林惠武，林燕瓊，林志輝

(1. 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院 藥劑科，福建廈門 361003； 2. 福建省立醫(yī)院消化內(nèi)科， 福州 350001)

酒精依賴和濫用已成為目前我國甚至全球范圍內(nèi)備受關(guān)注的健康問題，大量長期飲用含有酒精的飲料會導(dǎo)致肝發(fā)生脂肪肝等病理損傷，引起酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群可調(diào)節(jié)機(jī)體代謝脂質(zhì)獲得能量的效率，參與機(jī)體飲食環(huán)境改變所致食物代謝活動的改變，調(diào)節(jié)血脂水平變化及脂肪在肝等的積累過程[2]。研究發(fā)現(xiàn)，沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1(sirtuin-1，SIRT1)是一種組蛋白去乙?；?，參與調(diào)解能量代謝等過程[3]；碳水化合物結(jié)合蛋白(carbohydrate element binding protein，ChREBP)是肝中調(diào)控葡萄糖代謝的一種重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可激活糖酵解過程和脂質(zhì)合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，在酒精性肝病發(fā)展過程中具有重要作用[4]。雙歧桿菌(Bifidobacterium，BIFI)作為人體腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群之一[5]，是否能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝影響酒精性肝疾病的發(fā)生發(fā)展尚不清楚。本研究通過構(gòu)建慢性酒精性肝損傷(chronic alcoholic liver injury，CALI)大鼠模型，旨在探討B(tài)IFI對CALI大鼠肝損傷的保護(hù)作用并初步探討其作用機(jī)制，為研究和開發(fā)防治酒精性肝損傷的治療方法提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗動物

70只清潔級SD大鼠，12周，體重180～210 g，購自上海西普爾-必凱公司【SCXK(滬)2013-0016】。在廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗動物中心統(tǒng)一進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)【SYXK(滬)-2013-0058】，均自由飲水飲食，1周后用于實(shí)驗。所有實(shí)驗均經(jīng)本院動物實(shí)驗倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號：2014-03)。

1.1.2 藥物、主要試劑與儀器

雙歧桿菌活菌膠囊(批號：S10960040)，購自麗江麗珠制藥廠；美他多辛膠囊(批號：H20092458)，購自浙江震元醫(yī)藥公司；SIRT1抑制劑Tenovin-6(批號：HY-15510)，購自美國MCE公司；無水乙醇(≥ 99.7%，批號：20140903)，購自碧云天生物公司；4%多聚甲醛、蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色試劑盒、戊二醛、BCA試劑盒、DAB顯色試劑盒、蛋白提取試劑盒，購自上海生工生物技術(shù)公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase，AST)試劑盒，購自碧云天公司；Anti-SIRT1(批號：ab189494)、Anti-ChREBP(批號：ab81958)、Anti-GAPDH(批號：ab9548)，羊抗兔二抗(批號：ab6721)，購自美國ABCam公司；石蠟烤片機(jī)，購自德國Leica公司；普通光學(xué)顯微鏡，購自日本Olympus公司；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀，購自美國Bio-Rad公司等；全自動生化檢測儀，購自美國BC公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模及給藥

將70只SD大鼠隨機(jī)分成以下7組，每組10只：(1)空白對照組：空白+生理鹽水灌胃；(2)CALI組：酒精造模+生理鹽水灌胃；(3)陽性對照美他多辛(metadoxine，META)組：酒精造模+90 mg/kg META灌胃給藥；(4)-(6)BIFI低、中、高劑量組：酒精造模+500 mg/kg BIFI、1000 mg/kg BIFI、2000 mg/kg BIFI灌胃給藥；(7)Tenovin-6組：酒精造模+2000 mg/kg BIFI+25 mg/kg Tenovin-6灌胃給藥，灌胃容積為10 μL/g，每天1次，持續(xù)7 d。按照Lieber-DeCarli方法進(jìn)行酒精造模[6]，前6周分別給予5%酒精灌胃，后2周給予8%酒精灌胃。8周后，給予大鼠常規(guī)麻醉處理，取腹主動脈血5 mL用于肝功能檢測；立即取出大鼠肝，洗凈后對稱切半，一半切碎后分成兩份，置于液氮中速凍，-80℃保存；一半置于4%多聚甲醛中固定，制備常規(guī)石蠟切片，用于HE染色和組織病理學(xué)觀察。

