孔晶晶,張多多

(1.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 老年醫(yī)學科，遼寧 大連 116011；2.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 心律失?？?，遼寧 大連 116011)

隨著人口老齡化進程，阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的發(fā)病率逐年升高，目前仍缺乏有效的藥物治療。AD的病因尚不明確，大量證據(jù)表明自由基生成過多引起的氧化應激反應是AD神經(jīng)病理改變的主要致病因素[1]。氧化應激通過激活β-分泌酶促進β淀粉樣肽(β-amyloid peptide，Aβ)的產(chǎn)生[2]，Aβ可以通過多種途徑誘導活性氧產(chǎn)生，生成過多的氧自由基，引起細胞氧化應激性損傷。提示氧化應激反應和Aβ的產(chǎn)生和聚集有著密不可分的作用。目前關于ATP敏感性鉀通道(ATP sensitive potassium channel，KATP)開放劑對AD細胞模型氧化應激和Aβ生成的影響和機制的研究，相關報道較少。

PI3K/AKT信號通路是細胞內(nèi)重要的促細胞存活的通路之一，糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)一個多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，它是PI3K/Akt信號通路下游的一個關鍵靶點，活化的Akt通過磷酸化GSK-3β的Ser9殘基使得GSK-3β失活。而GSK-3β對于神經(jīng)細胞凋亡，tau蛋白磷酸化，Aβ的生成均有著重要的調(diào)節(jié)作用[3-4]。

本文以首個應用于臨床的KATP開放劑尼可地爾為研究藥物，構(gòu)建高表達瑞典突變型淀粉樣前體蛋白的神經(jīng)母細胞瘤細胞作為AD的體外細胞模型，研究尼可地爾對AD細胞模型氧化應激和Aβ生成的影響，并探討PI3K/AKT/GSK-3β通路在尼可地爾參與氧化應激、Aβ生成調(diào)節(jié)中的可能分子機制。

1 材料和方法

1.1 材 料

人神經(jīng)母細胞瘤株SH-SY5Y細胞購自中科院上海細胞庫。pcDNA3.1-APP695swe質(zhì)粒由北京賽諾科為科技有限公司設計并合成，APP695swe序列參照http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/A33292.1設計合成，陰性對照組為空質(zhì)粒pEGFPN1質(zhì)粒。尼可地爾(SantaCruz)，格列本脲(SantaCruz)，LY294002(Sigma)，Lipofectamine 2000(Invitrogen)，SOD,GSH-PX,MDA試劑盒(南京建成)，β-actin-HRP鼠抗人單克隆抗體(上?？党?，Akt，p-Akt，GSK-3β，p-GSK-3β兔抗人多克隆抗體(Bioworld)，APP695兔抗人多克隆抗體(武漢博士德)，羊抗兔IgG-HRP(碧云天)，人Aβ1-42ELISA試劑盒(CUSABIO)，總RNA提取試劑盒(TIANGEN)，TIANScript RT kit(TIANGEN)，APP695上下游引物(上海生工)，β-actin上下游引物(上海生工)。

1.2 細胞培養(yǎng)和細胞轉(zhuǎn)染

SH-SY5Y細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/mL氨芐青霉素及100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2濃度下培養(yǎng)。細胞轉(zhuǎn)染按照lipofectimineTM2000說明書進行操作。

1.3 藥物處理和分組

取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，瞬時轉(zhuǎn)染APP695swe質(zhì)粒或空質(zhì)粒，分為APPsw質(zhì)粒組和空質(zhì)粒組(NC組)，轉(zhuǎn)染24 h后加藥物處理24 h。尼可地爾(1 mmol/L)，格列本脲(10 μmol/L)，LY294002(10 μmol/L)需提前1 h預處理，分組如下：APPsw質(zhì)粒組+尼可地爾，APPsw質(zhì)粒組+格列本脲，APPsw質(zhì)粒組+尼可地爾+格列本脲，APPsw質(zhì)粒組+LY294002，APPsw質(zhì)粒組+尼可地爾+LY294002，APPsw質(zhì)粒組(APPsw質(zhì)粒對照組)，空質(zhì)粒組(NC組)。

