戰(zhàn)曉燕，張似青，田建興 ，穆長(zhǎng)青，王連山

（1.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201699；2.遼寧威蘭生物技術(shù)有限責(zé)任公司，遼寧 沈陽 110020；3.遼寧省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧 沈陽 110020）

大量研究證實(shí)，飼料中添加高劑量氧化鋅可增加斷奶仔豬采食量，降低仔豬腹瀉，提高其生長(zhǎng)性能[1-5]。但氧化鋅的生物學(xué)利用率低，日糧添加高鋅導(dǎo)致糞樣中鋅的殘留量過高，造成鋅資源的浪費(fèi)并嚴(yán)重威脅環(huán)境[6-9]。此外，長(zhǎng)期添加高劑量氧化鋅可給仔豬帶來些許負(fù)面效應(yīng)如抑制乳仔豬后期生長(zhǎng)、被毛凌亂等[10]。隨著目前對(duì)土壤環(huán)境的重視，農(nóng)業(yè)部發(fā)布第2625號(hào)公告，來限制豬配合飼料中氧化鋅的添加量。因此，尋求新型添加劑以減少氧化鋅用量迫在眉睫。

過氧化氫酶（Hydrogenperoxidase）又稱觸酶（Catalase，CAT），是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶，是在生物演化過程中建立起來的生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，在動(dòng)物體內(nèi)主要有抗氧化、抗應(yīng)激、抗過敏和保護(hù)腸道黏膜的作用[11]，并在食品、醫(yī)藥、紡織、造紙、環(huán)保等行業(yè)具有重要的應(yīng)用。目前過氧化氫酶在很多領(lǐng)域中都有涉及，但大多不具有生物活性，因此在動(dòng)物中應(yīng)用很少。研究表明，具有生物活性的過氧化氫酶可以促進(jìn)動(dòng)物采食、改善生長(zhǎng)性能、減少動(dòng)物營養(yǎng)性腹瀉[12-13]，對(duì)腸上皮細(xì)胞具有預(yù)防性保護(hù)作用和減輕腸道炎癥反應(yīng)等[14-15]。

本試驗(yàn)以28日齡斷奶仔豬為對(duì)象，將生物活性過氧化氫酶直接作為添加劑加入到仔豬日糧中，初步探索其對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響，為生物活性過氧化氫酶的推廣應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)，對(duì)減少添加高鋅造成的環(huán)境污染具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料本試驗(yàn)所用生物活性過氧化氫酶（酶活為60 U/g）由遼寧威蘭生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。試驗(yàn)動(dòng)物購自于承德灤平康牧養(yǎng)殖公司。

1.2 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將40頭健康的28日齡三元雜斷奶仔豬按體重一致原則隨機(jī)分為4組，每組設(shè)2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5頭豬，A組作為對(duì)照組，在基礎(chǔ)日糧中添加2 500 mg/kg氧化鋅，B、C、D組在基礎(chǔ)日糧中分別添加過氧化氫酶60 U/kg、90 U/kg、120 U/kg。試驗(yàn)預(yù)試3 d，正式試驗(yàn)30 d。試驗(yàn)設(shè)計(jì)情況如表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1Test design

1.3 基礎(chǔ)飼料配方參照美國NRC（1998）仔豬營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐配制基礎(chǔ)日糧，具體日糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平Table 2 Test basic dietary formula and nutritional level

1.4 飼養(yǎng)管理試驗(yàn)豬空腹稱重后，在養(yǎng)殖水平較好的同一棟封閉式豬舍內(nèi)進(jìn)行，溫濕度適宜；自由采食和飲水。免疫消毒程序按豬場(chǎng)常規(guī)方法進(jìn)行。飼養(yǎng)管理參照該品種豬的飼養(yǎng)管理規(guī)程進(jìn)行。

