孫翔翔，朱 琳，陳 偉

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

Q熱（query fever）是由貝氏柯克斯體（Coxiella burnetii）引起的一種自然疫源性人獸共患病。早在1937年，澳大利亞發(fā)生了一種發(fā)熱性疾病，因不明原因，故在當(dāng)時稱為Q熱，后來才證明其病原體為貝氏柯克斯體。貝氏柯克斯體是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，對理化因素抵抗力強(qiáng)，可在外界環(huán)境中長期存活[1]。貝氏柯克斯體存在兩種抗原相，根據(jù)菌體表面脂多糖組成的不同分為Ⅰ相和Ⅱ相。Ⅰ相病原體含有完整抗原組分，含光滑脂多糖，毒力強(qiáng)；經(jīng)細(xì)胞或雞胚多次傳代后成為Ⅱ相，含粗糙脂多糖，毒力降低[2]。

該菌可通過氣溶膠廣泛感染人和動物，因此美國反恐組織將其列為生物戰(zhàn)劑之一[3]。多種動物均能感染該菌，包括反芻動物、其他野生和家養(yǎng)動物、鳥類和節(jié)肢動物（尤其是蜱蟲）等[4-7]。人感染Q熱后有急性、慢性和亞臨床等多種表現(xiàn)形式，急性型通常表現(xiàn)為自限性發(fā)熱、肺炎和肉芽腫性肝炎等，用適當(dāng)?shù)目股刂委熅湍芎芸炜祻?fù)，慢性型一般出現(xiàn)心內(nèi)膜炎、血管感染和肝炎等癥狀，需要用抗生素治療2年或更長時間。動物感染Q熱多為隱性經(jīng)過，但可能會出現(xiàn)散發(fā)或暴發(fā)性流產(chǎn)、死胎或弱仔等繁殖紊亂癥狀，也可引起牛的不育和子宮炎癥，而且可持續(xù)感染多年，甚至終生無癥狀帶菌。迄今為止，Q熱已經(jīng)成為全球分布最廣泛的人獸共患病之一，幾乎世界上所有國家均有Q熱感染的報道。1950年，我國報道了首例Q熱病例。目前，Q熱在我國大部分地區(qū)都有流行。本文主要論述了Q熱診斷中常見的血清學(xué)和病原學(xué)技術(shù)，以期對該病的快速診斷和防控提供參考。

1 血清學(xué)診斷技術(shù)

1.1 補(bǔ)體結(jié)合試驗（CFT）

CFT是有補(bǔ)體參與的，以綿羊紅細(xì)胞和溶血素組成指示系統(tǒng)的免疫檢測方法，是Q熱抗體檢測中特異性非常高的一個試驗，被許多國家實驗室采用。在牛群中，大多數(shù)補(bǔ)體結(jié)合抗體是lgG1抗體。1958年我國在內(nèi)蒙古人群中發(fā)現(xiàn)Q熱補(bǔ)體結(jié)合陽性抗體，同時在當(dāng)?shù)氐呐Ｑ蜓逯幸矙z測到Q熱抗體。Szymańska-Czerwińska等[8-9]對波蘭 6個區(qū)域的151名農(nóng)場工人血清，用CFT進(jìn)行Q熱抗體檢測，發(fā)現(xiàn)平均血清陽性率為15.23%，對1 200只蜱蟲進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Q熱感染率為15.9%。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELIS A）