1.4 細胞內(nèi)丙二醛(MDA)，總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，還原型谷胱甘肽 (glutathione，GSH)的測定

藥物處理24 h后收集各組細胞，加入PBS用移液器打散至單細胞懸液，液氮反復凍融3次，使細胞破碎。12000 r/min離心10 min，上清為細胞勻漿液，BCA法蛋白定量。按照MDA,SOD,GSH檢測試劑盒說明書進行操作，酶標儀分別在532 nm，550 nm，420 nm波長處記錄吸光度值，根據(jù)公式計算MDA，GSH的含量，總SOD的活力值。

1.5 Realtime-PCR定量檢測APP695mRNA

用總RNA提取試劑盒提取樣本總RNA。用TIANScript RT Kit對所得RNA樣本反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應條件：70 ℃ 5 min，42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。β-actin為內(nèi)參基因，APP695和β-actin引物信息見表1。PCR反應條件：95 ℃ 10 min預變性，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s,進行 45個循環(huán)。熒光定量儀進行熒光定量分析。利用2-△△CT方法計算目的基因的相對表達量。

1.6 ELISA試劑盒檢測細胞外液Aβ1-42水平

藥物作用24 h后收集各組細胞培養(yǎng)液，按照Human Aβ1-42ELISA試劑盒說明書操作。加入待測樣本和標準品每孔100 μL(設重復孔), 覆上板貼，37 ℃溫育2 h；棄液，甩干，不洗滌；每孔加入生物素標記抗體工作液100 μL，覆上新板貼，37 ℃溫育1 h；棄液，甩干，洗板3次；每孔加入辣根過氧化物酶標記親和素抗體工作液100 μL，覆上新板貼，37 ℃溫育1 h；棄液，甩干，洗板3次；加入底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色30 min；加入終止溶液50 μL，終止反應；酶標儀在450 nm處記錄吸光度值，繪制曲線，計算Aβ1-42濃度。

表1 引物序列表

1.7 Western blot 檢測目的蛋白表達

藥物作用24 h后收集各組細胞，冰上裂解，加入NP-40裂解液(使用前加入PMSF，使之終濃度為1 mmol/L)，勻漿，冰上靜置30 min后，12000 r/min，4 ℃，離心15 min，收集總蛋白，BCA法蛋白定量。取樣品40 μg進行SDS-聚丙乙烯酰胺凝膠電泳，待轉(zhuǎn)至纖維素膜后，用含1% BSA的TTBS封閉1.5 h；一抗：兔抗人APP695(1∶1000)，p-AKT (1∶1000)，AKT (1∶1000)， GSK-3β(1∶1000)，p-GSK-3β (1∶1000)，鼠抗人β-actin-HRP(1∶10000) 4 ℃孵育過夜；用TTBS洗膜5 min×3次后，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔的二抗 (1∶5000)，37 ℃孵育45 min。TTBS洗膜5 min×6次，ECL法顯影，凝膠成像分析儀采集結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)以x±s表示，應用SPSS17.0軟件，兩均數(shù)比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 APPsw細胞APP695蛋白表達和Aβ分泌情況

Western blot結(jié)果顯示(圖1A)：APPsw質(zhì)粒組在轉(zhuǎn)染24 h，48 h和72 h后的APP695蛋白表達均明顯高于NC組(P<0.05)，且有明顯的時間依賴性(P<0.05)。ELISA結(jié)果顯示(圖1B)：APPsw質(zhì)粒組在轉(zhuǎn)染24 h，48 h和72 h后細胞外液Aβ1-42的水平均明顯高于NC組(P<0.05)，呈明顯時間依賴性(P<0.05)。

