韓 琛 姜永杰 王恒孝

(山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所,山東第一醫(yī)科大學，濟南250062)

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，在全球女性惡性腫瘤中發(fā)病率僅次于乳腺癌排名第二，全世界每年新增病例約45～50萬，我國每年約有13萬新發(fā)病例，約占世界新發(fā)病例總數(shù)的五分之一，高發(fā)年齡為50～55歲。近年來由于子宮頸細胞學篩查的普遍應用，許多宮頸上皮中、重度不典型增生及早期原位癌能被鑒別且及時發(fā)現(xiàn)并早期治療，患者死亡率明顯下降。宮頸癌的病程一般經歷宮頸上皮輕度增生、中度增生、重度不典型增生、原位癌、早期浸潤癌和宮頸癌，一旦發(fā)生浸潤和轉移，由于腫瘤細胞侵犯周圍組織、器官，手術清除范圍廣，進展期或者轉移性宮頸癌患者五年生存率只有10%～20%。傳統(tǒng)宮頸癌治療常規(guī)采用手術切除、順鉑等藥物聯(lián)合化療，但因存在藥物抵抗等對晚期宮頸癌治療效果較差。分子靶向治療作為抗腫瘤領域的研究熱點，為晚期宮頸癌患者的治療提供了新途徑。信號轉導與轉錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是一種與腫瘤密切相關的轉錄因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和生物學特性及轉歸中發(fā)揮著重要的作用，具有潛在的診斷和治療價值。研究表明，STAT3的異常活化與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關，因此深入了解STAT3與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的作用機制對于尋找宮頸癌特異性治療靶點具有重要意義。

1 STAT3信號通路

信號傳導與活化轉錄因子(Signal transducers and activators of transcription，STATs)家族是一種存在于胞漿，通過激活轉入核內結合DNA的蛋白家族，由STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6共7個轉錄因子組成，主要以失活形式存在于細胞質中。它可以被不同的細胞因子或者生長因子激活，具有傳遞信號和轉錄調控的雙重作用，在接受外界信號刺激后激活并進入核內影響多種基因的轉錄[1-4]。

STAT3是1993年在研究γ-干擾素誘導的細胞基因表達中首次發(fā)現(xiàn)的重要信號分子[5]，定位于人類第17號染色體中，由750～795個氨基酸組成，分子量為89～92 kD。STAT3蛋白由6個功能結構域構成，主要是：N端氨基酸保守序列、螺旋區(qū)、DNA結合域、連接區(qū)、Src同源區(qū)2(Src homology region 2，SH2)結構域和C端轉錄活化區(qū)，其中主要通過DNA結合域和SH2結構域發(fā)揮功能性作用。STAT3的活化主要是通過細胞因子受體/JAK2/STAT3信號通路介導的[6]，當細胞因子(如IL-6)等與細胞因子受體相結合形成二聚體，胞質內JAK2發(fā)生聚集、活化，催化受體酪氨酸殘基磷酸化，STAT3通過SH2結構域與受體中的酪氨酸殘基作用，引起STAT3 705位點上的酪氨酸磷酸化修飾實現(xiàn)活化，并形成二聚體進入細胞核，結合于靶基因啟動子的特定序列上，通過與其他轉錄調控元件的相互作用來調控靶基因的表達[7]。上皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)/STAT3信號通路是STAT3活化的另一條重要通路[8]。EGFR屬于跨膜受體酪氨酸蛋白激酶家族，通過與相應配體結合成二聚體，激活其固有的酪氨酸激酶活性，磷酸化自身酪氨酸殘基后激活STAT3 727位點的磷酸化，參與啟動胞內信號傳遞。STAT3下游靶基因包括CyclinD1、c-Myc、Pim1等細胞周期蛋白；Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Survivin等抗凋亡及細胞生存相關基因等的表達，這些靶基因與細胞增殖、分化、生存、惡性轉化及凋亡抑制等活動的調控密切相關[9]。