1.2.2 生化指標(biāo)檢測

(1)各組大鼠肝功能檢測：將1.2.1中血液標(biāo)本靜置30 min后，于3000 r/min條件下離心10 min，小心取出上層清液，一部分采用ALT試劑盒、AST試劑盒檢測血液中ALT水平和AST水平。

(2)血清三酰甘油(triglycerides，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)水平檢測：將(1)中血清樣品置于全自動生化檢測儀中測定血清TG和TC的含量。

(3)肝組織TG和TC含量的測定：將1.2.1中冷凍大鼠肝組織取出，制備勻漿液，3000 r/min條件下離心10 min，采用ALT試劑盒、AST試劑盒檢測上清液中ALT水平和AST水平。

(4)肝組織病理形態(tài)變化觀察：對1.2.1中大鼠肝組織切片脫蠟、水化后，按照HE染色流程進(jìn)行染色，中性膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下，觀察大鼠肝組織形態(tài)。

(5)肝組織SIRT1、chREBP蛋白表達(dá)檢測：取出適量冷凍大鼠肝組織，在液氮中研磨，加入1.2 mL蛋白裂解液，提取各組大鼠肝組織總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白總量。經(jīng)聚丙烯酰胺十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)-凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；5%脫脂奶粉，封閉1 h；分別加入一抗Anti-SIRT1、Anti-chREBP、Anti-GAPDH(1∶1000)，4℃孵育過夜；加入二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測，Tanon軟件拍攝圖像并進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行單因素方差分析。P< 0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BIFI對CALI大鼠肝功能的影響

與對照組比較，CALI組大鼠肝組織中AST、ALT 活性明顯增高，差異有顯著性(P< 0.05)；與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組大鼠肝組織中AST、ALT 活性明顯降低，差異有顯著性(P<0.05)；與BIFI高劑量組比較，Tenovin-6組大鼠肝組織中AST、ALT 活性明顯增高，見表1。

表1 BIFI對大鼠肝組織AST、ALT水平的影響Table 1 Effect of BIFI on AST and ALT levels in rat

注：與對照組比較，*P< 0.05；與CALI組比較，#P< 0.05；與BIFI-H組比較，※P< 0.05。

Note: Compared with the control group,*P< 0.05. Compared with the CALI group,#P< 0.05. Compared with the BIFI-H group,※P< 0.05.

2.2 BIFI對CALI大鼠脂質(zhì)代謝的影響

與對照組比較，CALI組大鼠肝組織和血清中TG、TC 含量明顯增多，差異有顯著性(P< 0.05)；與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組大鼠肝組織和血清中TG、TC 含量明顯減少，差異有顯著性(P< 0.05)；與BIFI高劑量組比較，Tenovin-6組大鼠肝組織和血清中TG、TC 含量明顯增多，見表2。

表2 BIFI對大鼠肝組織和血清中TG、TC水平的影響Table 2 Effect of BIFI on TG and TC levels in rat liver tissue and n=10,mmol/L)

注：與對照組比較，*P< 0.05；與CALI組比較，#P< 0.05；與BIFI-H組比較，※P< 0.05。

Note: Compared with the control group,*P< 0.05. Compared with the CALI group,#P< 0.05. Compared with the BIFI-H group,※P< 0.05.

2.3 BIFI對CALI大鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響

組織病理學(xué)表現(xiàn)顯示，對照組大鼠肝小葉形態(tài)完整，肝細(xì)胞排列緊密規(guī)則、無脂滴堆積，未見炎性細(xì)胞，肝組織結(jié)構(gòu)正常。CALI組大鼠肝呈脂肪性病變，肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，肝細(xì)胞破碎、腫脹，排列疏松，出現(xiàn)大量脂滴和炎性細(xì)胞浸潤，呈病理損傷狀態(tài)。BIFI低、中、高劑量組大鼠肝組織損傷程度減輕，破碎和炎性肝細(xì)胞數(shù)量減少，肝細(xì)胞形態(tài)相對規(guī)則。Tenovin-6組大鼠肝呈病理損傷狀態(tài)。(圖1)

注：A：空白對照組；B：CALI組；C：META組；D：BIFI低劑量組；E：BIFI中劑量組；F：BIFI高劑量組；G：Tenovin-6組。圖1 HE染色觀察BIFI對大鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響(n=10，×400)Note. A. Control. B. CALI. C. META. D. BIFI-L. E. BIFI-M. F. BIFI-H. G. Tenovin-6.Figure 1 Effect of BIFI on the liver tissue structure of rats by HE staining (n=10，×400)

