李 杰， 閆振宇,2*

(1.華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000；2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 唐山 063000)

血友病 (hemophilia) 是由編碼凝血因子VIII(coagulation factor VIII，F(xiàn)VIII)和(或)凝血因子IX(coagulation factor IX，F(xiàn)IX)的基因突變，引起的一組X連鎖隱性遺傳性疾病。這種遺傳缺陷引起體內(nèi)FVIII和(或)FIX的缺乏或者功能缺陷，從而導(dǎo)致體內(nèi)凝血功能障礙，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[1]。疾病可分為由FVIII功能異常導(dǎo)致的血友病A (hemophilia A，HA)與由FIX異常所致的血友病 B (hemophilia B，HB)，絕大多數(shù)血友病患者為男性。研究數(shù)據(jù)表明，在5000男性活嬰中大約就有1人為HA患者[2]。相比于HA，HB發(fā)病率較低，在男性中發(fā)病率約為1/25 000[3]。血友病的臨床表現(xiàn)主要為反復(fù)出血及因血腫壓迫所導(dǎo)致的軀體畸形等，嚴(yán)重時(shí)可能因顱內(nèi)部位出血導(dǎo)致患者面臨生命危機(jī)。該疾病目前尚無(wú)有效的治愈方法。血友病的治療先后經(jīng)歷了從二戰(zhàn)時(shí)期開(kāi)始的全血及新鮮冰凍血漿的輸注，到冷沉淀，凝血酶原復(fù)合物及凝血因子制劑等治療手段。但是這些血液制品等長(zhǎng)期輸注，導(dǎo)致了血源性傳染性疾病等發(fā)病幾率的大大提高。國(guó)外學(xué)者曾有報(bào)告[4-5]，在20世紀(jì)80年代末的美國(guó)，受污染的血液制品導(dǎo)致近50%的血友病患者感染艾滋病。血漿源性凝血因子或基因重組凝血因子的應(yīng)用雖然可以降低血源性傳染病發(fā)生的幾率，但是長(zhǎng)期使用后體內(nèi)易產(chǎn)生抗體，即抑制物。這種抑制物的產(chǎn)生，是替代治療的嚴(yán)重并發(fā)癥。研究表明，血友病患者體內(nèi)抑制物的出現(xiàn)，將大幅度降低輸注FVIII、FIX制劑的治療效果，患者出血頻率增加，出血癥狀較前明顯加重，治療更為困難[6]。另一方面高昂的費(fèi)用使得終生預(yù)防性治療難以廣泛開(kāi)展[7-8]。臨床方面需要新的治療手段來(lái)減少患者疾病及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，需要尋找治愈血友病的治療方法。血友病作為單基因遺傳性疾病中的一種，基因治療有望成為血友病患者凝血因子濃縮物的治愈療法，并在國(guó)際上得到廣泛關(guān)注。

在基因治療中，血友病動(dòng)物模型的構(gòu)建在治療研究中具有重要的基礎(chǔ)支持作用。血友病鼠模型的構(gòu)建成功，極大的促進(jìn)了血友病基因治療的研究進(jìn)展。現(xiàn)就血友病鼠的構(gòu)建及研究進(jìn)展予以綜述。

1 血友病小鼠模型的初次構(gòu)建

70余年前，科學(xué)家在自然界中，發(fā)現(xiàn)了一種具有類似血友病臨床表型的狗，在發(fā)現(xiàn)之后，這種狗經(jīng)過(guò)保種、繁育直至1989年，基因技術(shù)有了一定進(jìn)展，才被證實(shí)這種狗因體內(nèi)編碼FIX的基因突變導(dǎo)致該凝血因子活性喪失，其發(fā)病機(jī)制及臨床病理方面與人類HB極為類似，從而成為了血友病基因治療的動(dòng)物模型[9]。

1998年，Monahan等[10]發(fā)表文獻(xiàn)，用這種天然的血友病犬模型進(jìn)行基因治療的臨床前動(dòng)物試驗(yàn)，獲得了令人滿意的結(jié)果。但是考慮到這種動(dòng)物模型資源有限，價(jià)格高昂，并且在取材方面費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，這種血友病犬模型不能較為廣泛的應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究。所以，需要進(jìn)一步找尋或者是構(gòu)建其它動(dòng)物模型，供應(yīng)研究使用。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，“基因打靶”已成為一個(gè)熱點(diǎn)。所謂“基因打靶”是指通過(guò)將目標(biāo)細(xì)胞中的外源DNA和染色體DNA的同源序列進(jìn)行同源重組,從而達(dá)到修飾染色體上特定基因的目的[11]。這種基因修飾方法被廣泛應(yīng)用于研究中。

