結(jié)核潛伏性感染(latent tuberculosis infection，LTBI)是指生物體在感染結(jié)核分枝桿菌后未發(fā)病，且無活動性結(jié)核的臨床病癥表現(xiàn)、影像學改變等癥狀的一種特殊狀態(tài)。在潛伏感染期間若得不到及早的診斷和治療，感染人群將會有5%到10%的可能性會發(fā)展為活動性結(jié)核，進而發(fā)生進一步的傳播[1]。目前，結(jié)核病診斷方法主要有痰涂片鏡檢法、血清學診斷、結(jié)核菌素皮膚試驗及MTB核酸擴增檢測等，但其普遍存在培養(yǎng)時間長，敏感性、特異性差，易發(fā)生交叉反應(yīng)造成假陰性等缺點[2-5]。目前商品化試劑盒如膠體金法試劑盒TB38-16KD，其基于重組抗原組合用于血清學的診斷，但在臨床檢驗中并不能診斷潛伏期結(jié)核。

結(jié)核菌γ-干擾素體外釋放試驗(interferon-gamma release assay of MTB，TB-IGRA)指在體外采用MTB抗原刺激特異性T細胞免疫應(yīng)答，現(xiàn)近年來，以結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)的RD區(qū)抗原為刺激原的γ-干擾素(IFN-γ)釋放試驗(IGRA)已經(jīng)用于MTB感染的診斷，且被證實有較好的特異性和靈敏性[6-10]。為確定結(jié)核分枝桿菌在IGRA實驗中對結(jié)核潛伏性感染有效診斷抗原，急需篩選具有高檢出率的MTB特異抗原蛋白。越來越多的證據(jù)表明，細菌細胞壁或表面定位酶可作為抗原蛋白引起宿主細胞的免疫反應(yīng)[11-13]。在本研究中，我們使用了一種特殊的抗原蛋白RV0220，并探討了它用于IGRA對結(jié)核潛伏性感染的診斷價值。RV0220是基于共有基序GXSXG存在的家族成員，是一種酯酶，并且是存在于MTB細胞壁和莢膜中的細胞表面蛋白，能夠引發(fā)促炎性細胞因子在肺上皮細胞和巨噬細胞中的產(chǎn)生[14]。

本文研究了112例臨床樣本外周血特異性γ-干擾素反應(yīng)，使用目前IGRA廣泛使用的已商品化的ESAT-6、CFP-10、TB7.7三種抗原蛋白(以下簡稱ECT)混合后進行IGRA試驗作為結(jié)果對照，現(xiàn)將Rv0220作為IGRA刺激原對臨床樣本血清的結(jié)核潛伏性感染診斷價值研究報道如下。

1 材料與方法

1.1樣本、菌株與主要試劑 臨床樣本血清來源于新疆喀什結(jié)核病防治中心(肺核醫(yī)院)體檢血樣。人結(jié)核桿菌感染血清、結(jié)核分枝桿菌及PET-28a質(zhì)粒、大腸桿菌等均為本實驗室保存。人淋巴細胞分離液、刀豆蛋白A、IGRA商品化試劑盒等均購于北京索萊寶生物技術(shù)有限公司。以上材料符合我院倫理標準。

1.2Rv0220抗原蛋白的原核表達及western blot檢測 通過PCR擴增Rv0220基因構(gòu)建pET28a(+)-Rv0220重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliDE3，用異丙基硫半乳糖苷(IPTG，1 mmol/L)在37 ℃條件誘導(dǎo)6 h，收集細胞。誘導(dǎo)表達的菌液經(jīng)超聲儀破碎后加入結(jié)合緩沖液(按照Hi Trap FF Ni離子親和層析說明書操作)上層析柱，用洗脫緩沖液洗脫。將峰值洗脫產(chǎn)物收集后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉過夜，以結(jié)核分枝桿菌感染陽性血清以1∶50稀釋作為一抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG以1∶8 000稀釋作為二抗進行Western blot檢測。以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作為顯色劑，顯色1 min后，用去離子水終止反應(yīng)。