1.5 樣品采集與處理 在試驗(yàn)期內(nèi)每天對(duì)豬的采食量、余料量、腹瀉率等數(shù)據(jù)進(jìn)行收集及記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)屠宰仔豬，采集十二指腸、空腸、回腸各腸段腸道組織樣品保存于10%福爾馬林溶液進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

1.6 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.6.1 生長(zhǎng)性能測(cè)定

1.6.1.1 平均日增重（ADG） 試驗(yàn)結(jié)束后稱重，稱重前禁食12 h，以重復(fù)為單位計(jì)算每個(gè)重復(fù)的豬只重量。記錄試驗(yàn)中途死亡豬只數(shù)并稱重記錄死亡重量。計(jì)算公式如下：平均日增重（g/頭/d）=（平均末重-平均初重）/飼養(yǎng)天數(shù)。

1.6.1.2 平均日采食量（ADFI） 飼養(yǎng)試驗(yàn)開始后，記錄每天的投料量和每天的剩料量，通過計(jì)算投料量和剩料量的差值，得到耗料量。發(fā)生死淘豬時(shí)及時(shí)結(jié)料并稱質(zhì)量。計(jì)算公式如下：平均日采食量（g/頭/d）=（投料量-余料量）/（豬數(shù)×飼喂天數(shù)）。

1.6.1.3 料重比（F/G） 料重比計(jì)算公式為：料重比=試驗(yàn)期總耗料重/試驗(yàn)期總增重。

1.6.1.4 腹瀉率 腹瀉率計(jì)算公式為：腹瀉率（%）-［試驗(yàn)全期腹瀉頭次/（試驗(yàn)頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù)）］×100%。

1.6.2 腸道形態(tài)檢測(cè) 將10%福爾馬林中固定后的十二指腸、空腸、回腸組織用蘇木精-伊紅染色法染色，熒光顯微鏡選擇典型視野拍攝圖片，并用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察分析，每張切片測(cè)量絨毛高度（VH）和隱窩深度（CD），并計(jì)算VH/CD。每個(gè)樣本觀察兩個(gè)非連續(xù)切片，從不同的視野中選取10根完整的絨毛進(jìn)行長(zhǎng)度測(cè)量，并測(cè)定相應(yīng)的隱窩深度，絨毛高度量取是從其頂端至根部，隱窩深度量取是從相鄰2根絨毛根部至基底部。

1.6.3 消化酶活性的測(cè)定 將仔豬屠宰，開腹后立即結(jié)扎十二指腸、空腸、回腸，從十二指腸、空腸、回腸采集部分食糜樣于液氮中速凍保存，-20℃?zhèn)溆?，用于測(cè)定蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性。

1.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 22.0軟件進(jìn)行ANOVA方差分析及Duncan’s法多重比較，P＜0.05差異顯著，P＜0.01差異極顯著。

2 結(jié)果和分析

2.1 過氧化氫酶對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉率的影響 由表3可見，與對(duì)照組相比，90 U/kg和120 U/kg過氧化氫酶組日增重極顯著提高（P＜0.01）；90 U/kg過氧化氫酶組日采食量極顯著提高（P＜0.01），但與60 U/kg和120 U/kg過氧化氫酶組無顯著差異（P＞0.05）；90 U/kg和120 U/kg過氧化氫酶組料重比分別降低2.67%和4.00%，差異顯著（P＜0.05，P＜0.01）；添加過氧化氫酶組對(duì)腹瀉率均無顯著影響（P＞0.05）。

表3 過氧化氫酶對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉率的影響Table 3Effect of catalase on growth performance and diarrhea rate of weaning piglets

表4 過氧化氫酶對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響Table 4 Effect of catalase on intestinal morphology of weaning piglets