ELISA目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到Q熱的血清學(xué)抗體檢測中，是實驗室最常見的檢測方法之一，除了可以檢測IgM和IgG抗體外，還可以檢測IgA抗體，一般在臨床癥狀出現(xiàn)后的2～3周，便可以檢測到抗體?？贵w通常會在幾個月內(nèi)增多，并可持續(xù)數(shù)年。武文君等[10]以貝氏柯克斯體弱毒株Ⅱ相全菌為包被抗原，建立了Q熱貝氏柯克斯體間接ELISA檢測方法，通過方陣滴定法，對抗原包被濃度等各項反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定其陰陽性臨界值為0.44，與市場上其他Q熱抗體檢測試劑盒符合率為94.66%。Klemmer等[11]用成品ELISA試劑盒，對埃及境內(nèi)的牛、綿羊、山羊和駱駝血清進(jìn)行Q熱檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在2 699份血清樣品中，駱駝的血清陽性率最高，達(dá)到40.7%（215/528），其次是牛19.3%（162/840）。

1.3 間接免疫熒光法（IFT）

間接免疫熒光法是目前公認(rèn)的Q熱血清學(xué)診斷的參考標(biāo)準(zhǔn)。這種方法用于Q熱感染的早期診斷，通常在出現(xiàn)臨床癥狀的1～2周內(nèi)就可以檢測到抗體。孫長儉等[12]采集了遼寧省14個農(nóng)村地區(qū)的人群血液標(biāo)本，用IFT檢測人血清中的Q熱立克次體抗體，血清標(biāo)本總陽性率為7.33%。Wegdamblans等[13]用CFT、ELISA 和IFT 3種方法檢測了Ⅰ相IgG抗體、Ⅱ相IgG抗體和Ⅱ相IgM抗體，結(jié)果得出對3個月內(nèi)的急性Q熱感染診斷，這3種方法都有效，但對后期血清，IFT比其他兩種方法能檢測到更多的IgG抗體。

2 病原學(xué)診斷技術(shù)

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)是病原分離中常用的技術(shù)，貝氏柯克斯體的傳代和培養(yǎng)是采用綠猴腎細(xì)胞（BGM細(xì)胞）在特定無抗生素培養(yǎng)基中進(jìn)行的。一般受感染的細(xì)胞在2 d左右其胞漿內(nèi)會出現(xiàn)散在的病原體，5～7 d內(nèi)病原大量增殖。甲醇固定后，用姬姆薩染色法可見紫紅色小球狀或短桿狀體。目前，隨著無生命培養(yǎng)基CCM及其衍生物ACCM、ACCM-1等的出現(xiàn)[14]，貝斯柯克斯體的培養(yǎng)進(jìn)入了一個新的時代，也打破了常規(guī)認(rèn)為貝氏柯克斯體是“專性胞內(nèi)寄生菌”的認(rèn)識。

2.2 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)是目前分子生物學(xué)診斷中最常用的技術(shù)之一，在Q熱的診斷中，由于PCR技術(shù)比血清學(xué)的診斷時間早，而且相對病原分離，操作簡單、分離率高，因此目前已取代病原分離而成為直接診斷的依據(jù)。PCR技術(shù)包括常規(guī)PCR、多重PCR、巢式PCR和熒光定量PCR等。多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)反應(yīng)體系中加入多對引物，同時擴(kuò)增出多個核酸片段，其優(yōu)點是能鑒定不同基因種型，并提高檢出率；巢式PCR適合Q熱的早期診斷，能提高PCR的敏感性和特異性；熒光定量PCR的優(yōu)點是特異性高，反應(yīng)時間短，而且能夠做到定量檢測。Maria-Guia等[15]用不同生物樣本比較了巢式PCR和常規(guī)PCR方法，發(fā)現(xiàn)19個樣本中只有巢式PCR檢測到12個陽性。亞紅祥等[16]用熒光定量PCR、巢式PCR和普通PCR方法分別對Q熱htpAB基因片段進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熒光定量PCR方法的靈敏度分別為巢式PCR和普通PCR的10倍和100倍，而熒光定量PCR耗時約1 h，巢式PCR耗時約2.5 h，普通PCR耗時約1.5 h。因此，熒光定量PCR方法具有很好的敏感性、特異性、重復(fù)性和可操作性。

