王玉波1，徐倩倩，郭時(shí)金，王艷萍，張 穎，楊麗梅，沈志強(qiáng)

在發(fā)展中國家，腸致病性大腸桿菌(enteropathogenicEscherichiacoli，EPEC)經(jīng)常引發(fā)嬰兒腹瀉。EPEC感染分為以下幾步：第一，粘附到宿主細(xì)胞引起黏附/消除損傷，并伴隨著微絨毛的消失；第二，利用Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type III secretion system，T3SS)將細(xì)菌效應(yīng)蛋白傳遞到宿主細(xì)胞內(nèi)部；第三，激動(dòng)蛋白基座形成[1]。腸道上皮細(xì)胞在防御EPEC入侵過程中發(fā)揮重要作用。腸道上皮細(xì)胞側(cè)膜的頂端部分含有連接復(fù)合體，包括緊密連接(tight junctions，TJs)、黏著連接和細(xì)胞橋粒。細(xì)胞橋粒和黏著連接機(jī)械性地與相鄰細(xì)胞連接，而緊密連接在腸腔和單層上皮細(xì)胞漿膜側(cè)形成了可調(diào)節(jié)的屏障(屏障功能)。細(xì)胞頂端-基底極性對(duì)于細(xì)胞功能的發(fā)揮具有重要作用，主要表現(xiàn)在：細(xì)胞形態(tài)的維持、定向囊泡運(yùn)輸、離子和溶質(zhì)運(yùn)輸、蛋白和脂類在特異性膜位點(diǎn)的定位等[2-3]。緊密連接通過限制上皮細(xì)胞膜頂端和基底側(cè)的自由活動(dòng)維持細(xì)胞極性，從而直接幫助水分、電解質(zhì)和營養(yǎng)的移動(dòng)(柵欄功能)。本文主要闡述了緊密連接在維持上皮細(xì)胞極性中的作用、腸致病性大腸桿菌對(duì)緊密連接的破壞作用、腸致病性大腸桿菌對(duì)上皮細(xì)胞極性的影響及其作用機(jī)制。

1 緊密連接與上皮細(xì)胞極性

上皮細(xì)胞在防御病原微生物入侵中發(fā)揮了重要作用。緊密連接位于側(cè)膜頂端部位，負(fù)責(zé)填充上皮細(xì)胞間的孔隙[4]。TJs通過調(diào)節(jié)跨上皮水和溶質(zhì)流動(dòng)控制細(xì)胞滲透性，通過限制頂端和側(cè)面細(xì)胞質(zhì)膜成分混合維持頂端-基底極性[5]。

TJs由跨膜蛋白和調(diào)節(jié)蛋白構(gòu)成?？缒さ鞍装ㄩ]合蛋白、閉鎖蛋白、tricellulin、MarvelD3，和連接粘附分子-A(junctional adhesion molecule-A，JAM-A)，用于維持TJ鏈結(jié)構(gòu)，控制細(xì)胞滲透性，調(diào)節(jié)屏障功能，參與黏附和免疫系統(tǒng)細(xì)胞遷移；調(diào)節(jié)蛋白包括正閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens 1，ZO-1)、ZO-2、ZO-3、扣帶蛋白、膜關(guān)聯(lián)鳥苷酸激酶轉(zhuǎn)化蛋白-1(membrane—associated guanylate inverted 1，MAGI-1)、MAGI-3和MUPP-1，將跨膜蛋白連接于細(xì)胞骨架。細(xì)胞骨架蛋白(ARP2/3、N-WASP、皮動(dòng)蛋白和VASP)，激動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)因子(RhoA、Rac和小GTP酶CDC42家族)，轉(zhuǎn)錄因子和非肌肉肌球蛋白II(nonmuscle myosin II，NMII)定位于緊密連接，調(diào)節(jié)不同的信號(hào)通路[5]。