生理條件下，STAT3的活化處于機體嚴格調控之下,其失活主要由兩類調節(jié)因子調控：細胞因子信號抑制物(Suppressors of cytokine signaling，SOCS)和活化的STAT蛋白抑制物(Protein inhibitor of activated STAT，PIAS)[10]，確保STAT3的活性維持數(shù)分鐘到幾小時，對于維持正常細胞的生理功能發(fā)揮關鍵性作用。但在腫瘤細胞內，因生長因子、細胞因子的失調，STAT3酪氨酸殘基持續(xù)性的磷酸化激活，導致腫瘤發(fā)生。

2 STAT3與人乳頭瘤病毒(Human papillo-ma virus，HPV)感染

HPV是一種由7 800～7 900個堿基對以共價鍵組成的含有遺傳信息的環(huán)狀雙鏈DNA，屬于嗜上皮性病毒，在人類生殖道內分布較多，其引發(fā)的生殖道感染可能在體內潛伏若干年。根據(jù)生物學特征和致癌潛能，HPV分為高危型和低危型兩類，低危型主要引起良性病變如生殖道疣，高危型則與生殖道惡性腫瘤及癌前病變相關[11]。研究已證實HPV感染是宮頸癌致病因素之一，95%～100%的宮頸癌與HPV感染相關[12]。我國婦女宮頸癌中較常見的HPV亞型主要包括HPV16、18、52、58、33、31這六種,其中HPV16、18型是最常見的，約60%的宮頸癌與其相關[13]。HPV基因組有3個編碼區(qū)：早期基因區(qū)(E區(qū))，晚期基因區(qū)(L區(qū))和非編碼蛋白的長調控區(qū)(LCR)。E區(qū)主要編碼早期蛋白E1～E7，其中編碼E6、E7蛋白的基因為轉化基因，可調控病毒的生長和復制，通過參與激活多條信號轉導通路，引起多種腫瘤相關基因如p53、p21、Bcl-2、Bax等的表達異常，從而調節(jié)細胞周期、抑制細胞凋亡、促進增殖，是致癌的關鍵[14,15]。目前研究發(fā)現(xiàn)STAT3作為重要的轉錄因子可與多種E蛋白相互作用，在維持HPV病毒復制及促進宮頸組織惡性轉化過程中發(fā)揮重要作用。

Arany等[16]研究發(fā)現(xiàn)，HPV16 LCR區(qū)的5′端存在有STAT3的結合位點，當環(huán)境中存在大量免疫抑制性細胞因子如IL-10時，STAT3可與HPV16結合促進E7基因表達上調，致使病毒的致瘤作用增強。Shukla等[17]證實在HPV陽性宮頸癌細胞株及腫瘤組織中STAT3和p-STAT3的表達均顯著增高，同時E6、E7蛋白的表達也顯著增加，二者具有相關性，進一步探討其機制發(fā)現(xiàn)STAT3活化后結合HPV16 URR位點，促進E6、E7表達上調，分別通過結合下游p53、Rb基因，誘導p53的降解和促進Rb的失活，引起細胞增殖異常，導致腫瘤發(fā)生[18，19]。

HPV長期感染形成慢性炎癥，炎性細胞分泌多種細胞因子促進下游信號通路的活化可能參與宮頸癌的發(fā)生過程。IL-17是主要由Th17細胞產生的促炎細胞因子，可誘導炎癥相關的多種趨化因子和細胞因子的產生，與多種炎癥性疾病及自身免疫性疾病密切相關。Xue等[20]檢測HPV感染及不同階段宮頸癌患者的血清及宮頸組織中Th17細胞和IL-17的表達變化，結果顯示隨著病變的進展，Th17細胞數(shù)量及IL-17水平均逐步增高，提示Th17細胞和IL-17在HPV感染誘導宮頸癌進展過程中發(fā)揮重要的免疫促進作用。劉曌[21]采用相關性分析研究宮頸癌中HPV感染與IL-17、p-STAT3三者之間的關系，表明HPV感染與IL-17、p-STAT3的表達均呈正相關，推測可能是HPV持續(xù)感染造成IL-17大量產生，通過誘導IL-6激活STAT3信號通路促進腫瘤發(fā)展。

