石磊，溫雯，李麗麗

（暨南大學食品安全與營養(yǎng)研究院，廣東廣州 510632）

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)是豬上呼吸道的一種常在菌。在一定條件下可引起嚴重的全身性疾病，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主要特征，該病原引起的疾病又稱為格氏病[1,2]。副豬嗜血桿菌有15個以上血清型[3]，血清1、5、10、12、13和14型是引發(fā)豬發(fā)病和死亡的強毒血清型；血清型2、4和15是可引起多發(fā)性漿膜炎的中等獨立型；血清型8屬于弱毒力型，血清型3、6、7、9和11為不引起臨床癥狀的無毒力型，我國以血清4和5型流行最多[4,5]。副豬嗜血桿菌病死亡率較高，病發(fā)后不易治愈，病死率高達50%[6]。該病傳染性強，且多與其他病原如豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒等混合感染，嚴重危害仔豬和青年豬的健康[7]。該病在我國已呈現(xiàn)出流行趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[8,9]。為此，建立早期快速檢測方法對副豬嗜血桿菌感染的預防和控制具有十分重要的意義。

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）提出至今已有20年時間，在此期間，PCR也已發(fā)展成為分子生物學領(lǐng)域的一項常規(guī)且關(guān)鍵的技術(shù)，并且極大地推動著生命科學各領(lǐng)域的發(fā)展[10]。目前，實驗室常用的檢測副豬嗜血桿菌的方法有細菌分離、血清學診斷技術(shù)[11]和分子生物學檢測技術(shù)（常規(guī)PCR[12]，實時熒光定量PCR[9]和環(huán)介導等溫擴增技術(shù)[13]等）。傳統(tǒng)的細菌分離和血清學檢測方法，存在耗時長、對檢測人員技術(shù)要求高、操作復雜以及敏感性差等諸多不足。PCR操作復雜，需對結(jié)果進行跑膠分析，且靈敏度較低；實時熒光PCR需使用昂貴的儀器設(shè)備并依賴標準曲線進行定量檢測，靈敏度仍存在一定的局限性；環(huán)介導等溫擴增技術(shù)由于引物間的非特異性擴增而易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是近十年來興起的第三代PCR技術(shù)[14,15]，其原理是將預混的PCR反應體系進行微滴化處理，形成幾萬至幾十萬個油包水的液化微滴中，保證每個微滴中含有一個或不含有核酸模板，經(jīng)過PCR擴增后，經(jīng)過熒光檢測每個微滴中的陽性微滴數(shù)和陰性微滴數(shù)，根據(jù)泊松分布原理即可計算出核酸模板的初始拷貝數(shù)[16]。與實時熒光 PCR相比，該方法采用直接計數(shù)目標分子數(shù)而不依賴任何校準物或外標，通過計數(shù)單個分子從而實現(xiàn)絕對定量[17]，故而具有精準、靈敏度超高和不易受PCR抑制物影響等優(yōu)點[18]。本研究旨在建立特異、靈敏、準確的HPS ddPCR的定量檢測方法，并與傳統(tǒng)qPCR進行比較，以期為HPS定量檢測提供新方法和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

HPS、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureu）由本實驗室保存；豬圓環(huán)病毒 2型（Porcine circovirus2，PCV2）疫苗、豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）滅活疫苗、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）購自廣東永順生物制藥有限公司。

1.1.2 主要試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒、病毒RNA/DNA小量提取試劑盒，購自廣州美基生物科技有限公司；AceQ qPCR Probe Master Mix，HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+g DNA wiper），購自南京諾維贊生物技術(shù)有限公司；ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)、Droplet Generation Oil for Probes，購自美國Bio-Rad公司。

1.1.3 主要設(shè)備

NanoDrop veu plus核酸蛋白分析儀，美國Thermo公司；ABI QuantStudio 6 Flex實時熒光定量PCR儀，美國 ABI公司；QX200微滴式數(shù)字 PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 探針和引物設(shè)計

根據(jù)HPS的OMP P2基因[19]保守區(qū)，使用Primer Premier 3.0設(shè)計合成特異性的real-time PCR引物探針，擴增片段為65 bp。所有引物、探針和質(zhì)粒均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。