1.3γ-干擾素體外釋放試驗 取24孔板，每一份檢測樣品分為3個實驗孔，在每個孔內(nèi)依次加入RPMI-1640細胞培養(yǎng)液，陰性對照孔加入PBS，終濃度為10 μg/mL，3個實驗孔樣品依次為ECT蛋白溶液、Rv0220蛋白溶液和刀豆蛋白A(Con A)各100 μL，終濃度均為10μg/mL，然后在每個反應(yīng)孔內(nèi)加入2.5×106/mL 的T淋巴細胞(外周血樣分離所得)400 μL，使每個孔的細胞數(shù)量及液體體積相等，混勻，于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～22 h。用無菌離心管(無內(nèi)毒素、無RNA酶)收集每個實驗孔的液體，3 000 r/min離心15 min，收集上層液體標記后-20 ℃保存。通過ELISA方法測定γ-干擾素含量，此過程嚴格按照IGRA商品化試劑盒說明書進行測定。

1.4γ-干擾素標準曲線的建立 將人IFN-γ標準品稀釋依次為0 pg/mL、12.5 pg/mL、25 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、300 pg/mL、400 pg/mL置于實驗孔內(nèi)，每個樣品4次重復(fù)?？瞻卓字胁缓后w。加入50 μL的IFN-γ抗體，37°C孵育1 h。洗滌后，每孔加入50 μL的著色劑A和B，在37 ℃下孵育15 min后加入終止溶液，10 min內(nèi)測定樣品在450 nm處的吸光度。用Prism7軟件將標準品濃度作為橫坐標、OD450nm值作為縱坐標得出擬合方程，在該方程中找出相關(guān)系數(shù)>0.99的線性范圍作線性標準曲線，見圖3。根據(jù)標準曲線計算T、N、P組的IFN-γ含量。IFN-γ釋放結(jié)果依據(jù)萬泰IGRA-TB試劑盒提供的判斷方法進行，見表1所示。

表1 IGRA試驗結(jié)果判定標準

Tab.1 Criteria for determination of IGRA test results

陰性對照陽性對照-陰性對照測試孔-陰性對照結(jié)果判定≤400任何值≥14且≥N/4陽性≥20<14陰性≥20≥14但≤N/4不確定<20<14不確定<20≥14且400任何值任何值不確定

1.5統(tǒng)計學處理 使用SPSS17.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1Rv0220抗原蛋白表達純化與Western blot免疫性檢測 用IPTG誘導(dǎo)PET-28a Rv0220 DE3表達載體，并用Ni離子親和層析法純化。用SDS-PAGE對純化的蛋白進行分析。蛋白質(zhì)的分子量約為47 kDa，與預(yù)期值一致，純化蛋白僅作為一條帶出現(xiàn)。見圖1，表明Rv0220蛋白在大腸桿菌中表達成功。以TB陽性血清1∶50稀釋液為第一抗體，羊抗人IgG HRP(1∶8 000稀釋液)為第二抗體進行Western印跡鑒定，證明RV0220具有良好的免疫反應(yīng)性(圖略)。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；a：未誘導(dǎo)大腸桿菌DE3；b：PET-28a載體；c：超聲破碎后的上清液；d：超聲破碎后的包涵體；e：純化后的Rv0220蛋白圖1 Rv0220蛋白SDS-PAGE電泳分析Fig.1 Rv0220 protein SDS-PAGE electrophoresis

2.2 Rv0220蛋白IGRA檢測

2.2.1人IFN-γ濃度標準曲線的建立 IFN-γ標準品濃度濃度分別為12.5 pg/mL、25 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、300 pg/mL、400 pg/mL加入IFN-γ抗體測定450nm處的吸光度，以濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標得到線性標準品的方程為y=0.002 882x+0.139 3，R2=0.994，具有較高的相關(guān)系數(shù)，見圖3。

圖3 人IFN-γ濃度標準曲線Fig.3 Standard curve of human IFN- gamma concentration

2.2.2Rv0220蛋白IGRA檢測靈敏性與特異性 用刀豆蛋白 A作為陽性對照刺激各組淋巴細胞，均可引起IFN-γ釋放，表明各組細胞免疫功能正常。對兩組抗原引發(fā)T細胞反應(yīng)分泌IFN-γ水平進行顯著性分析。結(jié)果表明，以ECT抗原組合作為對照，Rv0220蛋白在刺激IFN-γ釋放水平上均無顯著性差異(P>0.05)，相關(guān)系數(shù)r>0.5，表明Rv0220抗原誘導(dǎo)細胞免疫的能力基本與ECT組合保持一致，且與ECT組合具有較高的相關(guān)性。以ECT檢測結(jié)果為參照，Rv0220蛋白檢測臨床樣本靈敏性為72.73%，特異性為100%，陽性預(yù)測值為72.73%，陰性預(yù)測值為40%。見表2。

