劉宗正 ，肖 娜 ，楊培培 ，劉開東 ，李培培 ，王建華

（1.青島市畜牧獸醫(yī)研究所，山東 青島 266100；2.青島奧特種羊場，山東 青島 266100；3.青島派森諾基因科技有限公司，山東 青島 266100）

脂肪間充質(zhì)干細胞是一類存在于動物脂肪組織中的成體干細胞。近年來，其被廣泛地應(yīng)用于組織修復(fù)和基因治療等領(lǐng)域[1-3]。目前，研究人員已從多種動物體內(nèi)分離得到了脂肪間充質(zhì)干細胞，但對于嶗山奶山羊脂肪間充質(zhì)干細胞的研究很少[4]。為此，筆者對嶗山奶山羊脂肪間充質(zhì)干細胞進行分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化，以期為嶗山奶山羊種質(zhì)資源的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 組織樣品：脂肪組織取自1歲雄性育成嶗山奶山羊的腎臟周圍組織，嶗山奶山羊由青島奧特種羊場提供。

1.1.2 主要試劑：胎牛血清、牛血清白蛋白（BSA），購自SIGMA公司；青霉素、鏈霉素，購自華北制藥廠；Ⅰ型膠原酶，購自GIBCO公司；DMEM/F12（1∶1），購自 HYCLONE 公司；DMSO，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Transzol up、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、EASY Taq MIX、pEASY-T1 Cloning Kit等分子生物學(xué)試劑均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 全能性相關(guān)基因引物序列及合成：根據(jù)NCBI GenBank中已公布的牛、羊和豬Oct-4、Sox-2、Nanog的mRNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件進行相似性比較，選取保守區(qū)序列，根據(jù)跨內(nèi)含子原則進行引物設(shè)計，引物名稱、序列及基因登錄號見表1。引物由青島派森諾基因生物技術(shù)有限公司合成。

表1 嶗山奶山羊熒光定量RT-PCR引物序列

1.2 試驗方法

1.2.1 嶗山奶山羊脂肪干細胞（ADSCs）的分離與培養(yǎng)：選取成年嶗山奶山羊公羊屠宰后，取腎臟周圍白色脂肪組織，經(jīng)PBS清洗2～3次后，超凈臺內(nèi)切碎脂肪組織，在50 mL離心管中加入1∶1體積的PBS（含1%BSA和1%Ⅰ型膠原酶），37℃搖床振蕩酶解1 h，每隔20 min用渦旋振蕩器振蕩1次。酶消化1 h后，1 200 r/min離心5 min，去除上層組織，加入等體積的紅細胞裂解液，裂解紅細胞20 min，離心清洗后加入7 mL DMEM完全培養(yǎng)基，重懸沉淀，以5×106個cell/mL的密度接種于卡式瓶中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 換液 1 次[5]。

1.2.2 細胞的傳代培養(yǎng)：首次接種的原代細胞生長至80%～90%匯合時，吸掉上清液，用PBS清洗后加入1 mL胰酶37℃消化1～2 min。待細胞變圓后加入2～3 mL完全培養(yǎng)基，終止消化。輕輕吹吸細胞，1 800 r/min離心5 min，棄上清液。加入1 mL完全培養(yǎng)基重懸，細胞懸液按照1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

1.2.3 嶗山奶山羊ADSCs生長曲線的測定：細胞傳至第3代時開始大量凍存細胞，同時選取生長狀態(tài)良好的第3、5代細胞，利用胰酶消化制成單細胞懸液，以1×104個cell/孔密度接種于24孔板中，平均分成9組，每組3孔，每天計數(shù)3孔細胞，求平均值，至第9組結(jié)束。以時間為橫坐標(biāo)，細胞數(shù)量為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.2.4 Real time RT-PCR鑒定全能性相關(guān)基因：采用Transzol up提取第2、3、4代嶗山奶山羊ADSCs的總RNA。反轉(zhuǎn)錄前首先進行去除基因組DNA 反應(yīng)， 反應(yīng)體系為 20 μL：5×gDNA Eraser Buffer 2 μL、gDNA Eraser 1 μL、RNA Free dH2O 0.5 μL，反應(yīng)條件為：42℃、2 min，4℃保存。 將反應(yīng)產(chǎn)物分裝成10 μL/管之后加入RNase Free dH2O 4.0 μL、5×Prime Script Buffer 2 （for Real time）4.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1.0 μL， 反應(yīng)條件為：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4℃保存。實時定量 PCR反應(yīng)體系為 20 μL：2×SYBR Premix EX TaqTM10 μL，上、下游引物各 0.3 μL（10 mol/L），RO×Reference Dye （50×）0.2 μL，RT反應(yīng)液（cDNA）2 μL、dH2O 7.2 μL。 利用 ABI7500實時定量PCR儀進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性 3 min；94℃變性 10 s，60℃退火 25 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)。以Gapdh作為內(nèi)參基因，采用 2-△△Ct法計算 Oct-4、Sox-2 和 Nanog 基因的mRNA相對表達量。