早在1992年，Hooper等[12]通過(guò)應(yīng)用小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES) 基因打靶技術(shù)，成功地對(duì)小鼠基因組中的片段進(jìn)行設(shè)計(jì)及修飾，并且這種修飾后的基因在整體動(dòng)物水平中得到表達(dá)，并且在后代中仍可發(fā)現(xiàn)，表明其可以進(jìn)行基因的傳遞。在此之后，有文獻(xiàn)指出[13-14]，依據(jù)基因打靶原理，美國(guó)科學(xué)家使用ES細(xì)胞同源重組技術(shù)將Neo基因分別插入編碼小鼠mFVIII的基因外顯子16和外顯子17的3′末端，成功獲得HA小鼠模型。

隨后，國(guó)外學(xué)者使用基因敲除方法將mFIX基因敲除，在1997年成功建立了HB小鼠模型[15]。在同一時(shí)期，在血友病的基因治療研究中，我國(guó)也取得了巨大的研究進(jìn)展[16-17]。但是，這也要求適合的血友病動(dòng)物模型的產(chǎn)生，來(lái)進(jìn)一步完善臨床前實(shí)驗(yàn)，評(píng)估基因治療的安全性及有效性。1998年，戴旭明等[18]根據(jù)基因打靶的基礎(chǔ)原理，成功地構(gòu)建針對(duì)小鼠mFIX基因的基因打靶置換型載體pMFIX DEL，并于同年報(bào)道，利用該載體進(jìn)行定向敲除小鼠ES細(xì)胞中mFIX基因，培育出缺乏mFIX小鼠，奠定了建立HB的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的基礎(chǔ)[19]。

2 血友病小鼠模型特點(diǎn)的研究

隨著血友病小鼠模型的構(gòu)建成功，對(duì)于血友病的基因治療起了重要作用，同時(shí)研究人員也對(duì)這種模型是否適用基因治療，進(jìn)行了探討及深入研究，最終證實(shí)其模型確實(shí)適用，并對(duì)于基因治療具有極大的推動(dòng)潛能。例如，我國(guó)學(xué)者于1999年發(fā)表文獻(xiàn)[20]指出，mFIX基因剔除小鼠在繁殖過(guò)程中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)突變的基因具有重新回復(fù)為正?；虻内厔?shì)，也沒(méi)有觀察到未被敲除的負(fù)責(zé)編碼mFIX的基因部分被RNA轉(zhuǎn)錄，并合成蛋白的現(xiàn)象，從而證明這種基因剔除小鼠具有遺傳穩(wěn)定性。同時(shí)在該研究中，通過(guò)測(cè)得凝血功能及凝血因子活性結(jié)果，證實(shí)這種血友病小鼠模型符合標(biāo)準(zhǔn)，適用于此后的深入研究。另外也指出，測(cè)量方式的正確選擇對(duì)于指標(biāo)的判讀非常重要。孫偉等[21]對(duì)于血友病鼠的飼養(yǎng)及保種進(jìn)行研究，他們經(jīng)過(guò)4年的時(shí)間，通過(guò)對(duì)mFIX基因剔除小鼠采取選優(yōu)法，并對(duì)于生長(zhǎng)、繁殖及臨床表現(xiàn)等研究發(fā)現(xiàn)，這種動(dòng)物模遺傳符合孟德?tīng)柗蛛x及自由組合定律，從而也證明了其遺傳具有穩(wěn)定性的特點(diǎn)，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供寶貴的證據(jù)。此后，他們?cè)?003年報(bào)道[22]，經(jīng)過(guò)12代血友病小鼠模型的飼養(yǎng)及選育工作，建立了成熟的mFIX基因剔除小鼠的近交系；在研究和充分觀察血友病小鼠模型的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)mFIX基因敲除小鼠具有低離乳率和高死亡率，考慮與該動(dòng)物模型本身有出血傾向有關(guān)，指出在培育及飼養(yǎng)時(shí)，應(yīng)將構(gòu)建好的模型小鼠放于單籠精心喂養(yǎng)。該試驗(yàn)為以后的血友病小鼠模型的研究提供了科學(xué)的數(shù)據(jù)支持，并提供了該動(dòng)物模型的選育及保種等方面的寶貴的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3 血友病小鼠模型的改進(jìn)