表2 Rv0220蛋白IGRA檢測靈敏性與特異性結(jié)果

Tab.2 Sensitivity and specificity of Rv0220 protein IGRA detection

樣本量ECTRv0220靈敏性特異性112陽性陰性不確定陽性陰性不確定72.73%100%8816864(64)40(16)8(8)

()表示Rv0220檢測結(jié)果與ECT檢測結(jié)果相同的樣本數(shù)。

3 討 論

近年來，γ-干擾素釋放試驗在結(jié)核病的臨床診斷中廣泛應(yīng)用。與其他試驗相比，IGRAs能夠高效地分離卡介苗接種人群以及其他非致病性分枝桿菌的感染，為結(jié)核病的治療提供指導(dǎo)，并且整個試驗過程費時短，敏感性和特異性較高。其原理是基于T淋巴細胞的免疫應(yīng)答過程。T細胞接觸結(jié)核分枝桿菌的特異性抗原，當再次接觸結(jié)核分枝桿菌的特異性抗原(如TB7.7等)時,T細胞將分化成為效應(yīng)T細胞并且會釋放多種細胞因子，其中包括變化水平高的IFN-γ，由此可以通過IFN-γ含量變化或者釋放IFN-γ 的T淋巴細胞的數(shù)量來檢測生物個體是否感染結(jié)核分枝桿菌。根據(jù)Meta研究結(jié)果，IGRAS在結(jié)核病臨床檢測中的敏感性與特異性較高，分別在78%～100%和87.5%～100%之間[15-16]。Park HJ等發(fā)現(xiàn)，在發(fā)展比較落后且結(jié)核病高發(fā)地區(qū)，IGRAs的檢測效果與TST相差不大[17-18]。由于不同人群中l(wèi)eukocyte antigen的高度多態(tài)性和不同人群的細胞免疫水平不同，所以抗原引起的T細胞免疫強度不同，以至于對不同國家和地區(qū)的檢測敏感性和特異性存在差異。因此，在刺激抗原的基礎(chǔ)上篩選適合我國人群的IGRA刺激抗原對結(jié)核的潛伏性感染診斷具有重要意義。

本實驗采用親和層析方法純化Rv0220蛋白，并通過 Western blot驗證這種蛋白具有良好的抗原反應(yīng)性?；谏鲜鲈?，通過對臨床無癥狀樣本外周血的IGRA檢測，以現(xiàn)廣泛應(yīng)用并以商品化的ESAT-6、CFP-10和TB7.7混合蛋白組合為對照，得到Rv0220對臨床樣本的IGRA檢測靈敏性為72.73%，特異性為100%，雖然有較高的靈敏性與特異性，但結(jié)果出現(xiàn)較多假陰性與不確定現(xiàn)象，有可能是患者長期服用免疫抑制藥或免疫功能低下的結(jié)果。 此外，T細胞的活性對IFN-γ的釋放同樣具有重要影響。通過Rv0220與三種廣泛應(yīng)用的抗原蛋白的檢測結(jié)果的比較，Rv0220蛋白在IFN-γ釋放水平上與對照抗原無顯著性差異，且具有較高的相關(guān)性(r>0.5)，對于結(jié)核的潛伏性感染檢測具有重要的應(yīng)用價值，且IGRA在肺結(jié)核、活動性肺結(jié)核、陳舊性肺結(jié)核、特殊人群肺結(jié)核中的檢測有較好的靈敏度與特異性[19-20]，為IGRA新型刺激抗原的篩選和對于其他類型結(jié)核的研究奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突：無

本文引用格式：王霜玨, 姬祥, 張倩, 等. Rv0220蛋白IFN-γ釋放試驗對結(jié)核潛伏感染的診斷價值研究[J]. 中國人獸共患病學報, 2019,35(4): 315-319. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.029