王云香，劉瑤，李雪松.，張慧君，左進(jìn)華，高麗樸，史君彥，王清

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院 蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)部蔬菜產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097）（2.淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽淮北 235000）

果蔬從采后包裝、運(yùn)輸、貯藏最后到消費(fèi)的整個(gè)過(guò)程中，會(huì)受到跌落、擠壓、震動(dòng)、碰撞等各種機(jī)械損傷[1,2]，機(jī)械損傷能導(dǎo)致果蔬生理代謝紊亂，引發(fā)一系列不利于貯藏的生理生化反應(yīng)。同時(shí)，機(jī)械損傷降低了果蔬外觀質(zhì)量和食用品質(zhì)，破壞果蔬組織細(xì)胞膜系統(tǒng)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致有關(guān)代謝物質(zhì)改變，發(fā)生酶促褐變等一系列異常生理生化變化，加速果蔬采后衰老進(jìn)程。損傷部位給微生物侵染提供了機(jī)會(huì)，使腐爛速率加快，造成品質(zhì)下降，貯藏期變短，造成一系列的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重的影響了經(jīng)濟(jì)效益[3,4]。采后果蔬受機(jī)械傷害的生理生化反應(yīng)主要包括乙烯生成、呼吸速率變化、膜脂過(guò)氧化、愈傷組織和次生物質(zhì)生成五個(gè)方面[5]。目前，人們對(duì)果實(shí)機(jī)械傷的研究主要集中于明確某一種機(jī)械傷給果實(shí)所造成的影響，并從2個(gè)方面探索解決方法：一是通過(guò)研究果實(shí)力學(xué)特性和規(guī)律，尋求減少果實(shí)受力的技術(shù)措施，以預(yù)防和減輕果實(shí)機(jī)械損傷；二是通過(guò)研究采后技術(shù)，調(diào)節(jié)果實(shí)生理特性，降低果實(shí)對(duì)機(jī)械傷的敏感性，以減輕機(jī)械傷給果實(shí)帶來(lái)的影響[6]。

1-MCP（1-methylcyclopropane，甲基環(huán)丙烯）是一種有效的乙烯受體抑制劑，有無(wú)生理毒性、無(wú)異味、穩(wěn)定性好、易于合成、使用濃度低、殘留氣味較小等優(yōu)點(diǎn)[7]。1-MCP與果蔬組織中的乙烯受體結(jié)合，阻斷乙烯與受體的結(jié)合，阻止或延緩乙烯的生理作用。在國(guó)內(nèi)，關(guān)于1-MCP對(duì)青圓椒采后機(jī)械傷的生理生化影響十分少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)主要研究1-MCP處理對(duì)采后青圓椒機(jī)械損傷后貯藏過(guò)程中一些生理生化指標(biāo)的影響，為 1-MCP在青圓椒貯藏運(yùn)銷保鮮的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用品種為京甜3號(hào)，采收當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，挑選大小均一，無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷、成熟度均勻的新鮮的青圓椒為試材。

1-MCP購(gòu)自上海鮮達(dá)生物科技有限公司，氣體純度92%。

保鮮膜：0.03 mm PE膜，由北京華盾雪花有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)處理

1.2.1 青圓椒預(yù)處理

挑選好的青圓椒采用高處墜落法模擬機(jī)械損傷，從距地面1 m的高處墜落，然后以不同濃度1-MCP（8 μL/L、10 μL/L）熏蒸 24 h。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) 10 μL/L 1-MCP處理效果最佳。根據(jù)此條件，正式實(shí)驗(yàn)的青圓椒隨機(jī)均分為2組，A組和B組。A組和B組均從距地面1 m的高處墜落，在室溫下（T=20 ℃，H=80%～85%）對(duì)A組青圓椒用10 μL/L 1-MCP熏蒸24 h。將處理后的A組和未處理的B組青圓椒裝入0.03 mm厚度的PE保鮮袋中，每袋裝5個(gè)青圓椒，折口包裝后于20 ℃下貯藏，每隔3 d測(cè)定相關(guān)生理生化相關(guān)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，所測(cè)數(shù)據(jù)取平均值。

1.2.2 主要儀器設(shè)備

UV-1800分光光度計(jì)，島津；D-3752冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific)；XMTD-6000型數(shù)顯恒溫水浴鍋，余姚金電儀表有限公司；DYY-6D型電泳儀，北京市六一儀器廠；德國(guó)IKA A11 basic分析研磨機(jī)，上海川翔生物科技有限公司；PCR儀，德國(guó)耶拿分析儀器股份公司；Nano Drop 2000微量分光光度計(jì)，北京科譽(yù)興業(yè)科技發(fā)展有限公司；凝膠成像儀，上海創(chuàng)萌生物科技有限公司；Light Cycler 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)。

