張智慧，閆朝麗

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059）

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus, T2DM）是一種慢性全身性代謝性疾病，由環(huán)境因素和遺傳因素共同引起。其主要病因是胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗（insulin resistance, IR）。2013年全國調(diào)查中T2DM患病率為10.4%，男性（11.1%）多于女性（9.6%）[1]。然而，隨著血清蛋白組學(xué)研究的深入，使得一些與疾病特定狀態(tài)相關(guān)的生物標(biāo)志分子被發(fā)現(xiàn)，這為解釋疾病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，預(yù)防和診斷T2DM及糖尿病相關(guān)藥物的開發(fā)提供了思路。本文就蛋白質(zhì)組學(xué)方法學(xué)、T2DM與炎癥因子及脂代謝相關(guān)因子機(jī)制與關(guān)系作一綜述。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)概述

生命的各項活動都離不開蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)是機(jī)體各項功能的執(zhí)行者。蛋白質(zhì)組學(xué)是從1個細(xì)胞或組織的蛋白質(zhì)整體活動角度來研究生命現(xiàn)象。通過比較分析病理及正常個體間的蛋白質(zhì)組，找到一些與疾病相關(guān)的特異性蛋白和標(biāo)志蛋白。其不僅可作為疾病診斷的血清學(xué)依據(jù)，而且為新藥的設(shè)計提供參考分子靶點[2]。

1.1 血清蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)方法

蛋白質(zhì)組研究主要分為兩步，首先從樣品中分離出蛋白質(zhì)，然后鑒定被分離的蛋白質(zhì)。其兩大關(guān)鍵核心技術(shù)是：雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜鑒定技術(shù)[3-5]。同時由于技術(shù)的局限性，近年來也出現(xiàn)多維液相色譜和蛋白質(zhì)芯片等，以下就相關(guān)技術(shù)作一闡述。

1.1.1 雙相凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE） 2-DE被認(rèn)為是目前蛋白質(zhì)組學(xué)中不可替代的核心技術(shù)。首先分辨率很高，可分離1 000多種蛋白質(zhì)；其次敏感性高，可檢測到納克級水平蛋白質(zhì)；再次通量高，在同一條件同一細(xì)胞組織中同時分析多種蛋白。2-DE的第一向進(jìn)行等電聚焦，蛋白質(zhì)沿pH梯度分離至各自的等電點；第二向沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離，從而直觀地分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組分的等電點、相對分子量和表達(dá)豐度的相對量等信息。

1.1.2 多維液相色譜（multidimensional liquid chromatography tandem, MDLC） MDLC能夠檢測出在2-DE前處理中丟失的蛋白，使其獲得的蛋白質(zhì)更完整，但分離能力還不是很高。其中高效液相色譜和毛細(xì)血管電泳（capillary electrophoresis, CE）作為2-DE互補(bǔ)的血清蛋白質(zhì)和多肽的分離分析新手段得到迅速發(fā)展，成為生物大分子快速分離鑒定的有力工具。反相液相色譜作為多維色譜分離中最后一維的分離模式，這是由于其分離效率高、分析速度快、流動相組分及質(zhì)譜匹配等優(yōu)點。而離子交換色譜、親和色譜等與CE模式可作為各種復(fù)雜樣品的預(yù)分離模式。在蛋白組學(xué)的研究中，多維液相分離系統(tǒng)將會是2-DE的有益補(bǔ)充。

1.1.3 生物質(zhì)譜 蛋白組學(xué)中最為重要的鑒定技術(shù)即生物質(zhì)譜。其基本原理是將樣品分子離子化，通過離子鍵質(zhì)荷比記錄，從而將得到的質(zhì)譜圖與已知質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比樣對照，確定待測化合物的屬性。盡管質(zhì)譜技術(shù)分離分析能力強(qiáng)大，但卻難以區(qū)分2種同源性極高的蛋白，只能分離氣體狀態(tài)的帶電分子。其中電子噴霧電離質(zhì)譜測量法和基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜測量法最為常用。

1.1.4 蛋白質(zhì)芯片 蛋白質(zhì)芯片是一種蛋白質(zhì)分析技術(shù)，是基因芯片的補(bǔ)充。其在同一時間向以蛋白質(zhì)或多肽為材料分析整個蛋白質(zhì)組。蛋白質(zhì)芯片和質(zhì)譜分析技術(shù)目前被聯(lián)合用來研究差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，即通過不同的蛋白樣品和同一蛋白質(zhì)芯片相互作用，洗掉未結(jié)合的蛋白質(zhì)，再利用質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定。對于低分子量、低豐度，以及疏水的蛋白質(zhì)血清及組織粗樣品的直接檢測最為適用。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在T2DM中的應(yīng)用

2.1 T2DM急性時相期蛋白

近年來，部分學(xué)者認(rèn)為T2DM可能與炎癥相關(guān)，認(rèn)為T2DM是一種低度炎癥及自然免疫性的慢性疾病[6]。C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein, CRP）、α2-巨球蛋白（α2-macroglobulin, α2-M）是T2DM臨床上較為敏感的標(biāo)志物。