2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）

LAMP是一種新型核酸擴(kuò)增方法。該方法是針對目的序列設(shè)計4～6對引物，在60～65 ℃條件下進(jìn)行等溫擴(kuò)增，操作簡便，對儀器要求極低。張琪等[17]利用體外合成的IS1111a基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，建立了可視化LAMP反應(yīng)體系，可準(zhǔn)確區(qū)別貝氏柯克斯體重組質(zhì)粒與新橋株，最低可檢測到3.6×102拷貝/反應(yīng)。Chen等[18]將LAMP試劑和熒光染料一起凍干，通過對貝氏柯克斯體質(zhì)粒DNA的檢測來測試其穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種改良后的試劑可以在4 ℃中保持24個月的穩(wěn)定性。

2.4 重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）

RPA是一種新興的核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)。該方法的原理是使用重組酶與引物結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物會引發(fā)模板DNA快速合成，通常在25～42 ℃便可完成核酸的快速恒溫擴(kuò)增，特異性強(qiáng)、靈敏度高、反應(yīng)快速。目前RPA也可與側(cè)層析試紙條、探針、生物芯片等多種方法相結(jié)合進(jìn)行檢測，基于RPA建立的診斷方法在病毒、細(xì)菌、寄生蟲等疾病診斷方面的應(yīng)用越來越廣泛[19]。Qi等[20]將RPA與側(cè)層析試紙條相結(jié)合檢測貝氏柯克斯體新橋株的23S RNA，最低可檢測到10拷貝/反應(yīng)的陽性質(zhì)?；?拷貝/反應(yīng)的DNA。Koo等[21]建立的快速診斷方法可在20 min內(nèi)進(jìn)行DNA快速檢測，對急性Q熱樣本的臨床檢測敏感性大于90%。

2.5 基因芯片

基因芯片技術(shù)以核酸雜交為基礎(chǔ)，通過使用多種高度特異的探針來識別或檢測不同物種，快速、特異和高通量[22]。焦俊[23]利用30個貝氏柯克斯體重組表面蛋白點制成1張蛋白芯片，經(jīng)感染小鼠血清和Q熱患者血清篩選出15個主要血清蛋白，可將其作為Q熱血清學(xué)檢測的候選診斷抗原和研發(fā)Q熱亞單位疫苗的候選免疫原。Schmoock等[24]用建立的基因芯片方法篩選小反芻動物棉拭子、環(huán)境樣品和人體樣品，表明基因芯片技術(shù)可以快速有效地鑒定致病性種類和用于分型。

3 討論

Q熱宿主廣泛，感染性強(qiáng)，可通過氣溶膠傳播，一旦流行很難控制。在我國，Q熱是一類被忽視的烈性傳染病，僅有少數(shù)幾個實驗室從事Q熱研究，而且誤診、漏診現(xiàn)象偏多[25]。究其原因，一是由于Q熱臨床表現(xiàn)形式多樣，二是缺乏有效實驗室診斷技術(shù)的鑒定和流行病學(xué)資料的驗證。目前實驗室診斷常用的血清學(xué)方法中，CFT操作步驟繁瑣，很容易出現(xiàn)不正確結(jié)果；ELISA方法相對成熟，但影響因素復(fù)雜，容易出現(xiàn)結(jié)果失真；IFT特異性和敏感性都很高，對設(shè)備要求較高，不易普及。病原學(xué)診斷方法中，細(xì)胞培養(yǎng)需要高等級的生物安全實驗室，且病原體不易培養(yǎng)；熒光定量PCR技術(shù)特異性和敏感性好，但操作成本較高。隨著生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，各種各樣的檢測方法已開始應(yīng)用到Q熱的診斷中，如LAMP、RPA和基因芯片等都有很好的發(fā)展前景。加強(qiáng)對Q熱新型診斷技術(shù)的研究，從而研發(fā)出更加快速、特異和高效的診斷方法，必將為Q熱的快速診斷和防控奠定基礎(chǔ)。