1.2.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

MDA含量的測(cè)定采用Jin[8]等的方法。樣品組織用 10 mL 100 g/L三氯乙酸(TCA)溶液勻漿，4 ℃13000 r/min下離心30 min，在10 mL 試管中一次加入2 mL上清液、2 mL 0.67% TBA混勻，于沸水裕中20 min，冷卻，然后測(cè)定450 nm、560 nm和600 nm處吸光值。

葉綠素含量測(cè)定采用Deng[9]等的方法稍作修改。青圓椒組織用4 ℃的丙酮：乙醇(2：1)溶液勻漿，在通風(fēng)櫥內(nèi)避光過(guò)濾至50 mL棕色容量瓶中，至青圓椒勻漿組織變白，然后定容至刻度，測(cè)定66 nm和645 nm處吸光值。

VC含量測(cè)定采用鉬酸銨比色法[10]。樣品組織用10 mL 0.05 mol/L草酸-EDTA溶液勻漿，于 4 ℃13000 r/min下離心30 min，在10 mL試管中一次加入2 mL上清液、3 mL草酸-EDTA、0.5 mL偏磷酸-乙酸、1 mL 5% H2SO2和2 mL 5%鉬酸銨混合，于80 ℃水浴鍋中水浴10 min，取出冷卻至室溫，用蒸餾水定容至1 mL，然后測(cè)760 nm處的吸光值。

POD（過(guò)氧化物酶活性）測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[11]反應(yīng)體系為0.3% H2O21 mL、0.2%愈創(chuàng)木酚0.9 mL、pH 7.8 PBS 1 mL和酶液0.1 mL，測(cè)定470 nm處吸光值。

CAT活性測(cè)定采用 Azevedo[12]等的方法稍作修改，稱取1 g樣品于研缽中，加入8 mL提取緩沖液，在冰浴條件下研磨成勻漿，然后轉(zhuǎn)入離心管中于4 ℃、13000 r/min離心30 min，收集上清液即為酶提取液，低溫保存?zhèn)溆谩７磻?yīng)體系包括0.3% H2O21 mL、pH 7.8 PBS 1.9 mL和酶液0.1 mL，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定240 nm處吸光值。以每克果蔬樣品（鮮重）每分鐘吸光度變化值增加0.01為1個(gè)CAT活性單位。

APX（抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性)測(cè)定采用Wang[13]等方法，樣品組織用8 mL 0.1 mol/L pH 7.5的PBS緩沖液提取，4 ℃ 13000 r/min下離心30 min，上清液為粗酶提取液，反應(yīng)體系包含反應(yīng)緩沖液 2.6 mL、酶液0.1 mL和2 mmol/L H2O20.3 mL，測(cè)定290 nm處的吸光值。

Real-time Q-PCR分析抗氧化酶基因表達(dá)：RNA的提取方法參照 Invitrogen生物公司提供的說(shuō)明書(shū)，將冷凍樣品至于液氮中，取0.1 g的粉末與1 mL Trizol試劑混合，提取總RNA。用Super Script TM Ш反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR的檢測(cè)，采用96孔板點(diǎn)樣，使用Light Cycler 480 Ⅱ儀器測(cè)定，用2-△△Ct法相對(duì)定量。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，以UBI-3作為內(nèi)參基因，POD、CAT、APX為目的基因，由上海生物工程有限公司完成引物的合成。引物設(shè)計(jì)序列見(jiàn)表1。

表1 內(nèi)參和目的基因表達(dá)的引物序列Table 1 The sheet of primer sequence of endoginseng and target gene expression

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)利用EXCEL 2010統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用Origin 9.0作圖，利用IBM SPSS Statistics 22軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（p＜0.05為差異顯著；p＜0.01為差異極顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 1-MCP處理對(duì)機(jī)械損傷青圓椒葉綠素含量的影響

顏色是青椒果實(shí)外觀品質(zhì)的重要指標(biāo)，隨著青椒的衰老果實(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)紅。葉綠素是構(gòu)成青椒綠色的主要成分[14]，青圓椒在包裝、包裝、貯藏過(guò)程中極易受到機(jī)械損傷，影響食用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。由圖1可知，青圓椒果實(shí)的葉綠素含量隨貯藏時(shí)間的增加呈明顯下降的趨勢(shì)。第12 d時(shí)，對(duì)照組和1-MCP處理組果實(shí)的葉綠素含量分別為0.49 mg/g和0.52 mg/g，1-MCP處理組的葉綠素含量顯著高于對(duì)照組的葉綠素含量（p＜0.05）。對(duì)照組和1-MCP處理組的葉綠素含量在貯藏期間持續(xù)下降，0～3 d快速下降，但1-MCP處理組比對(duì)照組下降緩慢。1-MCP處理組的葉綠素含量始終高于對(duì)照組的葉綠素含量，說(shuō)明1-MCP處理對(duì)于青圓椒機(jī)械損傷后葉綠素的降解有一定的抑制作用，可以延緩葉綠素的降解。

