楊 龍 白 純 李先亮 賀 強

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院肝膽外科，北京 100020)

1 免疫細胞的抗腫瘤策略及其治療實體瘤臨床研究

細胞治療是一種運用免疫學(xué)原理和方法，體外激活并回輸患者用以殺傷腫瘤細胞的新型治療方法。通過提高腫瘤細胞的免疫原性和對效應(yīng)細胞的特異殺傷性，激發(fā)和增強機體抗腫瘤免疫應(yīng)答，為治愈腫瘤提供新方向。在清除腫瘤細胞過程中，無特定靶向作用樹突狀細胞(DC)、細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(CIK)、自然殺傷細胞(NK)、自然殺傷T細胞(NKT)以及有特定作用靶點的各種T淋巴細胞，如嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)、腫瘤浸潤性T細胞(TIL)、T細胞受體嵌合型T細胞(TCR-T)等均發(fā)揮重要作用。免疫治療是繼手術(shù)，放、化療之后的第四大腫瘤治療技術(shù)，受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注，成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱點和突破口。

細胞治療可以達到兩個目的，一是普遍改善腫瘤患者免疫狀態(tài)，這是機體戰(zhàn)勝腫瘤的基本保障；另一是特異或非特異地殺傷腫瘤細胞。而要達到第一個目的，一些非特異靶向免疫細胞就可以實現(xiàn)。目前常用非特異靶向免疫細胞亞群主要有DC、CIK、NK以及NKT等。

DC是主要的抗原提呈細胞，高水平表達MHCⅠ類和Ⅱ類分子，當(dāng)表達腫瘤相關(guān)肽抗原和MHCⅠ類分子的DC細胞激活CD4和CD8 T細胞后，T細胞就會發(fā)揮效應(yīng)，殺滅腫瘤細胞。DC不僅能激活T細胞，還可通過以下機制發(fā)揮抗瘤作用：①誘導(dǎo)產(chǎn)生大量效應(yīng)T細胞；②趨化效應(yīng)T細胞遷移至腫瘤部位；③維持效應(yīng)T細胞在腫瘤部位的長期存在等。

實驗研究發(fā)現(xiàn)，DC-CIK共培養(yǎng)后其抗腫瘤活性明顯高于單純DC[1]。臨床研究證實，DC-CIK可誘導(dǎo)針對非小細胞肺癌(NSCLC)的免疫應(yīng)答，改善生活質(zhì)量(QOL)并延長患者的總生存時間(OS)，且沒有副作用。郭偉偉等[2]通過研究發(fā)現(xiàn)：肝動脈化療栓塞術(shù)(TACE)后聯(lián)合DC-CIK細胞免疫治療有助于延長患者無進展生存期，同時提高患者生存質(zhì)量，但在對患者長期生存的作用上暫未有肯定結(jié)論。

DC-CIK細胞毒性誘導(dǎo)自體腫瘤細胞PD-L1表達上調(diào)。當(dāng)體外使用靶向PD-1抗體pembrolizumab時，DC-CIK表現(xiàn)出有益的抗腫瘤特性并提高了IFN-γ分泌水平[3]。CIK在體內(nèi)、外已經(jīng)顯示出對腎細胞癌(RCC)的獨特抗腫瘤活性。Ag-DC-CIK治療降低術(shù)后疾病進展和復(fù)發(fā)的風(fēng)險，不能手術(shù)的患者3年總生存期(OS)和無進展生存期(PFS)顯著延長。王丹紅等[4]對28例晚期腎癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)39%的客觀響應(yīng)率(ORR)和75%的疾病控制率(DCR)，沒有觀察到臨床上顯著的副作用。Erdei等[5]在38例符合標(biāo)準(zhǔn)的Ⅳ期乳腺癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)：DC-CIK治療后患者免疫功能明顯增強。可見，DC-CIK對乳腺癌治療有益。穆英等[6]對臍帶血衍生的DC和細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(CB-DC-CIK)治療胃癌的研究結(jié)果顯示：聯(lián)合治療顯著增加總體無病生存率；反映免疫功能的T細胞亞群(CD4+、CD3-CD56+和CD3+CD56+)的百分比和IFN-γ、TNF-α和IL-2的水平顯著增加。在治療中沒有出現(xiàn)嚴(yán)重副作用。Gao等[7]實驗后得出DC-CIK治療降低了術(shù)后疾病進展的風(fēng)險，OS增加。除放化療外，DC-CIK免疫治療是控制手術(shù)后胃癌和腎癌患者腫瘤生長的潛在有效方法。

