蔡靜 張丹 張燕

Toll樣受體(Toll-like receptors；TLRs)作為主要的固有免疫受體類型，在調節(jié)免疫反應，啟動繼發(fā)性損傷中發(fā)揮關鍵作用[1]。TLR-4作為TLRs家族的重要成員，在識別并結合損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns；DAMPs)，啟動炎癥反應的過程中發(fā)揮關鍵作用。TLR-4通過與相應受體結合，啟動下游的髓樣分化因子88(MyD88)依賴/Myd88非依賴信號通路，進而激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)，促進細胞增殖、分化、分泌大量細胞因子[2]。近年研究表明，慢性炎癥與腫瘤的發(fā)展密切相關，而介導炎癥的TLR4與多種腫瘤的生物學行為密切相關，是近年來研究熱點之一[3]。在膠質瘤等惡性腫瘤的研究中已經(jīng)證明，TLR4表達上調明顯，且TLR1到TLR10均有不同程度表達升高。有文獻報道，TLR4在宮頸癌中表達明顯增高，且表達程度與腫瘤病變程度呈高度相關性[4]。但是，目前TLR4在宮頸癌中表達增加的作用尚不明確，其是否影響宮頸癌細胞增殖、遷移仍有待進一步探討。

因此，本研究擬檢測宮頸癌組織和宮頸癌細胞中TLR4/NF-κB表達改變，并通過干擾TLR4表達，觀察TLR4對宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響。

資料與方法

一、資料

收集本院于2017年4月—2018年4月就診并行手術治療的患者術中宮頸癌組織及癌旁組織31例，診斷依據(jù)病理結果。人宮頸癌細胞株HCE1由我院實驗中心提供，兔多克隆抗體TLR4，Myd88，ERK1/2及NF-κB均購自美國Abcam公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測試劑盒購自中國碧云天公司，DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，Trizol Reagent購自Invitrogen公司，mRNA逆轉錄試劑盒購自Thermo公司，PCR mix購自日本Toyobo公司，TLR4 沉默與過表達質粒均購自中國百奧邁科生物技術有限公司。

二、方法

1. 采用實時定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)比較宮頸癌組織及癌旁組織中TLR4/ NF-κB的表達。根據(jù)人宮頸癌細胞株HCE1細胞TLR4表達情況，分為Blank 、陰性對照、TLR4沉默、TLR4過表達4組。采用CCK8、劃痕實驗、Transwell實驗檢測TLR4對細胞增殖、遷移、侵襲，并進一步檢測Myd88，ERK1/2 及NF-κB信號分子改變。

2.細胞培養(yǎng)：常規(guī)培養(yǎng)人宮頸癌細胞株HCE1及原代宮頸上皮細胞。在細胞生長穩(wěn)定、呈對數(shù)期時用于實驗。

3.分組與瞬時轉染：接種人宮頸癌細胞株HCE1，在37 ℃ 5% CO2 細胞培養(yǎng)箱中，含 10% FBS 的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，50%～60% 融合時，采用Lipofectamine 3000瞬時轉染。共分4組： Blank 組：常規(guī)培養(yǎng)的宮頸癌細胞；陰性對照(negative control，NC)組：轉染TLR4 NC(100 nmol/ml)的宮頸癌細胞；TLR4沉默組：轉染TLR4 siRNA(100 nmol/ml)的宮頸癌細胞；TLR4過表達組：轉染TLR4 過表達質粒(100 nmol/ml)的宮頸癌細胞。嚴格按照脂質體法進行轉染，6 h 內用 OMEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

4.qRT-PCR：獲得患者癌組織及癌旁組織，以及相應細胞系樣本，均嚴格按照RNAgent Isolation System說明書，抽提總RNA。取1 ug總RNA，嚴格按照逆轉錄試劑盒說明書將總RNA逆轉錄成cDNA。PCR反應在PE公司的GeneAmp8 5700型PCR擴增儀上進行，嚴格按照SYBR green說明書加樣，總反應體系20 ul，各樣本加cDNA 2ul；SYBR green 10 ul；商品化引物 2 ul(TLR4，NF-κB，上海生工，中國；GAPDH:MQP027158;Genecopoeia公司，美國)；RANaseRree去離子水 2 ul。按兩步法反應94℃ 30 s，58℃ 30 s，反復40個循環(huán)以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參照進行分析。