3 STAT3與宮頸上皮內瘤病變

宮頸上皮內瘤變(Cervical intraepithelial neoplasia，CIN)是一組與浸潤性宮頸癌密切相關的癌前病變的統(tǒng)稱，包括宮頸非典型增生和原位癌，反映了宮頸癌發(fā)生發(fā)展的連續(xù)過程，即宮頸上皮重度不典型增生、原位癌、早期浸潤癌、浸潤癌一系列病理變化[22]。CIN分級反映了HPV感染后宮頸黏膜逐步演變?yōu)榻櫺憎[癌的過程。從低級別CIN發(fā)展到高級別病變、CINⅡ期和CINⅢ(原位癌)往往需要數(shù)年或數(shù)十年，因此可能存在促進腫瘤發(fā)生的作用機制。研究表明作為重要的癌基因，STAT3的表達及活化在CIN進展過程中發(fā)生了一系列變化。Yang等[23，24]利用免疫組化方法分析CIN患者病變組織中STAT3及p-STAT3的表達，結果顯示高級別CIN和宮頸癌組織中STAT3的表達水平均顯著高于正常組織及CINⅠ組織；p-STAT3(ser727)主要位于核內表達，在CINⅠ/Ⅱ中陽性表達率為13.33%，在CINⅢ組織中陽性表達率顯著增高達76.92%，而且胞核和胞質中p-STAT3(ser727)的表達均與參與有絲分裂的DNA結合蛋白Ki-67的表達水平呈正相關，提示上皮細胞可能通過活化STAT3信號通路調控下游Ki-67蛋白表達引起細胞異常增殖，參與惡性腫瘤的進展過程。

隨著高級別CIN向宮頸癌發(fā)展，腫瘤細胞突破基底膜形成浸潤與轉移，這一過程主要依賴于細胞外基質的降解，其中金屬基質蛋白酶9(Matrix metallproteinase9，MMP-9)因可水解基底膜和細胞外基質中的Ⅳ型膠原等多種成分而被認為是重要的分子之一。Nadine等[25]研究進一步證實CIN Ⅲ中p-STAT3(tyr 705)及MMP-9的表達均顯著升高。同時他們也闡釋了一種新的分子級聯(lián)機制，即STAT3活化后通過Ca+依賴的CCL2/CCR2信號募集大量單核細胞到達CIN，活化的單核細胞分泌產生大量MMP-9促進對基質的降解，加速CIN向惡性腫瘤進展，而且與經典炎癥免疫反應NK-κb通路相比，由STAT3介導的炎癥反應可能發(fā)揮更大的促腫瘤作用。