NK細胞在實體瘤中的作用研究較多。射頻消融(RFA)治療可以通過增強NK細胞介導(dǎo)的抗腫瘤活性和NKG2D表達來有效消除肝腫瘤[8]。通過肝內(nèi)動脈，西妥昔單抗和高劑量IL-2轉(zhuǎn)移聯(lián)合同種異體NK細胞作用于胃腸道腫瘤，耐受性良好并且有臨床效應(yīng)[9]。肝癌患者NK細胞G2A及其配體HLA-E在癌組織中高表達,高表達NKG2A與NK細胞功能耗竭及患者預(yù)后相關(guān)，抑制NKG2A表達可抑制腫瘤細胞的增殖[10]。Fend等[11]在NK細胞受體NCR1和NCR3以及PD-L1表達對晚期非小細胞肺癌影響的研究中發(fā)現(xiàn)NK細胞介導(dǎo)針對NSCLC的免疫監(jiān)視，并且NK細胞受體可以產(chǎn)生有用的生物標(biāo)志物，后續(xù)研究可以指導(dǎo)NSCLC的免疫治療。Shiraishi等[12]通過研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性上調(diào)可以誘導(dǎo)胃癌細胞中NKG2D配體表達的下調(diào)，癌細胞對NK細胞的易感性增強，從而使得NK細胞抗腫瘤的活性增強。Sioud等[13]研究NK細胞的特性時發(fā)現(xiàn)：使用工程改造的肽-Fc融合物在NK細胞存在時處理癌細胞，可明顯增強NK細胞的細胞毒性，使其對實體瘤具有更強的殺傷作用。

NKT在體外經(jīng)α-GalCer反復(fù)刺激迅速增殖，表現(xiàn)出較好的細胞毒效應(yīng)，同時通過介導(dǎo)抑制性骨髓來源細胞誘發(fā)抗腫瘤效應(yīng)，誘導(dǎo)穿孔素/顆粒酶、FasL/Fas或TNF相關(guān)凋亡配體的表達殺傷腫瘤細胞[14]。誘導(dǎo)的自然殺傷T細胞(iNKT)對腫瘤細胞的監(jiān)視主要通過呈遞α-GalCer的iNKT間接發(fā)生，小鼠派生α-GalCer抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，起到了抗腫瘤作用[15]。NKTs細胞毒性對神經(jīng)管細胞瘤細胞高度敏感，有極強殺傷效應(yīng)[16]。Rothe等[17]通過研究NK細胞激活受體NKG2D，揭示了NKG2D配體ULBP2治療結(jié)腸癌的潛在效果。與健康對照相比，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中NKG2D+CD56+NKT細胞的頻率顯著降低,強化了NKT細胞對結(jié)直腸癌的殺傷作用，為結(jié)直腸腫瘤治療提供新方向[18]。NKT細胞激活療法與吉西他濱或環(huán)磷酰胺聯(lián)合用于靶向腫瘤治療并增強對腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)防[19]。

腫瘤患者多數(shù)存在免疫水平下降的表現(xiàn)，病情較重的患者淋巴細胞顯著降低。特別是經(jīng)過多次放化療治療的患者，我們觀察到明顯的淋巴細胞亞群頻率的降低，因此通過非特異性的自體免疫細胞治療，可以顯著提高患者免疫狀態(tài)，這是機體第一道防線的作用。但是如何特異地殺傷腫瘤細胞，還是很多中心研究的一個熱點，靶向性的細胞治療主要是以嵌合抗原受體修飾的T細胞(CAR-T)為載體的細胞治療為代表。