5.細胞增殖實驗：在96孔板中每孔接種5×103個細胞，每組設置4個復孔。將細胞剛好貼壁記為0 h，于12 h利用CCK-8檢測試劑盒檢測細胞增殖；每孔加入10 ul CCK-8溶液，空白對照孔加10 μl 0.9%生理鹽水，在細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后用酶標儀在570 nm處測定各孔的吸光度(A)值。

6.細胞劃痕實驗：細胞按每孔約5×105個細胞的密度接種到6孔板，培養(yǎng)24 h至細胞伸展，用無菌200ul的槍頭在細胞層垂直、快速劃痕。標準條件培養(yǎng)48 h后觀察劃痕愈合。

7.侵襲實驗：Transwell小室(Millipore，USA)底部鋪入50 ul Basement Membrane Matrix(Corning, USA，1:2稀釋)，置于細胞孵箱中2 h。收獲細胞，制成每200 ul DMEM(GIBECO，USA)中含6×104個細胞懸液。Transwell上室加入200 ul DMEM細胞懸液，下室加入800 ul含10%胎牛血清DMEM，置于細胞培養(yǎng)箱中。侵襲48 h后取出小室，多聚甲醛中固定10 min，結晶紫中染色3 min。PBS洗凈結晶紫，并用棉簽輕輕擦拭Transwell小室上室底部。晾干后，將小室倒置于顯微鏡下觀察并拍照，計算細胞數(shù)目。

8.Western blot檢測：按不同因素處理細胞，提取蛋白，測定蛋白濃度，采用5×上樣緩沖液稀釋，使用12%分離膠電泳，轉膜90min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST漂洗10 min×3次，用5%TBST稀釋的BSA稀釋一抗，分別與膜接觸4℃孵育過夜后，用TBST漂洗10min×3次，加二抗室溫下孵育1 h 后，用TBST 洗膜10 min× 3 次，在Gene Gnome曝光儀上曝光并拍照。

結 果

一、TLR4/NF-κB在組織和細胞中的表達：在mRNA水平，腫瘤組織TLR4的表達顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)；宮頸癌細胞株HCE1中TLR4的相對表達量顯著高于正常宮頸上皮細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)，見圖1A。腫瘤組織NF-κB的表達顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.011)；HCE1中NF-κB的相對表達量顯著高于正常宮頸上皮細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)，見圖1B。

圖1 TLR4/NF-κB在不同組織和細胞中的表達比較Figure 1 Comparison of TLR4/NF-κB expression in different tissues and cells

二、TLR4對細胞增殖能力的影響：TLR4沉默組HCE1細胞增殖能力(0.8±0.4)較NC組(1.2±0.4)顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.022)；而TLR4過表達組HCE1細胞增殖能力(1.9±0.5)較NC組(1.2±0.4)顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)，見圖2。

三、TLR4對細胞遷移、侵襲能力的影響：TLR4沉默組細胞愈合面積比例顯著低于NC組(P=0.001)，而TLR4過表達組細胞愈合面積比例顯著高于NC組(P=0.001)，見圖3C。另外，TLR4沉默組細胞穿膜細胞數(shù)明顯少于NC組(P=0.001)，而TLR4過表達組穿膜細胞數(shù)明顯多于NC組(P<0.000)，見圖3D。結果提示，過表達TLR4可以促進宮頸癌細胞遷移、侵襲。

圖2 細胞增殖能力改變Figure 2 Changes in cell proliferationCompared with NC group, #P<0.05.

圖3 細胞遷移、侵襲能力改變Figure 3 Changes in cell migration and invasivenessCompared with NC group, #P<0.05.