隨著基因技術(shù)的不斷發(fā)展，人們認(rèn)識(shí)到，位于不同區(qū)域的基因或者是不同類型的基因發(fā)生改變，往往會(huì)產(chǎn)生不同類型的結(jié)果。對(duì)于血友病這種疾病來(lái)說(shuō)，更是如此。不同區(qū)域基因的變化導(dǎo)致凝血因子產(chǎn)生過(guò)程中的相應(yīng)異常，對(duì)于體內(nèi)凝血因子的活性及功能產(chǎn)生不同的影響。這種情況可能造成了血友病的臨床治療方面所遇到的種種問(wèn)題。這些問(wèn)題可能與患者的遺傳差異導(dǎo)致的凝血因子表型的不同有關(guān)[23-25]。

根據(jù)研究，血友病主要由點(diǎn)突變和基因缺失引起[26-27]。傳統(tǒng)的小鼠血友病模型是基于基因打靶原理，用同源重組載體代替大片段，利用大片段的缺失造成mFIX基因的遺傳缺陷[15]。由此產(chǎn)生的HB小鼠模型通常不適合進(jìn)一步的研究和應(yīng)用，因?yàn)镈NA的大規(guī)模缺失導(dǎo)致對(duì)鄰近基因的影響。這就要求要有新型的血友病動(dòng)物模型的產(chǎn)生，以適應(yīng)研究進(jìn)展。車文良等[28]于2002年指出，通過(guò)在mFIX基因剔除小鼠的基礎(chǔ)上，對(duì)含hFIX基因的表達(dá)載體引入點(diǎn)突變，在mFIX基因剔除小鼠受精卵雄原核上導(dǎo)入線性化的pMe4bAIXml質(zhì)粒(此質(zhì)粒為研究中通過(guò)采用體外定點(diǎn)突變技術(shù)制備的一種含有IX基因的表達(dá)載體)。在小鼠出生后，測(cè)定結(jié)果顯示小鼠體內(nèi)含有目的基因，說(shuō)明成功地構(gòu)建出了HB小鼠模型，這種動(dòng)物模型是對(duì)于之前的傳統(tǒng)的基因打靶法構(gòu)建血友病小鼠模型進(jìn)行的改良。

盡管早在上世紀(jì)90年代，HA小鼠模型就初次構(gòu)建成功，但是對(duì)于我國(guó)科學(xué)研究者來(lái)說(shuō)，這種動(dòng)物模型在引進(jìn)手續(xù)、費(fèi)用等方方面面的問(wèn)題制約著國(guó)內(nèi)研究的發(fā)展。為此，我國(guó)學(xué)者努力嘗試制備血友病鼠模型。并于2010年指出，成功構(gòu)建了我國(guó)第一例HA小鼠模型。在實(shí)驗(yàn)研究中，匡穎等[29]通過(guò)采用ET克隆、胚胎干細(xì)胞同源重組和四倍體囊胚補(bǔ)償技術(shù)繁育小鼠后，測(cè)量各項(xiàng)指標(biāo)，該動(dòng)物模型符合HA的臨床表型，適用于HA的研究，這種HA小鼠模型的成功建立，為以后的研究創(chuàng)造了可靠的實(shí)驗(yàn)支持條件，提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，促進(jìn)了基因治療的發(fā)展。

在此之后，隨著各種技術(shù)展開(kāi)，研究方面的深入等，逐漸出現(xiàn)了以鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFN)為核心的基因編輯技術(shù)和以類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)為核心的基因編輯技術(shù)。有研究指出，ZFN基因編輯技術(shù)，因其設(shè)計(jì)復(fù)雜，脫靶效應(yīng)高等缺點(diǎn)，尚需完善[30]。