CAR-T經(jīng)過兩次信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮作用。第一信號為組織相容性抗原(MHC)經(jīng)提呈細胞呈遞，與T細胞的受體TCR結(jié)合。第二信號為提呈細胞上的共刺激分子B7與CD28結(jié)合，在兩種信號共同作用下，T細胞增殖活化成細胞毒效應(yīng)T細胞(CTL)。當(dāng)CTL再次遇到攜帶相同MHC分子抗原肽復(fù)合體腫瘤細胞時，會分泌穿孔蛋白、顆粒酶以及各種細胞因子，協(xié)同殺死腫瘤細胞[20]。 CAR-T細胞能上調(diào)干擾素IFN-γ、CD86、IL-2等的表達，進而對抗腫瘤微環(huán)境，影響腫瘤生長。最新研究發(fā)現(xiàn)抗GD2嵌合抗原受體(CAR)修飾的T細胞可能是用于治療小兒H3-K27M突變型彌漫性中線神經(jīng)膠質(zhì)瘤的新方法。miR-153抑制結(jié)直腸腫瘤IDO1表達并通過增強CAR T的殺傷活性而抑制異體腫瘤的生長[21]。CD56-CAR+T細胞對治療CD56+惡性腫瘤包括神經(jīng)母細胞瘤和小細胞肺癌有明顯作用[22]。Bagley等[23]通過研究證實CAR-T細胞治療膠質(zhì)細胞瘤是可行和安全的。MUC1是一種高糖基化、高分子量的膜蛋白,靶向MUC1的CAR-T細胞被認(rèn)為是一種可行的抗腫瘤模式。Posey等[24]近期研究表明,靶向Tn-MUC1的CAR-T細胞可在體內(nèi)外殺傷白血病和胰腺癌細胞。靶向GPC3的第三代CAR-T細胞可以根除體內(nèi)建立的GPC3陽性HCC異種移植物，這表明雙靶向CAR-T細胞是對肝癌有希望的免疫療法[25]。 EGFR靶向CAR-T治療對EGFR陽性晚期復(fù)發(fā)/難治性NSCLC是安全的[26]。Li等[27]研究第三代GPC3指導(dǎo)的CAR-T(CARgpc3T細胞)在腫瘤模型中的抗腫瘤潛力，結(jié)果表明CARgpcT細胞可能是治療肺腺癌(LSCC)患者新型潛在治療劑。Song等[28]通過研究發(fā)現(xiàn)葉酸受體CAR-T(FRaCAR-T)可以介導(dǎo)已建立的三陰性乳腺癌(TNBC)葉酸受體(FRα)高水平表達時抗腫瘤活性。FRα特異性CAR-T在體外中等水平表達FRα，并對TNBC具有強有力和特異性殺傷作用。Zhou等[29]通過實驗研究表明CAR-T對于乳腺癌(BC)的免疫療法非常有效，尤其是針對轉(zhuǎn)移性BC。

TIL是一種新型抗腫瘤效應(yīng)細胞，在腫瘤的過繼免疫治療中具有巨大潛力。腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)和腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)也通過血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達和胸苷磷酸化酶的上調(diào)促進血管生成[30]。自體TIL抗原具有特異性應(yīng)答能力和多克隆性，可以潛在有效地對抗多種腫瘤靶標(biāo)，達到殺滅腫瘤效果。Ⅱ期臨床試驗已經(jīng)說明了TIL在肝臟惡性腫瘤治療中的巨大潛力，有希望的治愈率為20%～40%。具有活化和擴展的自體TIL的免疫治療可以成功地以低毒性進行，作為對HCC患者新型治療方式[31]。TIL是宿主對肝內(nèi)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤免疫應(yīng)答的指示。TIL在原發(fā)IL(白介素)表達的PD-1限制了CD4+和CD8+效應(yīng)T細胞的抗腫瘤免疫功能，為靶向肝腫瘤和逆轉(zhuǎn)腫瘤誘導(dǎo)的免疫治療提供了有力依據(jù)[32]。TIL在乳腺癌中的臨床相關(guān)性已經(jīng)通過其與長期陽性結(jié)果的關(guān)聯(lián)而清楚的建立。PD-1/PD-L1表達，增加CD4+T細胞和B細胞浸潤以及TIL密度和三級淋巴結(jié)(TLS)結(jié)構(gòu)之間的重要關(guān)系[33]。有越來越多的證據(jù)表明TIL也是乳腺癌的重要免疫生物標(biāo)志物，幾項研究表明，腫瘤浸潤淋巴細胞與乳腺癌化療和預(yù)后改善相關(guān)聯(lián)。調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)的群體增加，并且轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達在腫瘤細胞和TIL上顯著增加[34]，有助于對抗腫瘤，對治療非小細胞癌有作用。