2.2 過氧化氫酶對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響由表4可知，與對(duì)照組相比，60 U/kg過氧化氫酶組十二指腸VH顯著降低（P＜0.05）；三水平過氧化氫酶組空腸VH均極顯著提高（P＜0.01）；三水平過氧化氫酶對(duì)回腸VH均無顯著影響（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，90 U/kg和120 U/kg過氧化氫酶組十二指腸CD分別降低13.34%和16.21%，差異極顯著（P＜0.01）；60 U/kg和120 U/kg過氧化氫酶組空腸CD明顯降低（P＜0.01）；60 U/kg過氧化氫酶組回腸CD提高不顯著（P＞0.05），90 U/kg和120 U/kg過氧化氫酶組十二指腸CD則極顯著降低（P＜0.01）。與對(duì)照組相比，90 U/kg和120 U/kg過氧化氫酶組十二指腸和回腸的VH/CD均極顯著提高（P＜0.01）；三水平過氧化氫酶對(duì)空腸VH/CD均有極顯著影響（P＜0.01）。

表5 過氧化氫酶對(duì)斷奶仔豬消化酶活性的影響Table 5Effect of catalase on digestive enzyme activity in weaning piglets

2.3 過氧化氫酶對(duì)斷奶仔豬消化酶酶活的影響由表5可知，與對(duì)照組相比，三水平過氧化氫酶組十二指腸、空腸和回腸的蛋白酶活性均極顯著提高（P＜0.01）；90 U/kg過氧化氫酶組十二指腸淀粉酶活性極顯著提高（P＜0.01）；90 U/kg過氧化氫酶組空腸淀粉酶活性提高了8.64%，差異顯著（P＜0.05）；三水平過氧化氫酶組回腸的淀粉酶活性均極顯著提高（P＜0.01）。60 U/kg過氧化氫酶組十二指腸脂肪酶活性極顯著提高（P＜0.01）；60 U/kg和120 U/kg過氧化氫酶組回腸脂肪酶活性顯著降低（P＜0.05）。由此推斷，在斷奶日糧中添加過氧化氫酶，可提高消化酶活性。

3 討論

3.1 過氧化氫酶對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響傳統(tǒng)養(yǎng)殖生產(chǎn)模式中，仔豬斷奶約在4周齡。隨著飼養(yǎng)水平的提高，現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖模式下，通常采用早期斷奶以提高母豬的繁殖性能，節(jié)約母豬飼養(yǎng)成本。但是早期斷奶給仔豬帶來多種應(yīng)激，如仔豬與母畜的突然分離、轉(zhuǎn)群帶來的應(yīng)激、由易消化吸收的動(dòng)物蛋白向較難消化的植物蛋白過渡等。諸多應(yīng)激使仔豬在短時(shí)間內(nèi)減少釆食，甚至拒絕釆食。Brooks等[16]研究表明早期斷奶后24 h內(nèi)僅有50%仔豬釆食，而在48 h后仍約有10%仔豬未進(jìn)食。這可造成仔豬能量大量透支。仔豬在斷奶時(shí)體內(nèi)的能量?jī)H可以維持3 d，而由斷奶應(yīng)激造成的能量損失約需要8～14 d方能恢復(fù)[17]。而斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能決定肥育豬的上市時(shí)間。因此，減少斷奶應(yīng)激保證仔豬的正常生長(zhǎng)顯得至關(guān)重要。

本試驗(yàn)中所用生物活性過氧化氫酶屬于抗氧化酶的一種，具有體內(nèi)抗氧化、清除自由基的作用，可以減少因仔豬斷奶導(dǎo)致的氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基對(duì)腸道上皮細(xì)胞的損傷，維護(hù)腸道健康完整，從而達(dá)到提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率的作用。方銳等[18]研究發(fā)現(xiàn)添加過氧化氫酶可以提高斷奶仔豬生產(chǎn)性能，降低仔豬料肉比，與添加氧化鋅對(duì)比無差異。而本試驗(yàn)結(jié)果顯示與2 500 mg/kg氧化鋅相比，90 U/kg CAT極顯著提高斷奶仔豬日采食量和日增重（P＜0.01），同時(shí)對(duì)降低料重比也有明顯改善作用（P＜0.05），以此推斷一定劑量的生物活性過氧化氫酶（CAT）可以改善斷奶仔豬生長(zhǎng)性能。