4 鋅指核酸酶技術(shù)構(gòu)建血友病鼠模型

2014年，國(guó)外學(xué)者指出[31]，通過(guò)ZFN技術(shù)構(gòu)建了血友病大鼠模型，相比于血友病小鼠模型，其采血量及自發(fā)性出血等方面的問(wèn)題得到解決，推測(cè)其適用于實(shí)驗(yàn)研究。其后，在該鼠模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行其它有關(guān)血友病疾病等方面的深入展開(kāi)。2016年，S?rensen等[32]指出,他們?cè)谘巡〈笫竽Ｐ偷幕A(chǔ)上構(gòu)建出血友病性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型，推動(dòng)了血友病性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)一步研究。同年，L?vgren等[33]也指出，在血友病大鼠中，關(guān)節(jié)出血將使應(yīng)用FVIII制劑時(shí)，抗體(即抑制物)的產(chǎn)生幾率增加，進(jìn)一步加重疾病負(fù)擔(dān)。2018年，Christensen等[34]在血友病關(guān)節(jié)炎鼠模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行研究，并指出血友病患者關(guān)節(jié)軟骨和骨退化，與血流有必要的相關(guān)性，而不僅僅是炎癥的影響。

5 CRISPR/Cas系統(tǒng)構(gòu)建血友病鼠模型

CRISPR，全稱為“clustered regularly interspaced short palindromic repeats”，是一種廣泛地存在于細(xì)菌及古細(xì)菌的基因組中的DNA重復(fù)序列；Cas是CRISPR的臨近的相關(guān)基因。CRISPR是1987年日本學(xué)者[35]在研究大腸桿菌堿性磷酸酶基因時(shí)首次發(fā)現(xiàn)的；其具有14個(gè)長(zhǎng)度為29 bp 的重復(fù)片段和32～33 bp 的非重復(fù)片段，這些片段以間隔的方式連接以形成短回文重復(fù)序列結(jié)構(gòu)。但是當(dāng)時(shí)限于種種原因，未予重視，并沒(méi)有深入的進(jìn)行研究。直到2002年它才正式命名為“clustered regularly interspaced short palindromic repeats”，即“CRISPR”[36]。此后，對(duì)于CRISPR的研究逐漸開(kāi)展。至2013年，CRISPR作為一種基因編輯技術(shù)由《Cell》報(bào)道出來(lái)，該技術(shù)稱為“CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的打靶系統(tǒng)”[37]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)原本是一種在長(zhǎng)期演化過(guò)程中形成的獲得性免疫防御系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)人工改造，CRISPR/CAS9系統(tǒng)已成為以RNA導(dǎo)向的基因組編輯技術(shù)；該系統(tǒng)可分為I型、II型、III型三種類型[38-39]。其中，II型CRISPR/CAS系統(tǒng)由于其相對(duì)簡(jiǎn)單的工作組成而廣泛用于基因編輯或基因沉默。該技術(shù)對(duì)比于之前已有技術(shù)，具有著其自身的優(yōu)勢(shì)。在此之后，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各個(gè)科學(xué)的研究中[40-55]。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)基因編輯技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于基因修飾小鼠模型的構(gòu)建具有著極大的促進(jìn)作用。例如：2014年，馬元武等[56]在研究胰島素受體底物1(IRS1)基因與代謝病之間的關(guān)系，通過(guò)CRISPR/Cas 系統(tǒng)構(gòu)建成功Irs1基因敲除大鼠，為研究提供了必要的動(dòng)物模型。2015年白敏等[57]指出，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，成功構(gòu)建了一種小鼠模型，這種小鼠模型具有特定的位點(diǎn)突變。同年，李彥鋒等[58]通過(guò)CRISPR/Cas系統(tǒng)靶向敲除Fscb基因，構(gòu)建成功Fscb基因敲除小鼠模型，為進(jìn)一步研究FSCB蛋白在精子鞭毛運(yùn)動(dòng)和獲能中的作用奠定了基礎(chǔ)。王偉等[59]通過(guò)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)靶向敲除技術(shù)成功建立了Tlr3基因敲除小鼠模型。這些研究指出CRISPR/Cas系統(tǒng)基因編輯技術(shù)在小鼠或者是大鼠體內(nèi)是可行的，提供了可行性的證明，同時(shí)也為血友病鼠模型的構(gòu)建改良提供了思路。使研究人員認(rèn)識(shí)到可以應(yīng)用CRISPR/Cas系統(tǒng)原理構(gòu)建血友病即凝血因子基因敲除小鼠。