TJs對(duì)于上皮細(xì)胞頂端-基底極性的形成和維持至關(guān)重要，通過三種極性復(fù)合物控制。Crumbs復(fù)合物包括Crumbs(CRB)，Lin-7相關(guān)蛋白(PALS1)和PALS1相關(guān)緊密連接蛋白(PATJ)。Par復(fù)合物由分隔缺陷類似物3和6(partitioning defective homologue 3 and6，PAR3/PAR6)，非典型的蛋白激酶C(atypical protein kinase C，aPKC)和CDC42構(gòu)成。第三個(gè)復(fù)合物由Scribble、幼蟲巨大致死性基因(lethal giant larvae，Lgl)、disc large(Dlg)構(gòu)成。它們共同維持著細(xì)胞頂端-基底極性，從而維持細(xì)胞形態(tài)、囊泡定向運(yùn)輸，離子和電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及蛋白質(zhì)和脂質(zhì)特異性定位于不同的膜位點(diǎn)[2]。

PAR6/aPKC復(fù)合物引起了特別關(guān)注，PAR6作為支架蛋白與其他所有極性復(fù)合物相互作用，使PKC能夠?qū)⒁源思っ笧榈孜锏臉O性蛋白磷酸化。PAR與CDC42-GTP相互作用激活PKC使PAR3磷酸化，導(dǎo)致TJ蛋白聚集和細(xì)胞極性的建立[6]。PAR6與PALS1和CRB3相互作用，CRB3是aPKC的靶蛋白，該復(fù)合物對(duì)于TJ形式非常重要[7]。PAR6與側(cè)面極性蛋白Lgl相互作用，促使aPKC磷酸化及Lgl從頂膜排出，使頂端-基底進(jìn)一步極性化，促進(jìn)上皮連接形成[8]。由上可知，TJ和極性蛋白之間存在復(fù)雜的相互作用以構(gòu)成并維持TJ結(jié)構(gòu)和功能以及頂端-基底極性，保證細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整。

2 EPEC破壞TJs

EPEC通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type III secretion system，T3SS)將細(xì)菌效應(yīng)蛋白傳遞到宿主腸道上皮細(xì)胞，引發(fā)腹瀉。EPEC破壞腸道上皮細(xì)胞TJ結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞屏障和門控功能改變[9-13]。EPEC介導(dǎo)的TJs破壞引發(fā)宿主細(xì)胞多種改變：蛋白-蛋白相互作用的解離；TH蛋白claudin-1、occludin和ZO-1分布紊亂；側(cè)膜出現(xiàn)異常鏈導(dǎo)致屏障功能丟失[14]。EPEC效應(yīng)因子，特別是EspF、Map、NleA和EspG對(duì)TJ混亂方面已有諸多研究。EspF將TJ內(nèi)occludin重新定位，減弱了經(jīng)上皮細(xì)胞電阻(transepithelial electrical resistance，TER)，增加了T84單層細(xì)胞的通透性[9]。在小鼠感染模型中顯示，EspF也能破壞TJs體內(nèi)結(jié)構(gòu)[15]。EPEC感染小鼠回腸和結(jié)腸顯示閉鎖蛋白呈現(xiàn)顯著的再分布和屏障功能的消失，說明其在EPEC致病性中的作用[9, 11]。

Map調(diào)節(jié)上皮屏障功能也在EPEC引發(fā)腹瀉中發(fā)揮作用。Map與鈉氫交換體調(diào)控因子Ⅰ和Ⅱ(Na+/H+exchanger regulatory factors I 和II，NHERF1/2)相互作用，調(diào)節(jié)腸道離子通道[15]。敲除map可減弱EPEC誘導(dǎo)的Caco-2單層細(xì)胞TER下降[10]。Citrobacterrodentium是與EPEC相似的鼠病原，小鼠感染敲除map的Citrobacterrodentium菌株，與野生型C.rodentium引起的腹瀉相比，腹瀉嚴(yán)重程度明顯降低，說明map在腸道離子和水轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用[16]。Map在MDCKⅡ細(xì)胞中組成型表達(dá)增強(qiáng)了帶電荷和不帶電荷分子的通透性，表明門控功能的失效[17]。

NleA使ZO-1和閉鎖蛋白重新分配，引起腸道單層細(xì)胞中TER快速降低。NleA結(jié)合并抑制COPⅡ蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物參與蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的包裝和運(yùn)輸[18]。感染C.rodentium鼠模型顯示，去除NleA與COPⅡ復(fù)合物相互作用能夠抑制ZO-1和閉鎖蛋白的重新分布并減少野生型菌株引起的細(xì)胞滲透性增強(qiáng)，說明NleA能夠通過阻止新合成的TJ蛋白到達(dá)頂膜來影響TJs[19]。