圖1 1-MCP處理對(duì)青圓椒機(jī)械傷后葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of 1-MCP treatment on chlorophyll content of green bell pepper

2.2 1-MCP處理對(duì)機(jī)械損傷青圓椒維生素 C含量的影響

維生素C是廣泛存在于水果蔬菜中的重要維生素之一，維生素C的含量可作為果蔬抗衰老的重要指標(biāo)[15]。青圓椒含有較高的維生素C，機(jī)械損傷會(huì)使青圓椒中的維生素C快速降解。由圖2可知，在貯藏初期，青圓椒的維生素C含量下降速率較緩慢，從第9 d開(kāi)始，青圓椒維生素C含量快速下降。貯藏期間，對(duì)照組和1-MCP處理組的維生素C含量呈現(xiàn)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但1-MCP處理組維生素C含量始終高于對(duì)照組，貯藏的第12 d和15 d，對(duì)照組和1-MCP處理組的維生素C含量分別為1.58 mg/g、1.74 mg/g和1.47 mg/g、1.62 mg/g，差異顯著（p＜0.05）。在貯藏的18 d和21 d，對(duì)照組和1-MCP處理組維生素C含量分別降低至1.34 mg/g、1.56 mg/g和1.47 mg/g，差異極顯著（p＜0.01）。結(jié)果表明，在整個(gè)貯藏過(guò)程中，1-MCP對(duì)抑制機(jī)械損傷青圓椒維生素C的降低有十分明顯的效果，對(duì)受到機(jī)械損傷的青圓椒進(jìn)行1-MCP處理有助于減少維生素C含量的降低。

圖2 1-MCP處理對(duì)青圓椒機(jī)械傷后維生素C含量的影響Fig.2 Effect of 1-MCP treatment on VC content of green bell pepper

2.3 1-MCP處理對(duì)機(jī)械損傷青圓椒MDA含量的影響

圖3 1-MCP處理對(duì)青圓椒機(jī)械傷后MDA含量的影響Fig.3 Effect of 1-MCP treatment on MDA content of green bell pepper

MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，其含量是評(píng)判細(xì)胞膜損傷程度的重要標(biāo)志之一[16]。由圖3可知，在貯藏期間，對(duì)照組和1-MCP處理組的MDA含量先逐漸升高，并在第6 d達(dá)到峰值，分別為0.087 nmol/L和0.083 nmol/L。在第6 d后，對(duì)照組和1-MCP處理組的 MDA含量又緩慢下降，1-MCP處理組的MDA含量達(dá)到最低0.065 nmol/L。在整個(gè)貯藏期間，1-MCP處理組的機(jī)械傷青圓椒MDA含量一直低于對(duì)照組，說(shuō)明，對(duì)含有機(jī)械損傷的青圓椒進(jìn)行 1-MCP處理，可以有效的延緩MDA的積累。

2.4 1-MCP處理對(duì)機(jī)械損傷青圓椒APX酶活性和APX基因表達(dá)量的影響

圖4 1-MCP處理青圓椒機(jī)械傷后對(duì)抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性和APX基因表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of 1-MCP treatment on APX activity and gene expression of green bell pepper

APX是以抗壞血酸為電子供體的專一性強(qiáng)的過(guò)氧化物酶，催化抗壞血酸與H2O2發(fā)生氧化還原反應(yīng)，以使抗壞血酸氧化形成單脫氫抗壞血酸，同時(shí) H2O2被分解消除，提高細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)還原勢(shì)，對(duì)外界的氧化脅迫、不良環(huán)境、病蟲(chóng)害侵染等作出反應(yīng)[17]。由圖4可知，在貯藏期間，APX的活性先緩慢上升后快速下降。對(duì)照組和1-MCP處理組的APX活性在0～6 d內(nèi)上升，并于第6 d達(dá)到峰值，分別為53.35 U/(g·min)、56.65 U/(g·min)，在第6 d之后迅速下降。1-MCP處理組的APX活性顯著高于對(duì)照組，在第12 d以后，處理組與對(duì)照組兩者差異極其顯著（p＜0.01）。由圖4可知，1-MCP處理組的APX的基因表達(dá)量始終高于對(duì)照組，兩者差異極其顯著。APX基因表達(dá)量具有與APX酶的活性相似的變化趨勢(shì)，均為先升高再持續(xù)下降。由以上結(jié)果可表明，對(duì)有機(jī)械損傷的青圓椒進(jìn)行1-MCP處理，可以有效的延緩APX活性的降低。

