李德海，朱曉冉，王路，王振宇，趙楠楠，龔金華

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）（2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150090）（3.香港教育大學(xué)博文及社會(huì)科學(xué)學(xué)院科學(xué)與環(huán)境學(xué)系，香港 999077）

人體正常生理代謝，體內(nèi)自由基處于生成和消除的動(dòng)態(tài)平衡，如果自由基生成過(guò)多或者清除過(guò)少，蓄積的自由基會(huì)損害機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪和DNA等生物大分子，造成機(jī)體氧化損傷，增加血管粥樣硬化、高血壓、糖尿病、腫瘤、帕金森癥、老年癡呆癥等疾病的發(fā)病率[1]。天然植物活性抗氧化劑由于低毒、來(lái)源廣泛、且可直接作用于自由基或通過(guò)破壞自由基鏈的反應(yīng)，從而有效地抑制或緩解這些疾病的發(fā)病率等優(yōu)點(diǎn)正受到研究者的極大關(guān)注。

龍牙楤木（Aralia elata），別稱遼東楤木，俗稱刺老鴉、虎陽(yáng)刺、東北野香椿等，是五加科楤木屬的多年生木本植物，主要分布于亞洲、北美洲，在我國(guó)主要分布于黑龍江東北部、吉林中部以及遼寧東北部等地區(qū)[2]。龍牙楤木醫(yī)藥價(jià)值高，其根、根皮及葉可入藥，味苦、辛，性平，具有活血化瘀、補(bǔ)氣安神、強(qiáng)精滋腎、除濕止痛之功效，可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)衰弱、肝炎、糖尿病及腫瘤等[3]。龍牙楤木營(yíng)養(yǎng)豐富，含有糖、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及皂苷、多糖、多酚等多種活性成分，有“山野菜之王”的美譽(yù)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究及臨床試驗(yàn)證明，皂苷類化合物是龍牙楤木的主要功能性組分。我國(guó)學(xué)者對(duì)龍牙楤木及龍牙楤木皂苷的研究報(bào)道多為栽培研究和初級(jí)加工工藝學(xué)[4]、藥理作用和臨床應(yīng)用[5]、提取工藝[6,7]等，對(duì)龍牙楤木的高值化深加工研究較少。目前龍牙楤木皂苷提取多采用熱回流、微波、超聲波、閃式提取法等單一輔助方法，單一方法存在著用時(shí)長(zhǎng)、能耗高、提取不完全等缺點(diǎn)[8]，因此本試驗(yàn)采用鹽析輔助酶法提取龍牙楤木皂苷。鹽析效應(yīng)可通過(guò)親和力、氫鍵、離子的靜電等作用，與水溶液中某種組分發(fā)生優(yōu)先溶劑化反應(yīng)，形成難揮發(fā)的溶劑化化合物，減少了該組分與另一組分之間的吸引作用，從而強(qiáng)化目標(biāo)有機(jī)物的分離效果[9]，而酶法可使提取液發(fā)生酶解反應(yīng)，破壞組織細(xì)胞、釋放內(nèi)容物，從而提高提取得率[10]。本試驗(yàn)以龍牙楤木為試驗(yàn)原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了鹽析輔助酶法提取龍牙楤木皂苷的工藝，并經(jīng)大孔樹脂純化后，將鹽析輔助酶法制備的龍牙楤木皂苷與溶劑提取法制備的龍牙楤木皂苷的抗氧化活性進(jìn)行對(duì)比分析，為龍牙楤木這一藥食同源性木本植物更好的開發(fā)利用、更全面地發(fā)揮其藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍牙楤木采自遼寧丹東；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品、Tris、DPPH，美國(guó)Sigma公司；D101大孔樹脂、纖維素酶，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉、氯化鎂、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸氫二鈉、香草醛、冰醋酸、Vc、無(wú)水乙醇等其它試劑均為分析純，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RT-6000酶標(biāo)儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；KQ-700GVDV型三頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器，江蘇省昆山市超聲波儀器有限公司；LGJ-25C 型冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；EL20型pH計(jì)，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料預(yù)處理