A:Western blot結(jié)果示APP695蛋白表達情況；B:ELISA結(jié)果示Aβ1-42表達情況。**與NC組相比，P<0.01圖1 瞬時轉(zhuǎn)染細胞APP695蛋白和細胞外液Aβ1-42的表達Fig 1 APP695 expression in transiently transfected cells and Aβ1-42 levels in the medium

2.2 尼可地爾對APPsw細胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)水平的影響

結(jié)果顯示(圖2)：與NC組相比，APPsw質(zhì)粒對照組脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA明顯升高，還原型谷胱甘肽GSH水平明顯降低，總SOD水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而尼可地爾處理組明顯降低MDA的生成，而增加總SOD，GSH的水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且KATP阻斷劑格列本脲可以阻斷上述保護效應(P>0.05)。

A:MDA; B:總SOD；C：GSH。*與APPsw質(zhì)粒對照組相比，P<0.05；**與APPsw質(zhì)粒對照組相比，P<0.01；##與NC組相比，P<0.01圖2 尼可地爾對APPsw細胞內(nèi)MDA、總SOD、GSH水平的影響Fig 2 Effects of nicorandil on the activity of MDA,total SOD,GSH in APPsw cells

2.3 尼可地爾對APPsw細胞APP695 mRNA表達的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示(圖3A)：APPsw質(zhì)粒對照組APP695 mRNA表達水平較NC組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；尼可地爾處理組明顯降低APP695 mRNA的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，尼可地爾+格列本脲處理組與APPsw質(zhì)粒對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 尼可地爾對APPsw細胞APP695蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示(圖3B)：APPsw質(zhì)粒對照組APP695蛋白的表達水平較NC組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；尼可地爾處理組明顯降低APP695蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，尼可地爾+格列本脲處理組與APPsw質(zhì)粒對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.5 尼可地爾對APPsw細胞Aβ分泌水平的影響

ELISA結(jié)果顯示(圖3C)：APPsw質(zhì)粒對照組細胞外液Aβ1-42的表達水平較NC組明顯升高(P<0.05)，尼可地爾處理組明顯降低細胞外液Aβ1-42的分泌水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，尼可地爾+格列本脲處理組與質(zhì)粒對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

A:Real-time PCR結(jié)果示APP695 mRNA表達情況；B：Western blot結(jié)果示APP695蛋白表達情況；C：ELISA結(jié)果示Aβ1-42表達情況。*與APPsw質(zhì)粒對照組相比，P<0.05，**與APPsw質(zhì)粒對照組相比，P<0.01，##與NC組相比，P<0.01圖3 尼可地爾對APPsw細胞APP代謝的影響Fig 3 Effects of nicorandil on APP processing in APPsw cells

2.6 尼可地爾對APPsw細胞PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的影響

Western blot結(jié)果顯示：尼可地爾可以明顯升高p-Akt的表達水平(P<0.05)，而總的Akt水平?jīng)]有變化(P>0.05)，尼可地爾+LY294002處理組與質(zhì)粒對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖4A)。尼可地爾可以明顯上調(diào)p-GSK-3β/GSK-3β的比值(P<0.05)，尼可地爾+LY294002處理組與質(zhì)粒對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖4B)。

A：p-Akt/Akt; B:p-GSK-3β/GSK-3β。**與APPsw質(zhì)粒對照組相比,P<0.01，##與NC組相比,P<0.01圖4 尼可地爾對APPsw細胞PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的影響Fig 4 Effects of nicorandil on PI3K/Akt/GSK-3β signaling pathway in APPsw cells

3 討 論

本研究應用APP695swe質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞，誘導SH-SY5Y細胞高表達APP695，并分泌高水平的Aβ40，Aβ42，來模擬AD的病理過程，作為較理想的AD細胞模型[5]。本研究發(fā)現(xiàn)尼可地爾處理可以明顯提高APPsw細胞內(nèi)總SOD活性，增加GSH水平，降低MDA水平，提示尼可地爾可以提高AD細胞模型的抗氧化能力，降低脂質(zhì)過氧化水平，減輕氧化應激性損傷。同時，尼可地爾可以降低APPsw細胞APP695 mRNA和APP695蛋白的表達，并減少Aβ1-42的生成，KATP阻斷劑格列本脲可以抵消這一作用。這提示激活KATP通道可以抑制APPmRNA和APP蛋白的表達，并能減少Aβ的生成。