2.1.1 CRP CRP是一種急性期蛋白，由于組織損傷或刺激后在肝臟產(chǎn)生。其以非共價鍵形式結(jié)合，形成環(huán)狀五球體。CRP不僅可以與多種自身配體或外來配體結(jié)合，被C1q識別，進(jìn)而激活補(bǔ)體活化的經(jīng)典途徑，成為機(jī)體的防御功能的重要組分，而且可以限制由于補(bǔ)體激活后的炎癥反應(yīng)所帶來的潛在破壞性[7]。LI等[8]研究認(rèn)為T2DM是易感個體，因各種因素作用致先天性免疫系統(tǒng)被激活，產(chǎn)生多種炎癥反應(yīng)因子，從而參與IR和代謝綜合征（metabolic syndrome, MS）的發(fā)生、發(fā)展。

譚英[9]通過觀察不同體重指數(shù)（body mass index,BMI）糖尿病患者血清中CRP含量，發(fā)現(xiàn)CRP與BMI、胰島素抵抗指數(shù)（the insulin resistance index,HOMR-IR）呈正相關(guān)，與胰島素敏感指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。這表明炎癥反應(yīng)與肥胖關(guān)系密切，同時也說明炎癥反應(yīng)激活可能參與IR，因為CRP是臨床最有效的炎癥反應(yīng)標(biāo)志物。陳春蓮等[10]研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者血清CRP水平高于健康者，進(jìn)一步證明炎癥參與T2DM的發(fā)生、發(fā)展。

RIAZ等[11]比較糖尿病患者和健康人群血清中差異蛋白質(zhì)水平的變化，為增加準(zhǔn)確性，實驗利用單向電泳和2-DE找到差異蛋白，平行進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，CRP增加872%，因此，RIAZ等[11]認(rèn)為糖尿病人群中CRP的增加支持糖尿病的發(fā)生與炎癥和肥胖有關(guān)這一觀點。

2.1.2 α2-M α2-M作為一種蛋白質(zhì)在血漿中分子量最大，主要由肝細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)合成。是一種內(nèi)源性蛋白酶抑制劑，同時也充當(dāng)細(xì)胞因子/生長因子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與多功能結(jié)合蛋白。該蛋白質(zhì)的分子量為180 kD，但約720 kD分子量的四聚體形式也存在于血清中[12]。

α2-M血漿水平升高代表著生命的生長、發(fā)育及分化，在胚胎發(fā)育、妊娠和兒童期有著重要的意義。大多數(shù)疾病情況下α2-M濃度不發(fā)生變化，成人每天大約可以代謝分解掉10%α2-M。α2-M與蛋白酶結(jié)合形成的復(fù)合物，由于發(fā)生構(gòu)象改變被有關(guān)細(xì)胞受體識別，快速從血循環(huán)中被清除。生理狀態(tài)下，與多種分子或離子結(jié)合是α2-M最突出的功能，特別是與多種蛋白水解酶結(jié)合從而影響這些酶的活性[13]。而在炎癥和感染等病理情況下，α2-M在機(jī)體合成大量增加，同時與過量產(chǎn)生的蛋白水解酶結(jié)合并加速其清除，以起到保護(hù)組織免于炎癥或免疫損傷的作用。因而，α2-M的作用主要表現(xiàn)為消除組織中內(nèi)源性和外源性的蛋白酶，與某些蛋白酶抑制因子共同調(diào)節(jié)控制蛋白水解活性[14]。

TAKADA等[15]通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者中的單體α2-M增加，然而其四聚體形式只是略微增加。α2-M不僅是心臟肥大和糖尿病性心肌梗死的早期分子標(biāo)志，同時也是參與心臟及動脈粥樣硬化的急性期血清生物標(biāo)志物的蛋白質(zhì)，而在糖尿病初期就表現(xiàn)為上調(diào)。因此，TAKADA等[15]認(rèn)為在人類血漿中α2-M解離的單體形式可能會成為診斷T2DM的重要生物標(biāo)志物。

2.2 T2DM的脂代謝紊亂

T2DM與IR關(guān)系密切，脂肪組織不僅可貯存能量，而且可分泌某些生理活性物質(zhì)來影響胰島素的敏感性，影響人體內(nèi)血糖的調(diào)節(jié)，因此脂代謝可能也參與T2DM的發(fā)生、發(fā)展。而載脂蛋白A1（apolipoprotein A1, Apo A1）、叢生蛋白（Clusterin, CLU）和鋅-α-2糖蛋白（Zinc-alpha-2-glycoprotein, ZAG）的研究較為廣泛。

2.2.1 載脂蛋白A1 載脂蛋白作為血漿脂蛋白的組成部分，其不但可轉(zhuǎn)運(yùn)脂類物質(zhì)并穩(wěn)定脂蛋白的結(jié)構(gòu)，甚至可激活脂蛋白代謝酶、促進(jìn)脂類運(yùn)輸、調(diào)節(jié)酶活性和引導(dǎo)血漿脂蛋白同細(xì)胞表面受體結(jié)合。Apo A1是高密度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL）中的主要載脂蛋白[16]。