表1 引物和探針序列Table 1 Primer and probe sequences

1.2.2 核酸的提取

按照Magen細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取 HPS、SS、APP、B.subtilis、E.coli、Salmonella、S.aureu的DNA；按照Magen病毒RNA/DNA小量提取試劑盒說明書提取PCV2的DNA，CSFV的RNA，并按照HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+g DNA wiper）的說明書將CSFV的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，均保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 qPCR反應體系和條件

采用設(shè)計好的引物和探針建立實時熒光定量PCR方法，qPCR總反應體系為20 μL，包括：AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μL；上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL；探針（10 μmol/L）0.2 μL；模板 1 μL；ddH2O 8 μL。擴增條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，共30個循環(huán)。將質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，檢測后用于繪制qPCR標準曲線。

1.2.4 ddPCR反應體系和條件優(yōu)化

ddPCR設(shè)置引物濃度400～900 nmol/L、探針濃度100～300 nmol/L、退火溫度 55～65 ℃，加入 ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) 10 μL，用水補足至20 μL，進行ddPCR擴增，擴增條件為：95 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，55～65 ℃ 1 min，40 個循環(huán)；98 ℃ 10 min；4 ℃ 60 min，升降溫速率 2 ℃/s。通過比較ddPCR的微滴生成數(shù)，微滴分布狀態(tài)、微滴熒光信號的強度等來確定優(yōu)化的結(jié)果。

1.2.5 特異性試驗

分別以HPS、PCV2、APP、SS、B.subtilis、E.coli、Salmonella、S.aureu的DNA以及CSFV的cDNA為模板，按照優(yōu)化后體系進行ddPCR檢測，驗證特異性。

1.2.6 重復性試驗

用已優(yōu)化好的 ddPCR方法進行重復性試驗。在20 μL的反應體系中加入1 μL稀釋好的模板，重復3次ddPCR 試驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 qPCR方法建立

將2.647×1010copies/μL的HPS質(zhì)粒進行10倍倍比稀釋，以此為模板作熒光定量PCR，得到熒光定量PCR擴增曲線，見圖1。結(jié)果表明：qPCR可檢測到2.647×102copies/μL的質(zhì)粒DNA，表明其靈敏性較好。

圖1 qPCR擴增HPS的曲線圖Fig.1 Amplification curve for Haemophilus parasuis by qPCR

2.2 反應條件的確定

確定最佳ddPCR引物探針濃度和擴增條件為：引物的濃度為 400 nmol/L，探針濃度為 200 nmol/L。ddPCR擴增條件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，55 ℃1 min，40 個循環(huán)；98 ℃ 10 min；4 ℃ 60 min，升降溫速率2 ℃/s。

2.3 液滴數(shù)字PCR擴增

當液滴數(shù)字 PCR擴增生成的微滴數(shù)目在 12000以上，表明微滴反應正常，可以對其進行后續(xù)的定量分析。由圖2a可知，經(jīng)過優(yōu)化的ddPCR反應體系對HPS的擴增結(jié)果較好，微滴散點圖中陰陽性微滴分界明顯。且由圖2b可知，陽性微滴和陰性微滴明顯分為兩簇，中間彌散的微滴數(shù)目很少，表明其擴增效果良好。本實驗中，HPS DNA 初始模板為 2.647×105copies/μL，隨著 DNA模板濃度降低，陽性微滴數(shù)量相應減少。由圖3可知，經(jīng)過優(yōu)化的反應條件適合進行HPS ddPCR的定量分析。

圖2 ddPCR擴增HPS的圖Fig.2 Amplification map of Haemophilus parasuis by ddPCR

圖3 HPS ddPCR擴增不同濃度模板的微滴散點圖Fig.3 ddPCR amplification of droplet scatter plots of different concentration templates

2.4 標準曲線和最低檢測限

ddPCR和qPCR的標準曲線分別見圖4和圖5。由圖可知，ddPCR的R2值為0.9955，斜率為-0.886，最低檢測限為 2.647 copies/μL。qPCR 的 R2值為0.9917，斜率為-1.406，最低檢測限為26.47 copies/μL。結(jié)果表明：ddPCR和qPCR的線性關(guān)系均較好，ddPCR最低檢測限低于qPCR。