龍牙楤木新鮮樣品40 ℃烘干粉碎過(guò)60目篩，按1：20料液比加入石油醚脫脂脫色，50 ℃烘箱揮干溶劑后于4 ℃保藏備用。

1.3.2 鹽 析輔助酶法提取龍牙楤木皂苷的單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理的龍牙楤木，按1：30 g/mL加入蒸餾水后，添加一定量的纖維素酶，調(diào)節(jié)酶解溫度、酶解pH，酶解一定時(shí)間后離心定容按1.3.5測(cè)定提取液中皂苷含量，殘?jiān)?：25 g/mL加入含一定量無(wú)機(jī)鹽的80%的乙醇溶液復(fù)提，離心定容按1.3.5測(cè)定提取液中皂苷含量?？疾炖w維素酶添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、酶解pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、酶解溫度（45、50、55、60、65、70 ℃）、酶解時(shí)間（30、60、90、120、150、180 min）、鹽的種類（氯化鈉、氯化鎂、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸氫二鈉）、最優(yōu)鹽的添加量（4%、6%、8%、10%、12%）對(duì)龍牙楤木皂苷提取得率的影響。

1.3.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)聯(lián)用 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)確定對(duì)龍牙楤木皂苷提取得率影響顯著的因素，采用中心組合Box-Benhnken Design (BBD)設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化鹽析輔助酶法提取龍牙楤木皂苷工藝[11]。

1.3.4 龍牙楤木皂苷的純化

將龍牙楤木皂苷粗提物用處理后的D101大孔樹脂純化，上樣質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，上樣量0.6 BV，梯度洗脫，收集60%組分，50 ℃下減壓濃縮，水飽和正丁醇萃取后凍干于-20 ℃冰箱中備用[12]。

1.3.5 龍牙楤木皂苷得率的測(cè)定

采用香草醛-冰醋酸-紫外分光光度法[13]。準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品4 mg，加乙醇溶解定容至50 mL，制成濃度為0.08 mg/mL的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于具塞試管中，揮干溶劑，先加入新制5%香草醛-冰乙酸0.2 mL，再加入0.8 mL高氯酸溶液，在70 ℃水浴中加熱15 min，取出，流水冷卻，使之反應(yīng)完全。加入4 mL乙酸乙酯，搖勻，隨行試劑作空白，在560 nm處測(cè)定吸光度。以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，溶液吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=6.9129x-0.00788，R2=0.9993。精密吸取樣品液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法測(cè)定皂苷含量，三次平行，取平均值，計(jì)算龍牙楤木皂苷得率，計(jì)算公式如下所示：

式中：C為提取液中皂苷濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)，V為提取液體積，mL；M為原料質(zhì)量，g。

1.3.6 龍牙楤木皂苷抗氧化活性的測(cè)定1.3.6.1 DPPH自由基（DPPH·）清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14]的方法，在2 mL樣液中加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH·溶液，混勻室溫下避光靜置20 min后，在517 nm處測(cè)定吸光值，DPPH·清除率按下列公式計(jì)算。

式中：A0為樣品空白組吸光值；A1為樣品組吸光值；A2為對(duì)照組吸光值。

1.3.6.2 超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力的測(cè)定

參照Qi H等[15]的方法并作一定調(diào)整，試管中加入1 mL樣液和3 mL pH 8.2的50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，混勻后25 ℃水浴平衡8 min，加入35 mmol/L的鄰苯三酚200 μL，兩者混合均勻，加入8 mmol/L鹽酸1 mL終止反應(yīng)，325 nm處測(cè)定吸光值。

式中：A0為樣品空白組吸光值；A1為樣品組吸光值；A2為對(duì)照組吸光值。

1.3.6.3 總還原力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[16]的方法，并作出改動(dòng)。樣液1.00 mL加入2.50 mL 1%鐵氰化鉀溶液，在50 ℃下反應(yīng)20 min，速冷后向溶液加入 2.50 mL 10%的三氯乙酸溶液，5 min后，依次加入5 mL去離子水、0.50 mL 0.1%三氯化鐵溶液，反應(yīng)30 min，在700 nm處測(cè)定吸光值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 21.0與Origin 8.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s,n=3）表示，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶解pH 對(duì)龍牙楤木皂苷得率的影響

由圖1可知，酶解pH在4.0～5.5時(shí)，隨著提取液pH的升高，龍牙楤木皂苷得率不斷提高，在酶解pH 5.5時(shí)達(dá)到最大值，為3.89%。當(dāng)酶解pH超過(guò)5.5，皂苷提取得率急劇下降，在酶解pH 6.5時(shí)皂苷得率下降22.37%，這可能是因?yàn)槊附鈖H不適宜既破壞酶的構(gòu)想，也影響底物、輔酶及酶活性部位相關(guān)基因的解離程度，從而影響酶分子對(duì)底物分子的結(jié)合和催化，因此只有特定的pH值條件下，解離狀態(tài)最適宜酶、底物和輔酶的相互結(jié)合，從而使酶反應(yīng)速度達(dá)到最大值[17]。