TCR-T是最近幾年剛興起的研究熱點，科學(xué)界對TCR-T的研究較少。NY-ESO-1是神經(jīng)母細胞瘤的抗原靶標(biāo)，研究證明NY-ESO-1 TCR具有靶向表達黑素瘤和非黑素瘤的活性。NY-ESO-1tTCR-T顯著延遲進展性彌散神經(jīng)母細胞瘤在體內(nèi)的進展[35]。繼NY-ESO-1靶點的TCR-T療法后，針對其他適應(yīng)證的CEA、MAGE、MART-1靶點的TCR-T療法陸續(xù)進入臨床研究。截至2016年末，TCR-T療法已陸續(xù)被應(yīng)用于膀胱癌、肺癌等實體瘤研究中。

2 免疫細胞與其他療法聯(lián)合治療方案及并發(fā)癥

腫瘤免疫療法包括免疫細胞治療、免疫檢查點抑制劑、細胞因子、細胞疫苗等。多種治療方法聯(lián)合應(yīng)用，效果比單一使用要好。臨床研究發(fā)現(xiàn)免疫檢查點抑制劑PD-1編程抗碳酸酐酶(CAIX)靶向CAR-T對腫瘤相關(guān)抗原有高親和力， CAR-T單鏈可變抗體片段(scFv)修飾的TCR是抗癌強有力的新方法。針對RANK配體的單克隆抗體denosumuab與免疫檢查點抑制劑(抗CTLA-4，抗PD-1)聯(lián)合治療惡性黑色素瘤效果顯著[36]。Knudson等[37]研究發(fā)現(xiàn)融合蛋白M7824靶向TGF-β和PD-L1/PD-1免疫抑制途徑對抗腫瘤有促進作用。細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)和PD-1，對非小細胞肺癌有較好的治療效果[38]。PD-1作用于肝細胞癌，20%的患者表現(xiàn)出客觀反應(yīng)，并且Nivolumab對先前服用索拉非尼和患者處于病毒感染狀態(tài)均有效[39]。PD-1靶向單克隆抗體Nivolumab聯(lián)合Ipilimumab在小細胞肺癌治療中安全有效[40]。PD-1/PD-L1抗體對改善三陰性乳腺癌(TNBC)腫瘤微環(huán)境，提高抗腫瘤免疫力有較強作用[41]。PD-1/PD-L1靶向單克隆抗體在臨床前環(huán)境中顯示出抗骨髓瘤活性[42]。Riley等[43]通過對微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)的結(jié)直腸癌(CRC)的深入研究，發(fā)現(xiàn)PD-1定向治療是有效的并且可能在未來治療中起中心作用。目前針對PD-1的抗體pembrolizumab和PD-L1的抗體atezolizumab均已獲FDA批準(zhǔn)用于晚期非小細胞肺癌(NSCLC)的挽救治療[44]。科研人員在《Cell》最新發(fā)文闡明溶瘤病毒治療可能通過改變腫瘤微環(huán)境來提高抗PD-1療法的療效[45]。阻斷PD-1/PD-L1信號通路有助于增強CIK對胃癌和結(jié)直腸癌的細胞毒性和抗腫瘤殺傷活性[46]。PD-1、PD-L1通路的阻斷可以提高CAR-T的抗腫瘤效應(yīng)[47]。TIL顯著增加，使得PD-1 mRNA高表達，靶向治療乳腺腫瘤[48]。另外，免疫治療聯(lián)合手術(shù)、放化療產(chǎn)生的治療效果也比單一免疫療法效果顯著。Susana Inogés等[49]通過對膠質(zhì)母細胞瘤的研究表明添加腫瘤裂解物脈沖DCs的接種腫瘤切除術(shù)和聯(lián)合放化療是可行和安全的。Zhi等[50]在單克隆抗體治療腫瘤過程中，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞可發(fā)揮巨噬細胞介導(dǎo)的抗體依賴的吞噬作用。并且通過體外特異性活化，增強巨噬細胞毒性，運用過繼傳輸可實現(xiàn)抗腫瘤作用。綜上，多種免疫療法聯(lián)合治療實體瘤是有效的。