3.2 過氧化氫酶對(duì)斷奶仔豬腹瀉率的影響仔豬腹瀉主要有生理性腹瀉和病理性腹瀉兩種。生理性腹瀉主要是仔豬斷奶期間，面臨來自營養(yǎng)、心理和環(huán)境三個(gè)方面的應(yīng)激，其中營養(yǎng)應(yīng)激最為嚴(yán)重，不僅造成了斷奶后仔豬腸絨毛變短、隱窩變深、腸細(xì)胞凋亡，還會(huì)影響到仔豬的內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和行為狀態(tài)等，同時(shí)也會(huì)造成仔豬腸道酶系活性和吸收功能的降低，導(dǎo)致仔豬嚴(yán)重營養(yǎng)不良[19-20]。病理性腹瀉主要是因仔豬腸道尚未建立穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，自身抵抗力較低，對(duì)外界刺激敏感，易受各種病原微生物的侵襲而導(dǎo)致病理性腹瀉。其中，大腸桿菌和輪狀病毒是最常見的病原微生物，次者為沙門氏菌、志賀氏菌等。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與2 500 mg/kg氧化鋅相比，3種添加劑量的水平過氧化氫酶對(duì)腹瀉率均無顯著差異（P＞0.05），表明生物活性過氧化氫酶同高劑量的氧化鋅一樣，具有高效的抗腹瀉作用，可以預(yù)防仔豬營養(yǎng)性腹瀉。經(jīng)大量研究證實(shí)，仔豬日糧中抗原及其它不良成分所引起的致敏反應(yīng)才是引起仔豬斷奶腹瀉的罪魁禍?zhǔn)?，而病原性微生物感染不是引起斷奶仔豬腹瀉的原發(fā)性病因，只是仔豬腸道發(fā)生損傷的繼發(fā)癥[21-22]。研究證明，早期的斷奶過程中機(jī)體氧化還原平衡系統(tǒng)被打破，自由基產(chǎn)生增加，抗氧化能力下降，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[23]。氧自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞與組織的氧化損傷[24]，直接導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞受損，從而引起和加劇了斷奶仔豬腹瀉。生物活性過氧化氫酶具有對(duì)腸黏膜氧化應(yīng)激造成的炎性損傷有保護(hù)作用，明顯抑制炎癥所導(dǎo)致的腸黏膜細(xì)胞的凋亡[25]，這可能是生物活性過氧化氫酶（CAT）具有抗腹瀉作用的主要原因。

3.3 過氧化氫酶對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響據(jù)報(bào)道，早期斷奶會(huì)誘導(dǎo)仔豬腸上皮細(xì)胞過氧化，腸上皮細(xì)胞抗氧化酶活性降低，導(dǎo)致腸絨毛-隱窩結(jié)構(gòu)損傷和修復(fù)更新受阻，在形態(tài)結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為絨毛萎縮，隱窩加深[26]。豬的腸道形態(tài)尤其是絨毛的長(zhǎng)度和隱窩深度，是影響豬腸道健康和生長(zhǎng)性能的重要指標(biāo)。絨毛邊緣可分泌多種消化酶，因此，絨毛越長(zhǎng)動(dòng)物的消化吸收能力越強(qiáng)。隱窩深度決定腸絨毛有絲分裂生成上皮細(xì)胞的速度，反映細(xì)胞生成率，而隱窩變淺，表明細(xì)胞成熟率上升，分泌功能增強(qiáng)。因此，絨毛高度與隱窩深度的比值可綜合反映小腸消化吸收功能狀況。比值下降，黏膜很可能受損，消化吸收能力下降，常會(huì)伴隨有腹瀉、生長(zhǎng)受阻現(xiàn)象；而比值升高，腸道上皮細(xì)胞數(shù)量增加，腸道吸收面積增大，進(jìn)而提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率，同時(shí)也有利于功能性物質(zhì)的合成。