1.2.5 成骨誘導(dǎo)分化及鑒定：選取第3代ADSCs消化，按2×105個cell/mL密度接種于6孔板中。當(dāng)細胞達到70%～80%匯合時，倒掉培養(yǎng)液，誘導(dǎo)組更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基 （DMEM/F12＋10%FBS＋10 mmol/L β-甘油磷酸鈉＋20 nmol/L 地塞米松＋50 μg/mL抗壞血酸），對照組則繼續(xù)正常培養(yǎng)。每3 d換液1次，觀察細胞的生長情況，連續(xù)誘導(dǎo)21 d后，利用茜素紅染色，用150 mmol/L的NaCl溶液沖洗細胞3次，70%冰乙醇4℃固定1 h后水洗3次，2%茜素紅室溫染色10 min，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 嶗山奶山羊ADSCs的分離與培養(yǎng)

圖1 嶗山奶山羊ADSCs原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)結(jié)果

嶗山奶山羊原代培養(yǎng)的ADSCs在接種后細胞均懸浮于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1 h左右細胞開始貼壁生長，起初細胞貼壁后生長形態(tài)不規(guī)則，6 h觀察時，細胞基本全部貼壁，但細胞中仍混有許多雜質(zhì)，12 h經(jīng)換液處理后，細胞形態(tài)清晰，48 h后貼壁生長的細胞開始大量繁殖，4～5 d時，細胞出現(xiàn)融合成片的趨勢，此時細胞均呈現(xiàn)長梭形及多角形（見圖1A），7～8 d后細胞相互融合，基本鋪滿瓶底，經(jīng)2～3次傳代培養(yǎng)后，利用酶消化時間差的處理方法，細胞得到進一步純化，且形態(tài)基本一致，呈現(xiàn)均一長梭形，4～5 d后細胞生長再次達到80%融合（見圖 1B）。

2.2 嶗山奶山羊ADSCs生長曲線

由圖2可知，嶗山奶山羊ADSCs的生長曲線呈“S”形；第 3、5 代細胞在培養(yǎng) 1～2 d 時，細胞數(shù)量沒有較大變化，此時細胞處于潛伏期；培養(yǎng)3 d后細胞開始快速生長，此時進入對數(shù)生長期；培養(yǎng)6 d時細胞生長開始減緩；培養(yǎng)7～8 d時，細胞數(shù)量基本維持不變，此時細胞生長進入平臺期。

圖2 嶗山奶山羊ADSCs生長曲線

2.3 嶗山奶山羊ADSCs全能性基因Real time RT-PCR結(jié)果

Real time RT-PCR結(jié)果顯示，第2、3、4代嶗山奶山羊ADSCs中均檢測到Oct-4和Sox-2基因的表達（見圖3A、B），但均未檢測到Nanog基因的表達 （見圖3C）。由圖4可知，2個基因在第2代ADSCs中的表達量均較低，在第3、4代ADSCs中的表達量均較高。

圖3 Oct-4、Sox-2及Nanog基因Real time RT-PCR反應(yīng)熔解曲線

圖4 第2、3、4代嶗山奶山羊ADSCs中Oct-4和Sox-2基因的mRNA相對表達量

2.4 嶗山奶山羊ADSCs成骨誘導(dǎo)分化結(jié)果

ADSCs一般在誘導(dǎo)10 d左右時即可出現(xiàn)明顯的鈣化結(jié)節(jié)，17 d左右時骨結(jié)節(jié)最顯著（見圖5 A），經(jīng)茜素紅染色后被染成深紅色（見圖5 B）。而對照組染色后并未見有深紅色的骨結(jié)節(jié)出現(xiàn) （見圖 5 C）。