免疫細胞治療肯定會有一定的副作用，目前我們觀察到的DC-CIK治療實體瘤病例，可發(fā)生失眠、厭食、關(guān)節(jié)疼痛、發(fā)熱、皮疹、類感冒樣癥狀等反應(yīng)，但是這些反應(yīng)，多數(shù)是一過性細胞因子釋放的體現(xiàn)，也可以不經(jīng)過任何治療，短時間內(nèi)自然緩解。個別患者出現(xiàn)嚴(yán)重的腫瘤靶器官和靶部位的攻擊，更是細胞治療有效性的體現(xiàn)。因為是自體免疫治療為主，因此不會出現(xiàn)自身免疫疾病發(fā)生，對患者自己的肝腎功能不會有不好的影響。個別患者因為自體的免疫細胞治療，還會帶來機體年輕化的改變，白頭發(fā)變黑，睡眠變好，消化功能增強，精神狀態(tài)改善等，這樣帶給患者高質(zhì)量的術(shù)后生活和治療過程。

如果患者聯(lián)合化療，可能在聯(lián)合化療期間還可檢測到惡心、嘔吐、骨髓抑制和輕微器官損傷[2,6]。但是細胞治療會減輕化療帶來的其他副作用。嚴(yán)重的副作用一般發(fā)生在CAR-T殺傷腫瘤細胞病例中，該治療方法可以釋放大量細胞因子進入血液循環(huán)，易引起急性呼吸窘迫綜合征和多器官衰竭。此外，CAR-T還會引起脫靶效應(yīng)和免疫逃逸等副作用[22]，一般在血液腫瘤治療中多見，實體腫瘤治療中比較少觀察數(shù)據(jù)。有臨床研究表明過繼T細胞療法抗腫瘤過程可產(chǎn)生限制性毒性[30]。部分高親和性的TCR-T在治療過程中也會出現(xiàn)脫靶效應(yīng)，對正常組織造成損傷[38]?？梢姡庖呒毎委煂嶓w瘤還有很多需要注意觀察的副作用，還需要更加深入的臨床研究和探索。需要科學(xué)家努力將不良反應(yīng)減到最低，實現(xiàn)最佳治療效果。

3 展望

如前所述，多種免疫療法在抗腫瘤方面得到應(yīng)用，也有很好的療效，并且完成Ⅰ期、Ⅱ期臨床試驗，臨床治療也相繼開展。目前應(yīng)用免疫治療惡性腫瘤的臨床病例日益增加，可以彌補手術(shù)、放化療等傳統(tǒng)方式“不徹底、易轉(zhuǎn)移、副作用大”等不足，有些患者生存的時間能夠延長3～5年，是國際公認(rèn)的有希望消滅癌細胞的第四大腫瘤治療新技術(shù)。免疫細胞聯(lián)合其他多種免疫療法共同作用產(chǎn)生的治療效果明顯優(yōu)于單一免疫療法。然而，免疫療法治療實體瘤的不良反應(yīng)也不能忽略，需要臨床實驗和進一步研究，努力將副作用減到最低，實現(xiàn)最好的治療效果。如何聯(lián)合應(yīng)用多種免疫療法更好治愈實體瘤和如何最大程度減低不良反應(yīng)仍是科學(xué)家們未來研究重點和探索方向。