Carlson等[27]報(bào)道，補(bǔ)飼高劑量氧化鋅能改善腸道形態(tài)，使腸道隱窩變淺，絨毛變長(zhǎng)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，3 000 mg/kg氧化鋅能顯著增加小腸黏膜的絨毛高度[28]。過氧化氫酶作為抗氧化酶，可以修復(fù)因斷奶導(dǎo)致的細(xì)胞過氧化而造成的絨毛萎縮，隱窩加深。據(jù)報(bào)道，過氧化氫酶可以提高腸道絨毛高度，降低隱窩深度，且提高二者的比值[18]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與2 500 mg/kg氧化鋅相比，90 U/kg和120 U/kg過氧化氫酶組顯著提高空腸絨毛高度、降低十二指腸和回腸隱窩深度，同時(shí)絨毛高度與隱窩深度的比值顯著升高（P＜0.01），表明生物活性過氧化氫酶（CAT）對(duì)腸道的絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度有一定的促生長(zhǎng)作用，進(jìn)而促進(jìn)斷奶仔豬對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，且效果優(yōu)于高劑量的氧化鋅，這與斷奶仔豬在生長(zhǎng)性能上表現(xiàn)的結(jié)果一致。過氧化氫酶作為抗氧化酶的一種，具有增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞抗氧化的功能，從而有助于上皮細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)絨毛-隱窩結(jié)構(gòu)的發(fā)育。

3.4 過氧化氫酶對(duì)斷奶仔豬消化酶酶活的影響仔豬在0～4周齡，隨著日齡的增長(zhǎng)，仔豬胃、腸、胰及小腸食糜中的消化酶活性幾乎成倍增長(zhǎng)[33]。這與哺乳期消化器官組織快速生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。然而，斷奶無論發(fā)生在2、3、4、5周齡，組織器官和食糜中各種消化酶活性均降低到斷奶前的1/3水平，經(jīng)過2周恢復(fù)之后，除胰脂肪酶外，大多數(shù)消化酶均可恢復(fù)甚至超過斷奶前的水平，而胰脂肪酶活性在斷奶后2～3周內(nèi)無明顯增長(zhǎng)或增長(zhǎng)很少。研究表明，消化酶這種發(fā)育規(guī)律趨勢(shì)與分泌這些酶的組織如小腸、胰臟生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律趨勢(shì)極其相似[29-32]。這說明早期斷奶引起的胃腸道消化酶活性降低，很可能是合成和分泌這些酶的組織、器官發(fā)育受抑制的緣故。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與2 500 mg/kg氧化鋅相比，三水平過氧化氫酶組蛋白酶活性均極顯著提高（P＜0.01）；三水平過氧化氫酶組淀粉酶活性具有整體升高的趨勢(shì)，其中90 U/kg過氧化氫酶組十二指腸、空腸和回腸的淀粉酶活性差異顯著，分別提高了10.14%、8.64% 和 15.14%（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01）；60 U/kg過氧化氫酶組十二指腸的脂肪酶活性顯著提高5.00%（P＜0.05）。結(jié)果表明，生物活性過氧化氫酶（CAT）可提高斷奶仔豬消化道消化酶活性，使小腸仍具有良好的消化吸收能力，飼糧中的營養(yǎng)物質(zhì)得到充分的利用，因此有效提高仔豬的生長(zhǎng)性能，這也與本試驗(yàn)結(jié)果相符。

4 結(jié)論

綜上所述，在日糧中添加具有生物活性的過氧化氫酶可明顯促進(jìn)腸道絨毛-隱窩結(jié)構(gòu)的發(fā)育，提高消化酶活性，降低腹瀉率，從而改善生長(zhǎng)性能。這在實(shí)際生產(chǎn)中極具使用價(jià)值，可作為減少高劑量氧化鋅使用量的新型添加劑推廣和應(yīng)用。本試驗(yàn)條件下，生物活性過氧化氫酶最適宜添加量應(yīng)為酶活90 U/kg。