四、Myd88/NF-κB信號通路表達改變：為進一步探究TLR4促進宮頸癌細胞株HCE1增殖、遷移和侵襲的機制，結果顯示，TLR4沉默組Myd88(P=0.015)，pERK1/2(P=0.007)及pNF-κB(t=2.762,P=0.024)表達顯著低于NC組，而TLR4過表達組Myd88(P=0.001)，pERK1/2(P=0.001)及pNF-κB(P=0.011)表達顯著高于NC組，見圖3。由此可見，TLR4可通過激活Myd88，ERK1/2及NF-κB信號分子，促進宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲，見圖4。

圖4 不同組別細胞Myd88，pERK1/2及pNF-κB蛋白表達改變Figure 4 Expression of Myd88, pERK1/2 and pNF-κB in different groups

討 論

Medzhitov等于1997年發(fā)現(xiàn)人類第一個與果蠅Toll蛋白相似的蛋白受體-TLR4。TLR4是TLR家族11亞型中最重要的成員，研究最多，不僅廣泛表達于NK細胞、巨噬細胞等免疫原性細胞，也表達于膠質瘤、結腸癌、乳腺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤[5]。近年研究表明，慢性炎癥與腫瘤的發(fā)展密切相關，而介導炎癥的TLR4與多種腫瘤的生物學行為密切相關，是近年來研究熱點之一。

研究表明，TLR4在很多腫瘤細胞系和腫瘤組織中表達上調。Yang等報道在人乳腺癌細胞中，TLR1到TLR10均有不同程度表達升高，尤其是TLR4表達上調最明顯[1]。有研究發(fā)現(xiàn)大腸癌中TLR4的表達顯著高于癌旁組織，且與TGF-β、VEGF之間表達存在明顯相關性[6-7]。在宮頸癌中，有文獻報道，TLR4在腫瘤組織中的表達明顯增高，且表達程度與腫瘤病變程度呈密切相關性[8]。通過本研究進一步證實，TLR4、NF-κB在宮頸癌及宮頸癌HCE1細胞系中的相對表達明顯增高。

目前，TLR4與宮頸癌病變程度相關性的機制仍不清楚。有研究認為，TLR4信號傳導途徑在腫瘤形成、凋亡抵抗和侵襲過程中發(fā)揮重要作用[9]。有研究表明，TLR4信號途徑激活NF-κB促進炎性因子的產(chǎn)生，并激活AP-1促進生長因子的產(chǎn)生[10]。在膠質瘤中的研究表明，TLR4/NF-κB信號通路的過度激活與膠質瘤的侵襲、增殖密切相關[11]。但是，TLR4/NF-κB信號通路與宮頸癌增殖、遷移的關系目前仍缺乏文獻報道。我們的研究證實，在宮頸癌中沉默TLR4的表達，可以顯著抑制宮頸癌增殖、遷移、侵襲，而過表達TLR4可顯著增強宮頸癌細胞增殖、遷移與侵襲。另外，TLR4下游的Myd88，ERK1/2及NF-κB信號分子隨著TLR4表達改變而改變。

目前，腫瘤微環(huán)境在促進腫瘤增殖、遷移與侵襲中的作用逐漸受到重視。研究表明，通過激活TLR4受體，介導MyD88、IRAK、TRAF6、IKK信號途徑激活，最終激活NF-κB，促進IL-1、IL-6、TNF-A等大量炎癥因子的產(chǎn)生。而此類炎癥因子有助于腫瘤細胞逃逸免疫原性細胞如T淋巴細胞、NK細胞攻擊，促進腫瘤遷移。研究報道TLR4激活后可促進腫瘤生長和抵抗化學治療，阻止TLR4激活則能減緩腫瘤生長及延長動物的生存期[12]。在宮頸癌中，過表達TLR4是否通過影響腫瘤微環(huán)境的機制促進腫瘤增殖、遷移、侵襲仍有待進一步探討。

綜上所述，TLR4/NF-κB在宮頸癌中過度激活，促進宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲。通過沉默TLR4可以抑制宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲。在宮頸癌中，TLR4/NF-κB可能發(fā)揮促癌作用，可能是抗癌藥物的重要靶點。