早有研究報道[6]神經(jīng)元APP mRNA的表達和APP蛋白的合成是有神經(jīng)元電活動依賴性的，APP的合成和代謝是受神經(jīng)細胞去極化狀態(tài)，細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流所調(diào)控。神經(jīng)元被剝奪去極化，細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流減少，可以減少APP mRNA的表達和APP蛋白的合成。相反，神經(jīng)元去極化，細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流增加，可以使APP mRNA表達和APP蛋白合成增多。本研究結(jié)果可以用上述機制解釋：尼可地爾通過激活KATP通道，導致細胞內(nèi)K+外流增加，神經(jīng)元處于超極化狀態(tài)，從而減少細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流，均可減少APP695 mRNA和APP695蛋白的表達。APP695蛋白表達減少，Aβ的生成也隨之減少。

越來越多的證據(jù)表明增加的氧化應激反應發(fā)生在Aβ沉積之前或者伴隨Aβ沉積的過程中[7]。同樣觀點認為氧化應激既是Aβ產(chǎn)生的原因也是結(jié)果[8]。這提示氧化應激反應和Aβ的產(chǎn)生和聚集有著密不可分的作用。氧化應激反應可以增加β-分泌酶的表達并可增加β-分泌酶或γ-分泌酶的活性從而促進Aβ的生成[2,9-10]，而Aβ生成可以導致氧化應激反應增加和神經(jīng)細胞能量代謝障礙。實驗性的減少神經(jīng)元能量供應，或者增加氧化應激反應均可以使得Aβ生成明顯增多。相反，限制熱量供應，用抗氧化劑干預治療減少腦內(nèi)的氧化應激反應，則可減少AD小鼠腦內(nèi)Aβ的生成和聚集[11-13]。Liu等[14]證實mitoKATP開放劑二氮嗪治療3xTgAD小鼠可以明顯減少海馬和大腦皮層神經(jīng)元的Aβ的沉積。推測二氮嗪也許通過降低神經(jīng)元的興奮性，激活NMDA受體，改善線粒體能量代謝，減少氧化應激等途徑來減少Aβ的生成。

GSK-3β也是PI3K/Akt信號通路下游的一個關鍵靶點，GSK-3β與Aβ代謝密切相關。在GSK-3β的轉(zhuǎn)基因鼠研究中發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)Aβ生成明顯增加，這提示GSK-3β參與調(diào)節(jié)APP的代謝過程[15]。選擇性的GSK-3β抑制劑氯化鋰，可以減少GSK-3β的表達，抑制由GSK-3β引起的細胞凋亡，并減少Aβ40/42的生成[16]。體內(nèi)和體外實驗也證實，丙戊酸也同樣是GSK-3β抑制劑，可以通過抑制GSK-3β調(diào)節(jié)的γ-分泌酶水解APP，減少Aβ的生成。丙戊酸治療轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型，可以減少老年斑的形成，并可以改善AD小鼠記憶的缺陷[17]。本研究證實KATP開放劑尼可地爾可以激活PI3K/Akt信號通路，磷酸化GSK-3β從而使GSK-3β失活，也能很好的解釋尼可地爾減少AD細胞模型Aβ生成的機制。

綜上，尼可地爾很可能通過減少AD細胞模型的氧化應激反應，從而抑制β-或γ-分泌酶的水解，減少Aβ的生成；同時激活KATP可以使神經(jīng)元超極化，細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流減少，抑制APP695 mRNA和APP695蛋白的生成，最終也減少Aβ的生成。另外，激活PI3K/AKT通路使GSK-3β失活，也可最終導致Aβ生成的減少。