圖1 酶解pH對(duì)龍牙楤木皂苷得率的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis pH on the yield of saponin

2.1.2 酶 解時(shí)間對(duì)龍牙楤木皂苷得率的影響

由圖2可知，在提取的前90 min，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，龍牙楤木皂苷提取得率逐漸上升，峰值為3.75%；但在90 min后提取得率呈略微下降或趨于不變。這種變化趨勢(shì)可能是因?yàn)槊赴l(fā)揮作用需要一定的時(shí)間，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)給予酶與底物充分反應(yīng)的機(jī)會(huì)，同時(shí)也表明酶促提取時(shí)間越長(zhǎng)不一定越適合酶的活力發(fā)揮。因此，最佳的龍牙楤木皂苷提取酶解時(shí)間為90 min。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)龍牙楤木皂苷得率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of saponin

2.1.3 酶 解溫度對(duì)龍牙楤木皂苷得率的影響

溫度顯著影響酶的活性，每一種酶都有最適宜的酶解溫度。由圖3可知，低于60 ℃時(shí)，隨著溫度的升高龍牙楤木皂苷提取得率不斷升高，這是因?yàn)樵谶m宜溫度條件下，反應(yīng)物的能量增加，單位時(shí)間內(nèi)各組分之間有效接觸的次數(shù)增多，反應(yīng)速度加快，但當(dāng)溫度超過(guò) 60 ℃，提取得率開始下降并且在酶解溫度超過(guò) 65 ℃后急劇下降，這可能是因?yàn)槊附鉁囟冗^(guò)高，酶分子吸收過(guò)多能量，導(dǎo)致酶分子結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵斷裂，致使酶蛋白變性失活，因此降低了提取得率[18]。

圖3 酶解溫度對(duì)龍牙楤木皂苷得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of saponin

2.1.4 酶添加量對(duì)龍牙楤木皂苷得率的影響

由圖4可知，龍牙楤木皂苷的提取得率與纖維素酶添加量呈現(xiàn)正相關(guān)，隨著酶添加量的增加，皂苷提取得率快速增加，當(dāng)酶添加量占龍牙楤木粉末質(zhì)量的1.5%時(shí)，皂苷提取得率達(dá)到最大值，3.84%，這是由于酶添加量增加，促進(jìn)了酶與細(xì)胞壁的接觸，加速破壁作用，從而加快皂苷類化合物的溶出。當(dāng)酶添加量超過(guò)1.5%后，皂苷得率不再增加，其原因可能是由于底物完全被酶分子所飽和，繼續(xù)增加的酶分子失去了與底物結(jié)合的機(jī)會(huì)，造成酶解反應(yīng)速度不再變化[19]。

圖4 酶添加量對(duì)龍牙楤木皂苷得率的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on the yield of saponin

2.1.5 鹽 的種類對(duì)龍牙楤木皂苷得率的影響

不同鹽對(duì)同一種有機(jī)溶劑的作用各不相同，這是各種分子和離子間力相互作用的結(jié)果，本試驗(yàn)考察氯化鈉、氯化鎂、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸氫二鈉對(duì)龍牙楤木皂苷提取得率的影響。由圖5可知，不同種類的無(wú)機(jī)鹽對(duì)皂苷提取得率的影響不同，差異性顯著，其中添加磷酸氫二鈉皂苷提取得率最高，為 3.85%，添加硫酸鎂皂苷提取得率最低，為3.43%，但均高于不添加無(wú)機(jī)鹽的提取得率。添加無(wú)機(jī)鹽能提高皂苷提取得率可能是因?yàn)闈舛炔罴铀偌?xì)胞壁膜的破碎，釋放內(nèi)容物，及鹽可與溶液中某種組分發(fā)生優(yōu)先溶劑化反應(yīng)，形成難揮發(fā)的化合物，減少了組分之間的吸引作用[20]，從而有利于目標(biāo)組分的分離。