4 STAT3促進宮頸癌發(fā)生與發(fā)展

4.1STAT3參與調節(jié)腫瘤細胞周期、增殖與凋亡 腫瘤細胞的增殖失控表現(xiàn)為細胞周期調控的紊亂，S期激酶相關蛋白2(S-phase associated kinase protein 2，Skp2)是細胞進入S期的重要調控蛋白，主要通過特異性識別磷酸化底物并介導其泛素化降解，其中細胞周期負性調節(jié)因子p27是其重要的底物之一。在腫瘤發(fā)生中，過表達的Skp2使細胞通過G1/S調控點，促進細胞周期的進展，加快DNA的復制與細胞的增殖，被視為是一種原癌基因，具有癌基因的功能。呂育純等[26]對65例宮頸鱗狀細胞癌(SCC)、20例高級別宮頸上皮內瘤變(CIN)中Skp2的表達情況進行分析，結果顯示Skp2在SCC組的陽性表達率為55.4%，顯著高于CIN組及對照組，而且其表達與腫瘤的病理分級、浸潤程度、脈管浸潤、淋巴結轉移密切相關，Skp2表達水平越高提示患者預后越差。Huang等[27]進一步研究證實，IL-6處理HeLa后，細胞內的STAT3表達顯著增強，STAT3通過直接結合Skp2啟動子，招募P300的聚集，調控Skp2/p27信號通路影響細胞的增殖周期,從而使腫瘤細胞的增殖異常增多。常玉珍等[28]發(fā)現(xiàn)STAT3在宮頸癌組織中的表達水平較正常宮頸組織顯著上調，且隨病程的進展，STAT3 mRNA的表達水平也增高，與凋亡抑制蛋白Survivin的表達呈等級正相關，而Survivin和NF-κB的表達正相關，提示Survivin、STAT3、NF-κB可能發(fā)揮多基因協(xié)同作用，通過促進腫瘤細胞增殖和抑制凋亡促進宮頸癌的發(fā)展。

4.2STAT3與腫瘤微環(huán)境 腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment)是一個由腫瘤細胞誘導，在其周圍產生大量的生長因子、趨化因子及基質降解酶的綜合體系，主要包括腫瘤細胞、基質細胞、細胞因子和免疫細胞等多種成分，具有低氧、低pH、組織高壓等特點[29]。腫瘤相關成纖維細胞(Cancer-associated fibroblasts，CAFs)是腫瘤微環(huán)境中重要的間質細胞之一，主要來源于上皮或內皮間質轉化、間充質干細胞的募集以及靜息態(tài)成纖維細胞的激活。它可通過分泌大量的生長因子如VEGF、TGF-β、IL-6等促進上皮腫瘤的侵襲和轉移。IL-6被認為是銜接炎癥與腫瘤的核心細胞因子，在促進腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用。研究表明CAFs中細胞因子IL-6的含量顯著升高，是腫瘤微環(huán)境中IL-6的主要來源之一[30]。在宮頸癌中IL-6能激活STAT3磷酸化，上調VEGF、VEGF2、低氧誘導因子-1α(Hypoxia-indu-cible factor,HIF-1α)和Neuropilin(NRP1)等的表達，促進腫瘤新生血管生成[31]。任春霞等[32]進一步證實CAFs通過旁分泌IL-6促進HeLa細胞STAT3磷酸化，而且HeLa細胞表面間充質細胞標記物Vimentin和N-Cadherin升高，上皮細胞標記物E-Cadherin和Cytokeratin下降，表明細胞發(fā)生EMT,而且干細胞轉錄因子Snail隨STAT3的活化而升高，提示CAFs受腫瘤微環(huán)境影響可能通過IL-6/STAT3/Snail通路誘導宮頸癌EMT的發(fā)生和促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。

4.3STAT3參與維持腫瘤干細胞特性 腫瘤干細胞是宮頸癌復發(fā)與化療耐藥的重要原因之一，STAT3通過調節(jié)干細胞相關的轉錄因子的表達，參與調節(jié)維持腫瘤干細胞的表型及多能干性。Wang等[33]通過構建過表達STAT3質粒轉染Siha細胞，結果顯示形成典型的非黏附干細胞球，干細胞相關因子Oct4、Nanog、Sox2的mRNA和蛋白水平表達均顯著增高，免疫組化染色結果顯示，在宮頸癌組織中STAT3、Nanog、Oct4、Sox2的陽性表達率顯著高于慢性宮頸炎組，而且STAT3與Nanog或Oct4或Sox2表達有顯著正相關，表明STAT3可能參與調控干細胞群并維持干細胞特性，有助于宮頸癌的發(fā)生。

