure 6 Case Four: Male chromosome balanced translocation carrier diagnosed by chromosome karyotype and FISH analysis. a. Peripheral blood chromosome karyotype analysis. b. Peripheral blood chromosome FISH analysis

討 論

隨著科學技術的進步，PGD成為了減少出生缺陷的重要手段之一。越來越多的有遺傳病史的家庭得到幫助，生育了健康的后代。PGD診斷技術成功應用近30年，診斷技術不斷發(fā)展與改進，從常規(guī)PCR到芯片技術，再到高通量測序[13]，減少診斷成本的同時，大大提高了準確性，也增加了病人對這項優(yōu)生手段的信任度。隨著病人人數的增加，胚胎診斷技術在很多醫(yī)院和中心逐漸形成標準化流程[14]。我中心自2014年將新技術的科研成果推向臨床PGD以來，率先建立起檢測技術標準化流程，同時我們也將病人入組流程標準化。我們首先對其基因檢測報告和病人遺傳家系癥狀進行分析會診，在入組之前充分做好遺傳咨詢、生殖遺傳咨詢和生殖評估。遺傳咨詢由各專科遺傳專家給出專業(yè)咨詢意見，生殖遺傳咨詢由具有遺傳學背景的生殖專業(yè)臨床醫(yī)生給病人進行PGD流程與風險咨詢。生殖評估由病人(主要為女方患者)所患遺傳病專科醫(yī)生，生殖科醫(yī)生和產科醫(yī)生共同組織全院會診，主要針對女性遺傳病患者的生育力、妊娠風險作出準確的評估。

預實驗是對家系攜帶致病基因突變的驗證，同時也是發(fā)現問題、制定個性化檢測策略的關鍵步驟。我中心開展單基因PGD以來，進行胚胎植入前診斷的450余例病人中，在預實驗過程中發(fā)現一些問題，常見的是病人的基因診斷報告上的致病基因與病人或其家中患者癥狀不相符，也就是病人需要重新確定疾病與基因的相關性，以及基因突變位點的致病性。這需要借助專科遺傳專家的咨詢意見，病人重新做基因檢測，找到真正的致病基因及突變后，再進入PGD流程。此外，在前期PGD過程中，我們積累了一些經驗，并進一步完善了PGD流程。

對于常染色體顯性遺傳家系，要求病人提供患病一方的全家系(盡可能多的相關家庭成員)進行位點驗證。根據驗證結果進行遺傳咨詢，確定基因與疾病的相關性后，開始PGD流程。對于X連鎖隱性遺傳病家系，一般情況下此類疾病有先證者存在。比如血友病、杜式肌營養(yǎng)不良(DMD)等，尋找家系的致病基因突變，首先應該從先證者入手，而不是攜帶者。對于基因檢測結果，同樣需要進行全家系驗證(家族中必要成員，如家族中正常男性、患病男性或生育過男性患者的女性)才能確定真正的致病突變。本文中第三個病例的問題，在于女方本人去做基因檢測，而非家系中的先證者，并且基因檢測結果未做家系驗證。預實驗家系驗證后，確定此病人不攜帶家系中從其母親遺傳的致病性突變，可自然妊娠。

通過預實驗，還可發(fā)現一些復雜的現象，如本文中提到的病例四。雖然病人沒有流產和胎兒畸形的不良孕史，但在我們預實驗中，發(fā)現男方單精子屢次出現5號染色體和14號染色體的各種形式的異?，F象，非常符合平衡易位導致的染色體異常的狀況；因此懷疑男方為平衡易位攜帶者。經染色體核型檢查并最終由FISH結果確定后，我們制定了胚胎單基因PGD同時進行染色體PGD的檢測策略，最大可能減少PGD胚胎移植后出現異常的風險。病人來中心就診，我們通過仔細詢問病人的病史和孕史，充分的遺傳咨詢和必要的遺傳學檢測，加上捕捉預實驗中出現的異?，F象，可以盡最大可能減少PGD胚胎或新生兒出現異常的可能性。

盡管如此，經過嚴格的預實驗驗證和專家遺傳咨詢，也不可能達到100%的零風險。因此，進入PGD流程之前對病例進行合理的個性化的PGD風險評估，在胚胎初步診斷完成后，根據檢測結果對移植后胚胎發(fā)育過程中出現的任何風險，做出準確的判斷，也是胚胎植入前遺傳學診斷工作的關鍵環(huán)節(jié)。充分告知病人在胚胎PGD可能出現的所有風險，達成共識后簽署知情同意書，是我們對每一個病人進行胚胎診斷和胚胎移植前必須進行的工作。對于單基因胚胎植入前PGD，我們不承諾每一例都達到完美無風險，但將盡最大努力降低相關風險。

(圖2、圖3見封三，圖4見封底)