圖5 鹽的種類對(duì)龍牙楤木皂苷得率的影響Fig.5 Effect of the type of salt on the yield of saponin

2.1.6 鹽 添加量對(duì)龍牙楤木皂苷得率的影響

由圖6可知，當(dāng)磷酸氫二鈉含量由4%上升至8%時(shí)，龍牙楤木皂苷得率隨之上升，磷酸氫二鈉含量8%時(shí)，皂苷得率最高為 3.89%，比磷酸氫二鈉含量 4%的提取得率高出25.08%，繼續(xù)升高磷酸氫二鈉含量，皂苷提取得率下降。Rivera[21]等采用磁場(chǎng)加熱蒸餾制備葛縷子精油，發(fā)現(xiàn)提取液中氯化鈉濃度較高時(shí)精油產(chǎn)率降低，定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨氯化鈉濃度升高，精油中檸檬烯含量降低，葛縷酮的含量升高，據(jù)此說(shuō)明鹽的濃度越高不一定越適合提高提取得率，因此龍牙楤木皂苷最佳得率提取為磷酸氫二鈉含量8%。

圖6 鹽添加量對(duì)龍牙楤木皂苷得率的影響Fig.6 Effect of salt dosage on the yield of saponin

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

采用Plackett-Burman試驗(yàn)對(duì)影響因素進(jìn)行顯著性分析，各因素對(duì)龍牙楤木皂苷得率影響強(qiáng)弱順序?yàn)椋好附?pH＞酶解溫度＞鹽添加量＞酶解時(shí)間＞酶添加量，因此試驗(yàn)選取酶解pH、酶解溫度、鹽添加量三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以龍牙楤木皂苷得率為考察指標(biāo)，利用Box-Behnken建立三因素三水平數(shù)學(xué)模型。

表1 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Experimental factors and levels design

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of Box-Behnken experimental design

采用Design-Except 8.05軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得的響應(yīng)值皂苷得率（Y）對(duì)酶解pH（A）、酶解溫度（B）、鹽添加量（C）真實(shí)值的回歸模型方程為：

由表3可知模型的p值小于0.01，表明該響應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著水平。失擬項(xiàng)不顯著（p=0.1584），說(shuō)明該模型對(duì)本試驗(yàn)擬合程度較好?；貧w方程的決定系數(shù)R2為0.9583，說(shuō)明該該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的適配度達(dá)到95.83%，具有較高的擬合度，僅有總變異4.17%不能用該模型解釋，因此可以利用該模型預(yù)測(cè)上述提取條件對(duì)皂苷得率的影響。調(diào)整決定系數(shù)為0.9047，說(shuō)明該模型能夠解釋90.47%的響應(yīng)值變化，因而模型的擬合度良好，可對(duì)鹽析輔助酶法的不同提取條件下龍牙楤木皂苷提取得率進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table.3 Significance test of regression equation coefficients

圖7 各因素交互作用影響皂苷提取得率的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface and contour plots showing the effect of interactions among various factors on the yield of saponins

根據(jù)龍牙楤木皂苷回歸模型做出相應(yīng)的三維球面圖，如圖7所示。響應(yīng)面曲面的坡度可反映該因素對(duì)龍牙楤木皂苷得率影響的強(qiáng)弱程度。等高線的形狀表明因素之間的交互影響是否顯著。圓形等高線表明兩因素之間的交互影響不顯著；橢圓形等高線表明兩因素之間的交互影響顯著[22]。如圖7a、b所示，響應(yīng)面顯示坡度較陡，等高線呈馬鞍形或橢圓形，表明酶解pH和酶解溫度、酶解pH和鹽的添加量之間交互作用顯著，對(duì)龍牙楤木皂苷的提取得率影響較大，這與方差分析結(jié)果一致。酶解溫度和鹽添加量交互作用不顯著，方差分析結(jié)果p值為0.1075，表現(xiàn)為曲線平滑，等高線為圓形。

2.3 模型的驗(yàn)證

試驗(yàn)課題組采用響應(yīng)面優(yōu)化了鹽析輔助酶、溶劑提取法提取龍牙楤木皂苷的工藝，鹽析輔助酶法最佳提取工藝為：酶解pH 5.405、酶解溫度61.3 ℃、磷酸氫二鈉添加量7.74%、酶解時(shí)間90 min、纖維素酶添加量 1.5%。溶劑提取法最佳提取工藝為：料液比1：29.85 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù) 81.65%、提取溫度63.95 ℃、提取時(shí)間120 min，考慮到實(shí)際操作可能性，對(duì)兩種提取方法最佳提取條件略作調(diào)整進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果為鹽析輔助酶法提取皂苷得率為3.90%±0.154%，溶劑提取法的得率為3.64%±0.070%，差異性顯著，表明鹽析輔助酶法可提高龍牙楤木皂苷的提取得率。