圖4 ddPCR標準曲線Fig.4 ddPCR standard curve

圖5 qPCR標準曲線Fig.5 qPCR standard curve

2.5 特異性分析

圖6 ddPCR的特異性實驗Fig.6 Specificity test of ddPCR

采用 HPS、APP、SS、PCV2、B.subtilis、E.coli、Salmonella、S.aureu的DNA和CSFV的cDNA進行ddPCR特異性驗證。結(jié)果表明：除了HPS特異性擴增，其他檢測均為陰性，說明該方法特異性較好。

2.6 重復性分析

3次重復試驗得到 ddPCR的結(jié)果分別為 1854 copies/μL，1839 copies/μL，1953 copies/μL。變異系數(shù)為3.29%，說明該方法的重復性好、準確度高，檢測結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

2.7 臨床樣品的檢測

利用本實驗建立的ddPCR和qPCR方法分別對53份從豬場采集的樣品進行檢測。結(jié)果顯示：53份樣本中，qPCR檢出48份陰性，2份為陽性樣本（Ct值23～28），3份為可疑樣本（Ct值33～35）；ddPCR方法檢出的48份陰性樣本，5份陽性樣本。兩者檢測結(jié)果基本一致。結(jié)果表明：本實驗建立的 ddPCR方法和qPCR方法都能檢測相應結(jié)果，而ddPCR結(jié)果更加可靠和精確。

表2 臨床樣品檢測結(jié)果Table 2 Detection result of field samples

3 結(jié)論

3.1 傳統(tǒng)的數(shù)字PCR是進行絕對核酸量化的方法，它基于在有限稀釋的條件下將各個分析物分子分配成許多重復反應的絕對核酸定量方法，在大多數(shù)反應中產(chǎn)生1個或0個分子。終點PCR后，模板的起始濃度通過泊松分布統(tǒng)計分析確定陽性（含有擴增的靶標）和陰性（未擴增的靶標檢測的反應）。數(shù)字 PCR比qPCR具有許多潛在的優(yōu)勢。近來，該技術(shù)已經(jīng)商業(yè)化，將反應分為納米級大小的液滴。數(shù)千個液滴的快速微流體分析每個樣品使ddPCR適用于常規(guī)使用，并大大提高了系統(tǒng)的實際動態(tài)范圍（對每個液滴的多個目標分子進行泊松校正）[20]。

3.2 李富祥等[21]建立了基于TaqMan探針的副豬嗜血桿菌實時熒光定量 PCR檢測方法，其靈敏度為 692 copies/μL。Wei Xiaoyuan等[19]建立了副豬嗜血桿菌恒溫熒光PCR檢測技術(shù)，靈敏度可達到1000 copies/μL。本實驗建立的實時熒光定量 PCR檢測方法的最低檢測限為26.47 copies/μL，ddPCR的最低檢測限為2.647 copies/μL。

3.3 本試驗建立了一種定量檢測HPS的ddPCR方法，同時，利用ddPCR和qPCR這2種檢測方法對HPS進行測定，就靈敏性、重復性、特異性和臨床樣品檢測 4個方面進行了比較。在定量檢測相同稀釋度的HPS DNA時，ddPCR和qPCR的定量值呈線性正相關(guān)，且ddPCR方法的靈敏性優(yōu)于qPCR。在實際運用過程中，ddPCR方法的檢出率更加可靠。

3.4 數(shù)字液滴PCR也存在一些不足，例如儀器設(shè)備昂貴，每份樣品的檢測成本較實時熒光PCR高；微滴讀取速度慢導致檢測時間是實時熒光PCR的2～3倍；熒光通道少（目前只有FAM、HEX、VIC通道）；樣品需稀釋到一定濃度方可檢測等[22]。但是，隨著未來數(shù)字液滴PCR儀器成本的下降、技術(shù)的成熟，該技術(shù)具有廣闊的應用前景。

3.5 總之，本試驗建立的 ddPCR方法靈敏度高、重復性好，特異性強，可進行HPS低含量樣品檢測和定量檢測。為HPS的檢測、流行病學調(diào)查、質(zhì)控等提供了一個切實可行的解決方案。