EspG使TER減少，調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞粒度選擇滲透性[12]。EspG破壞微管網(wǎng)絡(luò)表現(xiàn)在閉鎖蛋白在細(xì)胞質(zhì)的蓄積和TJ恢復(fù)的延遲，表明EspG阻止TJ修復(fù)[20]。

3 EPEC引起細(xì)胞頂端-基底極性消失

EPEC對(duì)宿主腸道上皮細(xì)胞極性的影響多采用間接研究。Muza-Moons等采用T84腸道上皮細(xì)胞證明EPEC感染導(dǎo)致兩種底外側(cè)蛋白，β1-整聯(lián)蛋白和Na+/K+ATP酶有序地重新分布到頂端部分。β1-整聯(lián)蛋白是一種細(xì)胞黏附分子，參與將極性上皮細(xì)胞錨定到底膜。整合素類在極性的形成中發(fā)揮了重要作用。

EPEC外膜蛋白和主要黏附因子intimin與EPEC Tir(translocated intimin receptor，Tir)相互作用。intimin能夠與宿主蛋白β1-integrin相互作用，但這種蛋白位于極性上皮細(xì)胞底外側(cè)，因此不能與腸道EPEC接觸。然而EPEC感染促使β1-integrin移到頂端位置，從而可以與intimin相互作用。敲除Tir的EPEC感染極性單層上皮細(xì)胞對(duì)TER沒有影響。在極性已改變，β1-integrin已到達(dá)頂端的單層細(xì)胞，TER下降與野生型EPEC引起的下降相似，表明了其在EPEC致病中改變極性的作用[21]。

腸道內(nèi)有效的離子轉(zhuǎn)運(yùn)有賴于細(xì)胞極性。Na+/K+ATP酶通過底外側(cè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)三種細(xì)胞內(nèi)Na+和兩種胞外K+。這種電化學(xué)梯度對(duì)于小腸和結(jié)腸電解質(zhì)和水轉(zhuǎn)運(yùn)非常重要[22]。EPEC感染影響多種腸道轉(zhuǎn)運(yùn)體，包括鈉氫交換體3(NHE3)和腺瘤下調(diào)(down regulated in adenoma，DRA)，造成離子和水分丟失，引發(fā)腹瀉[23]。EPEC還擾亂Na+/K+ATP酶在底外側(cè)的定位，甚至將其他離子轉(zhuǎn)運(yùn)體和通道重新分配于頂膜位點(diǎn)[14, 21]，可能與EPEC的病理生理學(xué)有關(guān)。

除了底外側(cè)蛋白重新分布，EPEC感染還導(dǎo)致ZO-1，閉鎖蛋白和claudin-1從TJ區(qū)轉(zhuǎn)移到側(cè)膜和細(xì)胞質(zhì)，這就造成了結(jié)構(gòu)/分子相關(guān)性屏障功能的丟失。EPEC感染單層細(xì)胞冷凍斷裂復(fù)型揭示了異常鏈沿著側(cè)膜表面延伸TJ區(qū)下方，表明TJ區(qū)域的普遍性改變。這些結(jié)構(gòu)改變與細(xì)胞滲透性增加和TER減少都有關(guān)系[14]。基側(cè)膜和TH蛋白的再分布和異常TH鏈的出現(xiàn)表明頂端-基底極性的消失。EPEC誘導(dǎo)的TJ結(jié)構(gòu)和頂端-基底極性的擾亂使得其他細(xì)胞質(zhì)和膜蛋白自由擴(kuò)散到非正常細(xì)胞位點(diǎn)，進(jìn)一步增強(qiáng)了EPEC的致病性。