3 討論與結(jié)論

近年來，間充質(zhì)干細胞作為一種成體干細胞，逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點，因其成熟的體外分離技術(shù)和較強的體外分化能力，在組織功能修復(fù)和創(chuàng)傷治療方面具有不可替代的優(yōu)勢[6-8]。脂肪間充質(zhì)干細胞由于其特定的存在方式和安全性，在美容醫(yī)療等方面越來越被接受。同時，由于脂肪組織中間充質(zhì)干細胞數(shù)量較多，取材和處理的方式簡單，且在體外增殖快速，因此，逐步成為成體干細胞研究中常用的組織工程種子細胞，其研究領(lǐng)域逐步延伸到了分子功能機制的水平[9]。

目前，國內(nèi)外的許多研究已經(jīng)從多種哺乳動物體內(nèi)分離得到了脂肪間充質(zhì)干細胞，但在國內(nèi)，受限于地域和研究水平的問題，許多地方優(yōu)良品種的脂肪間充質(zhì)干細胞未見相關(guān)的報道[10]。在該研究中，筆者采用了常規(guī)的酶消化脂肪組織的方法，系統(tǒng)探討了嶗山奶山羊脂肪間充質(zhì)干細胞的分離與培養(yǎng)技術(shù)。在該過程中，筆者分離得到了嶗山奶山羊的脂肪間充質(zhì)干細胞，細胞形態(tài)呈長梭形，與成纖維細胞相似。經(jīng)傳代后檢測，細胞純度較高，在多次傳代后，形態(tài)始終保持均一。對第3、5代細胞進行生長曲線測定，在培養(yǎng)1～2 d時，細胞處于潛伏期；3 d后細胞開始快速生長，進入對數(shù)生長期；6 d時細胞生長開始減緩，7～8 d時，細胞生長進入平臺期，這與先前的研究結(jié)果一致[11-12]。而采用Real time RT-PCR方法對嶗山奶山羊脂肪間充質(zhì)干細胞的多能性因子進行檢測時，能夠檢測到傳代后Oct-4和Sox-2基因的正常表達，但未檢測到Nanog基因的表達，這說明脂肪間充質(zhì)干細胞多能性因子表達不全，可能與各種類型的間充質(zhì)干細胞所存在的組織有關(guān)[13]。

在該研究中，筆者采用成骨誘導(dǎo)分化的方法驗證了脂肪間充質(zhì)干細胞的誘導(dǎo)分化潛能，該方法也是最早被發(fā)現(xiàn)的分化驗證方法之一。由于骨來源于中胚層，因此，成骨誘導(dǎo)也被認為是中胚層細胞的誘導(dǎo)能力[14]。該過程涉及多個信號通路的改變，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的地塞米松和β-甘油磷酸鈉是成骨誘導(dǎo)所必需的試劑，地塞米松可以促進誘導(dǎo)成骨分化成熟，同時也可以提高堿性磷酸酶的活性，進而促進細胞外基質(zhì)中膠原的合成。β-甘油磷酸鈉是一種能夠為成骨細胞提供磷酸離子的物質(zhì)，可以促進細胞內(nèi)鈣鹽的沉積和鈣化的形成。采用茜素紅染色后，可以觀察到鈣鹽的沉積，其被染成深紅色，這與前人的研究結(jié)果一致[15-16]。該研究未進一步進行基因水平的驗證，但染色結(jié)果已經(jīng)證明了嶗山奶山羊ADSCs具有分化為中胚層骨細胞的能力，這為將其作為模型細胞研究骨損傷修復(fù)機制和方法以及作為骨組織工程的種子細胞研究提供了科學(xué)依據(jù)。

圖5 嶗山奶山羊ADSCs成骨誘導(dǎo)結(jié)果

綜合上述結(jié)果，該研究建立了成熟、穩(wěn)定的嶗山奶山羊ADSCs分離、體外培養(yǎng)擴增及定向誘導(dǎo)分化的方法。分離獲得的嶗山奶山羊ADSCs在體外培養(yǎng)時表現(xiàn)出較高的增殖速率和誘導(dǎo)分化潛能，這為臨床移植提供了充足的組織功能研究細胞來源，也為嶗山奶山羊的保種、育種以及基因庫建設(shè)提供了理論基礎(chǔ)。