2.4 龍牙楤木皂苷抗氧化活性分析

DPPH自由基性質(zhì)穩(wěn)定，通常當(dāng)做自由基清除能力的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。超氧陰離子自由基本身有毒性，且可生成羥基自由基，使機(jī)體處于過(guò)氧損傷狀態(tài)[23]?；钚晕镔|(zhì)的抗氧化能力與還原力具有一定的相關(guān)性，因此本試驗(yàn)選定清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基能力和總還原能力評(píng)價(jià)龍牙楤木皂苷的抗氧化能力，結(jié)果如圖8所示。

由圖8可知，兩種提取方法制備的龍牙楤木皂苷抗氧化能力隨著質(zhì)量濃度的升高而加強(qiáng)，呈現(xiàn)顯著的劑量依賴關(guān)系。在皂苷質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí)，鹽析輔助酶、溶劑提取法制備的龍牙楤木皂苷對(duì) DPPH自由基的清除率依次為81.03%、77.56%，是初始濃度的2.94倍、3.47倍，抗氧化能力均低于同濃度的Vc。龍牙楤木皂苷能清除DPPH自由基可能是因?yàn)樵碥蔗尫艢潆x子，配對(duì)孤對(duì)電子，使DPPH自由基生成穩(wěn)定的化合物[24]。

在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著皂苷質(zhì)量濃度的升高，龍牙楤木皂苷對(duì)超氧陰離子自由基的清除率逐漸增大。質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)，鹽析輔助酶法、溶劑提取法制備的龍牙楤木皂苷對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到最大值，依次為88.28%、82.35%，提高了3.42倍、5.35倍，抗氧化能力低于Vc。鄰苯三酚堿性條件下自氧化生成有色中間產(chǎn)物，并釋放超氧陰離子自由基[25]。龍牙楤木皂苷清除超氧陰離子自由基可能是因?yàn)槠浠钚詺渑c超氧陰離子自由基結(jié)合生成水，中斷中間有色產(chǎn)物的積累。

總還原能力的強(qiáng)弱依次為Vc、鹽析輔助酶法、溶劑提取法。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，鹽析輔助酶法制備的龍牙楤木皂苷總還原力OD值由0.097上升至0.625、溶劑提取法由0.10上升至0.599。龍牙楤木皂苷具有還原能力可能是因?yàn)樵碥沾蚱谱杂苫湥瑢?dǎo)致Fe3+得到電子還原成為Fe2+。鹽析輔助酶、溶劑提取制備的龍牙楤木皂苷清除 DPPH自由基 IC50依次為 0.342 mg/mL、0.365 mg/mL，清除超氧陰離子自由基的IC50依次為1.220 mg/mL、1.432 mg/mL總還原能力強(qiáng)弱依次為鹽析輔助酶、溶劑提取，方差分析差異不顯著，表明鹽析輔助酶法提取龍牙楤木皂苷不會(huì)破壞皂苷類化合物的抗氧化活性。

圖8 龍牙楤木皂苷抗氧化能力Fig.8 The antioxidant capacity of saponins from aralia elata

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定了鹽析輔助酶法提取龍牙楤木皂苷的最佳工藝條件為酶解 pH 5.405、酶解溫度61.3 ℃、磷酸氫二鈉添加量7.74%、酶解時(shí)間90 min、纖維素酶添加量1.5%，在此條件下龍牙楤木皂苷得率3.97%。以Vc為對(duì)照，對(duì)比鹽析輔助酶法和溶劑提取法制備的龍牙楤木皂苷抗氧化活性可知，兩種提取方法與Vc對(duì)DPPH自由基的清除能力從大到?。篤c＞鹽析輔助酶法＞溶劑提取法，單因素方差分析結(jié)果顯示，兩種提取方法制備的樣品對(duì)DPPH自由基的清除效果差異顯著（p＜0.05）；對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力從大到?。篤c＞鹽析輔助酶法＞溶劑提取法，差異不顯著（p＞0.05）?？傔€原能力的強(qiáng)弱依次為Vc、鹽析輔助酶法、溶劑提取法，差異不顯著（p＞0.05）。可以看出，鹽析輔助酶法能夠顯著提高龍牙楤木皂苷得率（p＜0.05），并很好地保留了皂苷的抗氧化活性。因此本試驗(yàn)對(duì)龍牙楤木皂苷高效制備及明確其抗氧化功能有積極指導(dǎo)作用。