4 EPEC對(duì)Par極性復(fù)合物的影響

EPEC感染T84細(xì)胞增加PKC-ζ酶活性，并促使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到含有不溶性碎片的膜蛋白[24]。aPKC激酶的激活增加了CDC42與PAR6/aPKC結(jié)合，這是Par極性復(fù)合物調(diào)節(jié)的關(guān)鍵步驟。EPEC效應(yīng)因子Map激活CDC42 GTPase，促使絲足的形成[25]和CDC42活化，可能在改變aPKC活性中也發(fā)揮作用。細(xì)胞質(zhì)銜接蛋白14-3-3家族也參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。PAR3磷酸化后能通過aPKC比較容易地與14-3-3結(jié)合，破壞這種相互作用會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞極性消失，說明14-3-3/PAR3調(diào)節(jié)Par極性復(fù)合物的活性[26]。在T84單層細(xì)胞，EspF與14-3-3ζ和細(xì)胞角蛋白-18(CK-18)相連[27]，支持了EPEC通過其效應(yīng)因子調(diào)節(jié)Par復(fù)合物的假說。

EspG破壞微管并延遲EPEC感染引發(fā)的TJs損傷的修復(fù)[20]。EspG與ADP-核糖基化因子(ADP-ribosylation factor，ARF)和P21-激酶(p21-activated kinase，PAK)結(jié)合位點(diǎn)RAC/CDC42相結(jié)合[28]。PAK家族作用于RAC1和CDC42 GTP酶下游，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞移動(dòng)。雖然EspG與ARF和PAK之間的相互作用對(duì)微管損傷沒有影響[20]，但其對(duì)頂端-基底極性的影響則未見報(bào)道。

除了EPEC效應(yīng)因子對(duì)Par極性復(fù)合物的直接作用，可能還存在黏附底座引起的間接作用。例如，EPEC感染過程中，Tir被直接注入宿主細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)磷酸化并將肌動(dòng)蛋白聚合物募集于細(xì)菌結(jié)合位點(diǎn)[29]。Tir與CK-8和CK-18相互作用并將它們募集到EPEC誘導(dǎo)的底座。細(xì)胞角蛋白是中間絲(intermediate filaments，IF)的必須部分，在上皮細(xì)胞極化中發(fā)揮了重要作用。例如，CK-8基因敲除小鼠顯示aPKC下調(diào)，突觸融合蛋白3和頂膜蛋白(堿性磷酸酶、蔗糖異麥芽糖酶、囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子)消失，微管紊亂，離子轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷及離子轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)細(xì)胞隔室脫靶[30]。14-3-3蛋白與CK-8和CK-18結(jié)合，CK-18的磷酸化對(duì)其與Ser33的結(jié)合至關(guān)重要[31-32]。EspF與CK-18相互作用，EPEC感染增加了CK-18的溶解性，導(dǎo)致EPEC感染上皮細(xì)胞IF網(wǎng)絡(luò)的架構(gòu)發(fā)生劇烈變化。敲除espF能破壞EPEC誘導(dǎo)的CK-18溶解性和IF形態(tài)學(xué)改變[27]。EspF與14-3-3ζ/CK-18以時(shí)間依賴性形成復(fù)合物。因此我們推斷，EspF通過與14-3-3ζ/CK-18結(jié)合在細(xì)胞極性破壞中發(fā)揮作用。以上結(jié)果說明，EPEC效應(yīng)因子協(xié)同作用，通過在空間上和時(shí)間上多角度多步驟的調(diào)控的方式破壞細(xì)胞極性。

5 展 望

大量研究強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞間連接在頂端-基底極性維持中的作用，反之亦然，說明兩類分子復(fù)合物之間存在交互對(duì)話。EPEC對(duì)上皮細(xì)胞破壞作用的研究較多，而EPEC對(duì)頂端-基底極性的研究較少。我們討論了EPEC是如何通過異常調(diào)節(jié)多種因素來改變上皮細(xì)胞極性，包括腸道屏障的破壞、粘附和極性蛋白的重新分布、極性復(fù)合物向感染位點(diǎn)的募集，所有這些都會(huì)破壞頂端基底極性。TJs完整性和細(xì)胞極性的改變可能是病原體感染性疾病發(fā)生過程中的重要步驟。微生物對(duì)上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面的影響還需進(jìn)一步研究。

利益沖突：無

本文引用格式：王玉波, 徐倩倩, 郭時(shí)金, 等. 腸致病性大腸桿菌改變腸道上皮細(xì)胞極性的研究進(jìn)展[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào), 2019,35(4):350-354. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.037