Piwl2屬于PIWI/AGO家族，在胚胎干細胞和生殖干細胞中廣泛表達，在腫瘤癌前干細胞中高表達，被認為是腫瘤干細胞特異性標志物之一。He等[34]研究表明，Piwl2在91例不同階段和不同病變類型的宮頸癌癌前病變和惡性病變組織中的表達率是100%。進一步研究表明高危型HPV致癌蛋白E6/E7能夠重啟Piwil2表達，繼而通過表觀遺傳途徑使體細胞基因序列發(fā)生重編程，促使腫瘤起始細胞形成。Piwil2表達增強可通過活化STAT3，激活下游信號通路，p53蛋白水平顯著降低，cyclinD1表達上調，從而提高腫瘤細胞增殖活性、抑制細胞凋亡，上調耐藥性。

4.4STAT3負調控減弱與宮頸癌的關系 STAT3負調控機制的減弱也可能是STAT3激活并導致宮頸癌發(fā)生的原因。PIAS3(Protein inhibitor of activated STAT 3)是STAT3特異性蛋白抑制劑，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，它可以直接或通過招募核內共抑制分子，干擾STAT3與DNA結合，使之不能參與轉錄。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌腫瘤組織中PIAS3表達顯著降低，而且與STAT3的核轉移呈顯著負相關[35]，提示其負調控機制發(fā)生失調，從而促進宮頸癌的發(fā)生。SOCS3(Suppressors of cytokine signaling 3)基因作為一種潛在的抑癌基因，其作用機制主要通過掩蓋結合位點或者去除信號組間復合物，競爭性抑制STAT3磷酸化酪氨酸位點，從而抑制STAT3的活化，參與調控多種細胞生物學功能[36]。SOCS3基因啟動子區(qū)的異常甲基化常見于多種惡性腫瘤中，甲基化導致的基因轉錄異常與惡性腫瘤的行為相關[37]。孫沛琳等[38]采用甲基化特異性PCR方法檢測不同宮頸組織中SOCS3基因甲基化的狀況，發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中SOCS3基因甲基化率為43.3%(13/30)，CIN組的甲基化率為13.3%(4/30)，正常宮頸組織中SOCS3的甲基化率為3.3%(1/30)，同時檢測宮頸癌組織中甲基化SOCS3基因轉錄水平的表達，顯示其顯著低于正常宮頸組，表明 SOCS3基因的甲基化引起基因轉錄沉默，基因表達降低，失去對STAT3的負調控作用，無法正常發(fā)揮潛在的抑癌功能，促進宮頸癌的發(fā)生。

4.5miRNA調控STAT3參與宮頸癌的發(fā)生 微小RNA(microRNA，miRNA)是一種內源表達的長度為18～22個核苷酸的單鏈小RNA分子，屬于非編碼RNA的一種,主要通過與互補的mRNA的3′非編碼區(qū)(3′-Untranslated Region,3′-UTR)結合，在轉錄后水平對靶基因mRNA進行降解或抑制其翻譯。miRNA參與機體多種細胞功能，對正常細胞的生長、分化和凋亡發(fā)揮相應的生理功能，但也與細胞炎癥、腫瘤等病理過程密切相關。約有50%已闡明的人類miRNA位于與癌癥相關的染色體脆性位點或其他腫瘤相關染色體區(qū)，且?guī)缀跛械哪[瘤都存在miRNA 的表達異常[39]。研究表明，宮頸癌中也存在不同家族miRNA的異常，其中部分成員通過調控STAT3的表達影響腫瘤的發(fā)生與進展。