RIAZ等[11]通過單向電泳和2-DE 2種方法尋找糖尿病患者和健康人群血清中蛋白質(zhì)的差異，并通過質(zhì)譜分析比較相關(guān)差異蛋白的變化。與健康人群相比糖尿病患者Apo A1下調(diào)，同時其認(rèn)為Apo A1與肥胖相關(guān)，因此可作為參與T2DM發(fā)生、發(fā)展的生物標(biāo)志物[11]。

JIANG等[17]認(rèn)為，在肥胖、IR及T2DM中，Apo A1降低常伴隨著Apo B升高，Apo B/Apo A1是高血壓、MS和糖尿病的危險因子，Apo B/Apo A1比值適用于糖尿病、肥胖人群的風(fēng)險評估，具有臨床意義。

2.2.2 CLU CLU別名載脂蛋白J和分泌蛋白40-40。生理狀態(tài)下，主要參與組織修復(fù)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、補(bǔ)體抑制及細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程。病理條件下，CLU被認(rèn)為是癌癥、神經(jīng)退行性疾病、腎小球腎炎及心肌梗死等多種疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的有效因素。

CLU通常被認(rèn)為主要與HDL相關(guān)，尤其富含于HDL 3小分支。HOOFNAGLE等[18]通過同位素稀釋質(zhì)譜法對HDL、低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）、極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein,VLDL）、總膽固醇、甘油三酯（Triglyceride, TG）等蛋白質(zhì)進(jìn)行研究表明，在HDL較低與TG較高的人群中，CLU水平均較低，這成為發(fā)展為代謝綜合征的主要組成部分。HOOFNAGLE等[18]發(fā)現(xiàn)HDL中的CLU水平與胰島素敏感性呈正相關(guān)；與肥胖及脂代謝紊亂呈負(fù)相關(guān)，相比之下，其他類型的蛋白質(zhì)與代謝綜合征的這些特征并無相關(guān)。因此CLU的損耗表明存在著功能失調(diào)的HDL。這一發(fā)現(xiàn)，結(jié)合Apo B相關(guān)脂蛋白和IR中CLU水平的直接聯(lián)系，增加IR可能將蛋白質(zhì)從HDL轉(zhuǎn)變?yōu)閂LDL和LDL的可能性，而脂類代謝的改變繼發(fā)于IR與代謝綜合征HDL中CLU的減低。

2.2.3 ZAG ZAG是新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，其促進(jìn)脂類降解的同時還可以調(diào)節(jié)脂類代謝，促進(jìn)脂肪酸氧化，活化解偶聯(lián)蛋白增加產(chǎn)熱。ZAG還可通過自分泌或旁分泌的方式影響其他脂肪因子的表達(dá)，如促進(jìn)脂聯(lián)素、抑制瘦素在脂肪組織中的表達(dá)[19]。故認(rèn)為與肥胖、IR密切相關(guān)。

劉瑞等[20]研究發(fā)現(xiàn)，空腹血清ZAG水平在肥胖、糖耐量受損、T2DM組中較正常對照組減低，提示ZAG可能與糖脂代謝紊亂和肥胖有重要的關(guān)系。

RUSSELL等[21]將從人血漿中純化的ZAG，按94種不同劑量腹腔注射雄性NMRI小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZAG對降低小鼠BMI具有時間和劑量依賴性。體脂分析表明，小鼠BMI減少的主要原因是脂肪含量減少。證實了人體內(nèi)ZAG與BMI有關(guān)。YANG等[22]研究發(fā)現(xiàn)，血漿中HDL、脂聯(lián)素與ZAG呈正相關(guān)。BMI、腰臀圍、體脂比、TG、空腹胰島素和HOMR-IR等與ZAG呈負(fù)相關(guān)。ZAG水平在糖尿病患者中低于糖尿病前期患者，多囊卵巢綜合征女性與健康女性相比ZAG水平減低。

因此，ZAG可能作為一個與肥胖及肥胖相關(guān)的IR的生物標(biāo)志物。SELVA等[23]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中ZAG水平與ZAG mRNA水平呈正相關(guān)，因此，其認(rèn)為脂肪組織對ZAG影響重大。

3 現(xiàn)狀與展望

近年來，蛋白組學(xué)在腫瘤、心血管等重大疾病血清的研究中被廣泛應(yīng)用。然而其研究才剛剛起步，因此重復(fù)性不理想，一些低豐度蛋白難以鑒定，研究耗時且費(fèi)用昂貴，研究依舊集中在比較T2DM個體與健康個體的組織和血清等樣品，仍處于對疾病研究初期的摸索階段。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷完善，有望獲得在病理狀態(tài)下異常表達(dá)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物。最終可用于全面了解生理和病理狀態(tài)下T2DM蛋白質(zhì)的質(zhì)譜變化，篩選出重要診斷依據(jù)。這不僅對更好地理解T2DM的病理、生理有益，同時也有助于發(fā)現(xiàn)疾病的新靶點。