2.5 1-MCP處理對(duì)機(jī)械損傷青圓椒POD酶活性和POD基因表達(dá)量的影響

POD是活性較高的適應(yīng)性酶，能夠反映植物生長(zhǎng)發(fā)育的特點(diǎn)、體內(nèi)代謝狀況及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，POD有清除H2O2的作用[18]。由圖5可知，對(duì)照組和1-MCP處理組的POD活性均呈先上升后下降的趨勢(shì)，1-MCP處理組的POD活性一直高于對(duì)照組。對(duì)照組和1-MCP處理組的POD活性均于第9 d達(dá)到峰值。在第15 d和18 d，1-MCP處理組的POD活性顯著高于對(duì)照組，差異極其顯著（p＜0.01）。由POD基因表達(dá)量可以得出，POD基因表達(dá)量與POD酶的活性變化趨勢(shì)相似，呈先上升后下降趨勢(shì)，且1-MCP處理組的POD的基因表達(dá)量均高于對(duì)照組的POD基因表達(dá)量。第9 d后，對(duì)照組和1-MCP處理組差異極其顯著（p＜0.01）。由此可以得出，用1-MCP處理機(jī)械損傷青圓椒，可以延緩有效 POD活性的下降，削弱膜脂過(guò)氧化作用，起到保護(hù)細(xì)胞膜的作用。

圖5 1-MCP處理青圓椒機(jī)械傷后過(guò)氧化物酶（POD）活性和POD基因表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of 1-MCP treatment on POD activity and gene expression of green bell pepper

2.6 1-MCP處理對(duì)機(jī)械損傷青圓椒CAT酶活性和CAT基因表達(dá)量的影響

CAT是植株體內(nèi)廣泛存在的可以清除活性氧的膜保護(hù)酶類，它能把活性氧轉(zhuǎn)變成低活性物質(zhì)，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)[19]。由圖6可知，在青圓椒果實(shí)的貯藏過(guò)程中，CAT的活性先升高后下降，并于第9 d達(dá)到峰值，1-MCP處理組的活性一直高于對(duì)照組，且差異極顯著（p＜0.01）。在貯藏期間內(nèi)，1-MCP處理組的CAT的基因表達(dá)量均高于對(duì)照組，并于第9 d達(dá)到峰值，第9 d后，兩者之間差異顯著（p＜0.05）。對(duì)照組和1-MCP處理組的CAT基因表達(dá)量具有與CAT酶活性相似的變化趨勢(shì)，于第9 d達(dá)到峰值活性。由此可得出，用1-MCP處理機(jī)械損傷青圓椒可以顯著延緩CAT活性的下降，并減弱膜脂過(guò)氧化作用，保護(hù)細(xì)胞膜。

圖6 1-MCP處理青圓椒機(jī)械傷后過(guò)氧化氫酶（CAT）活性和CAT基因表達(dá)量的影響Fig.6 Effect of 1-MCP treatment on CAT activity and gene expression of green bell pepper

3 結(jié)論

水果和蔬菜在采前和采后都會(huì)受到不同程度的機(jī)械損傷。采前機(jī)械損傷少有規(guī)律可尋，較為嚴(yán)重的機(jī)械損傷一般發(fā)生在采收以后[20]，當(dāng)蔬菜類果實(shí)受到機(jī)械傷等外界損傷脅迫時(shí)，降解反應(yīng)、膜脂過(guò)氧化等一系列生理生化反應(yīng)會(huì)造成果實(shí)體內(nèi)積累大量的自由基，并傷害果實(shí)細(xì)胞。目前，1-MCP在果蔬貯藏保鮮方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在20 ℃的貯藏溫度下采用1-MCP處理京甜3號(hào)，并可以有效減緩果實(shí)中葉綠素的降解和維生素C含量的下降，提高一些抗機(jī)械傷脅迫物質(zhì)的活性或含量。用 1-MCP處理含有機(jī)械損傷的青圓椒，有效抑制了MDA含量的增加，以上結(jié)果說(shuō)明，1-MCP處理可以有效提高植物的抗脅迫性，并保護(hù)細(xì)胞膜脂，從而維持了細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的相對(duì)穩(wěn)定性。與對(duì)照組相比，青圓椒果實(shí)在受到人工模擬機(jī)械傷后，10 μL/L 1-MCP處理能顯著提高抗氧化系統(tǒng)保護(hù)酶類POD、CAT、APX的活性，以及抗氧化酶基因的相對(duì)表達(dá)量，且抗氧化酶基因的相對(duì)表達(dá)趨勢(shì)與酶活性變化趨勢(shì)相似，說(shuō)明 1-MCP處理可能直接或間接地清除植物體內(nèi)的自由基，進(jìn)而減輕外界機(jī)械損傷脅迫對(duì)植物果實(shí)細(xì)胞造成的傷害，保持青圓椒貯藏期的品質(zhì)，延長(zhǎng)其貯藏保鮮期。