汪啟翰等[60]于2013年提出應(yīng)用CRISPR/Cas 系統(tǒng)構(gòu)建HB小鼠模型，在研究中，利用CRISPR系統(tǒng), 在mFIX基因第8外顯子核心功能區(qū)設(shè)計(jì)一個(gè)靶點(diǎn)，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄Cas9酶及gRNA并顯微注射小鼠單細(xì)胞期受精卵進(jìn)行mFIX定點(diǎn)的基因編輯。通過(guò)測(cè)量各項(xiàng)指標(biāo)，較為符合血友病表型。緊隨其后，于2015年[61]發(fā)表文獻(xiàn)指出，依據(jù)CRISPR/Cas 系統(tǒng)基因編輯技術(shù)，進(jìn)行mFIX基因敲除，成功構(gòu)建的HB小鼠模型。在此研究中，也證實(shí)了減少CRISPR/Cas 系統(tǒng)基因脫靶效應(yīng)的方法，即通過(guò)對(duì)Cas9 核酸酶蛋白的切割域進(jìn)行突變，利用修飾型的Cas9 核酸酶斷裂DNA雙鏈的其中一條鏈[62]。2016年，關(guān)玉婷[63]發(fā)表文獻(xiàn)，利用CRISPR/Cas9技術(shù)將Cas9基因、sgRNA和ssODN注射到小鼠單細(xì)胞胚胎中，成功構(gòu)建了模擬病人新突變的點(diǎn)突變小鼠F9Y381D。同時(shí)還成功制備了F9Y381S突變小鼠及第383位氨基酸突變?yōu)榻K止密碼子的敲除小鼠F9383STOP。同年，常士偉[64]指出，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)能夠成功的制造出FVIII基因敲除即HA小鼠模型。這兩個(gè)研究進(jìn)一步證明CRISPR/Cas9技術(shù)在血友病小鼠模型的制作中，具有著強(qiáng)大的執(zhí)行力。

6 總結(jié)及展望

血友病作為一種常見(jiàn)的血液性疾病，對(duì)于患者極易造成軀體畸形，嚴(yán)重時(shí)甚至危及生命。目前尚無(wú)治愈方法，我國(guó)治療手段主要為替代治療，療效不持續(xù)，治療費(fèi)用高昂，我國(guó)患者絕大多數(shù)不能承擔(dān)終身性預(yù)防治療。其作為一種單基因遺傳性疾病，基因治療是最有望成為其治愈的方法。最早于1987年開(kāi)始，國(guó)際上就有關(guān)于血友病基因治療的研究展開(kāi)。隨著研究的深入開(kāi)展，血友病動(dòng)物模型成為其不可或缺的一種必要條件。即使在自然界種存在天然的血友病動(dòng)物，但其資源有限，獲取困難，不易于廣泛地推展于實(shí)驗(yàn)研究。因此，人為構(gòu)建血友病動(dòng)物模型是大勢(shì)所趨，也是勢(shì)在必得。在這些動(dòng)物模型種，小鼠模型具有其自身的特點(diǎn)，易于獲得，便于運(yùn)輸，研究費(fèi)用較其它大型動(dòng)物來(lái)說(shuō)，要少于其它動(dòng)物。這些特點(diǎn)使其在血友病動(dòng)物模型的構(gòu)建中脫穎而出。血友病小鼠模型從開(kāi)始制備到如今已有20多年的歷史，經(jīng)歷了多種基礎(chǔ)原理的發(fā)展，多種技術(shù)手段的支持。或許直至今日，血友病小鼠模型的構(gòu)建技術(shù)仍有不足之處，如CRISPR/Cas9技術(shù)的脫靶效應(yīng)等，這種動(dòng)物模型仍具有種種尚未發(fā)現(xiàn)的需繼續(xù)改善的缺陷。但是不可否認(rèn)，這種動(dòng)物模型的構(gòu)建，為血友病的研究提供了不可替代的支持條件，加快了血友病的基因治療的研究步伐，促進(jìn)了血友病的研究進(jìn)展。截止目前，血友病的基因治療研究尚具有不足，尤其是HA的研究進(jìn)展緩慢。研究人員期待有新原理的提出，新技術(shù)的產(chǎn)生，應(yīng)用于血友病動(dòng)物模型的構(gòu)建，推動(dòng)血友病基因治療的進(jìn)展。