miR-125家族包括miR-125a、miR-125b-1、miR125b-2 三種同系物，參與正常細胞的細胞分化、免疫反應、細胞代謝等多種生理功能。Fan等[40]研究發(fā)現(xiàn)，miR-125a在宮頸癌組織中顯著減少，其表達水平與腫瘤大小、FIGO分期和術前轉移呈負相關。進一步研究證實，STAT3是miR-125a的一個直接靶點，過表達miR-125a可通過降低STAT3的表達，顯著抑制宮頸癌細胞的生長、侵襲和上皮間質轉化。miR-128在細胞的自我更新行為中發(fā)揮重要的調節(jié)作用，楊林青[41]研究發(fā)現(xiàn)，miR-128能顯著促進宮頸細胞的增殖能力，能直接結合并上調腺苷酸轉移激酶(Adenylate kinases 2,AK2)，AK2的過表達可以直接調控STAT3磷酸化的激活，繼而影響STAT3信號通路，干擾宮頸癌細胞生物學行為。此外，miRNA-218、miRNA-411在宮頸癌組織中顯著減少，其表達水平與STAT3 mRNA呈負相關[42，43],恢復STAT3的表達水平可直接逆轉miR-411過表達引起的抗腫瘤作用，提示其通過直接靶向抑制STAT3的表達發(fā)揮抑癌基因的作用，從而抑制宮頸癌的發(fā)展。

5 靶向STAT3信號通路對宮頸癌的抑制作用

基于STAT3與宮頸癌的進展密切相關，通過阻斷STAT3通路來治療腫瘤，已成為新型抗腫瘤藥物尤其是抗宮頸癌復發(fā)與轉移的潛在靶標。

5.1RNA干擾技術 RNA干擾是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA引發(fā)的體內序列特異性基因轉錄后的基因沉默過程，由于其具有序列特異性和抑制基因表達的高效性，成為一種功能強大的選擇性抑制基因表達的工具，為腫瘤基因治療提供新的思路。siRNA可與靶mRNA特異性結合形成高效沉默復合體，STAT3基因沉默后，特異性抑制STAT3蛋白表達及磷酸化，阻斷STAT3活性調節(jié)因子、下游靶基因表達，明顯抑制腫瘤細胞生長增殖，還可誘導IL-6、IL-10、VEGF等免疫抑制因子表達下降，提高腫瘤細胞的放射敏感性，促進細胞內化療藥物蓄積量，抑制轉移和侵襲進展。吳維光等[44]成功構建了針對STAT3基因的短發(fā)夾siRNA的表達載體，轉染HeLa細胞，有效抑制STAT3基因表達，細胞集落數(shù)和穿透Matrigel膜的細胞數(shù)量均明顯減少，表明抑制STAT3能有效抑制HeLa細胞的定植和侵襲能力。

5.2反義寡核苷酸技術 反義寡核苷酸技術是利用反義核酸與靶RNA通過堿基互補配對的原理，使反義核酸參與基因的表達調控，具有高度選擇性和特異性，可以特異地阻斷致癌基因的過度表達而不影響其他基因的正常功能。孫兆翎等[45]證實反義STAT3轉染HeLa細胞后，STAT3基因的mRNA和蛋白表達水平均降低，其形成的克隆細胞集落數(shù)顯著低于對照組，細胞侵襲能力也顯著降低，表明采用反義寡核苷酸技術能有效抑制HeLa細胞的定植和侵襲能力，其作用機制可能通過抑制STAT3的表達，抑制了與腫瘤細胞浸潤及遠端轉移密切相關的基因如MMPs、VEGF等的表達。

6 結語

綜上所述，大量研究證實STAT3在HPV感染-CIN-宮頸癌變發(fā)展過程中均發(fā)揮了重要作用，由于其上游信號分子的持續(xù)激活及STAT3負性調節(jié)無法及時終止活化，引起宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移。通過直接或間接阻斷STAT3途徑，可抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲和遷移，促進腫瘤細胞的凋亡，特異性靶向、抑制STAT3并聯(lián)合應用放、化療方法對提高宮頸癌患者的遠期療效具有一定的市場前景和科研價值。但由于腫瘤微環(huán)境中存在多因素、多基因參與的信號通路，特異性靶向STAT3是否可以特異性殺傷腫瘤細胞，是否通過上、下游因子對其他參與正常細胞增殖、代謝的信號通路產生影響等問題都有待進一步的詳細研究。