2.4 BIFI對CALI大鼠SIRT1/ChREBP通路的影響

如圖2所示，與對照組比較，CALI組大鼠肝組織SIRT1蛋白表達(dá)明顯降低，ChREBP蛋白表達(dá)明顯增高，差異有顯著性(P< 0.05)；與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組大鼠肝組織SIRT1蛋白表達(dá)明顯增高(P< 0.05)，ChREBP蛋白表達(dá)明顯降低(P< 0.05)；與BIFI高劑量組比較，Tenovin-6組大鼠肝組織SIRT1蛋白表達(dá)明顯降低(P< 0.05)，ChREBP蛋白表達(dá)明顯增高(P< 0.05)，見表3。

注：A：空白對照組；B：CALI組；C：META組；D：BIFI低劑量組；E：BIFI中劑量組；F：BIFI高劑量組；G：Tenovin-6組。圖2 BIFI對CALI大鼠肝組織SIRT1/ChREBP蛋白表達(dá)的影響(n=10)Note. A. Control. B. CALI. C. META. D. BIFI-L. E. BIFI-M. F. BIFI-H. G. Tenovin-6.Figure 2 Effect of BIFI on the expression of SIRT1/ChREBP protein in liver tissue of CALI rats (n=10)

組別GroupsChREBP/GAPDHSIRT1/GAPDH對照組Control0.53±0.092.12±0.41CALI組CALI2.29±0.48*0.36±0.07*陽性對照組META0.63±0.11*#1.11±0.09*#BIFI低劑量組BIFI-L2.02±0.13*#0.64±0.06*#BIFI中劑量組BIFI-M1.24±0.12*#0.89±0.13*#BIFI高劑量組BIFI-H0.65±0.11*#1.13±0.11*#Tenovin-6組Tenovin-60.94±0.13*#※0.88±0.12*#※

注：與對照組比較，*P< 0.05；與CALI組比較，#P< 0.05；與BIFI-H組比較，※P< 0.05。

Note: Compared with the control group,*P< 0.05; compared with the CALI group,#P< 0.05; compared with the BIFI-H group,※P< 0.05.

3 討論

酒精是導(dǎo)致酒精性肝損傷(CALI)的關(guān)鍵致病因子，大量研究表明，飲用酒精量越大，飲酒時間越長，肝損傷程度越嚴(yán)重[7]。ALD肝損傷早期多呈現(xiàn)出脂肪肝癥狀、隨著疾病嚴(yán)重程度的增加，依次進(jìn)展為肝炎癥、肝組織纖維化、肝硬化等，嚴(yán)重者導(dǎo)致大面積肝組織細(xì)胞壞死，甚至肝衰竭，威脅患者生命[8]。其中肝脂肪增多是ALD發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[9]。很多醫(yī)者認(rèn)為，戒酒是改善酒精性肝病患者肝損傷的根本方法，是治療CALI患者最基本的措施[10]。在酒精所致肝損傷過程中，首要發(fā)生的是脂肪性病變。本研究根據(jù)前人報道的方法，采用連續(xù)酒精灌胃的方式制備CALI模型大鼠，結(jié)果顯示，連續(xù)灌胃8周后，CALI組大鼠肝組織中AST、ALT 活性明顯增高，肝組織和血清中TG、TC 含量均明顯增多，且肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，肝細(xì)胞破碎、腫脹，排列疏松，出現(xiàn)大量脂滴和炎性細(xì)胞浸潤，呈脂肪性病變狀態(tài)，表明CALI模型制備成功。

腸道菌群在人體能量代謝、營養(yǎng)吸收中發(fā)揮關(guān)鍵作用，腸道菌群的紊亂可導(dǎo)致一系列疾病，而合理增加有益菌群可改善機(jī)體代謝[11]。大量研究表明，采用益生菌預(yù)處理可減輕非酒精性脂肪肝患者的肝功能損傷[12-13]。Porras等[14]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過調(diào)節(jié)腸道菌群失衡及相關(guān)的肝-肝軸激活，發(fā)揮對高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪肝的保護(hù)作用，提示腸道菌群可調(diào)節(jié)肝功能。Janssen等[15]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的調(diào)節(jié)可有效減輕非酒精性脂肪肝小鼠肝中脂肪組織質(zhì)量，減輕炎癥反應(yīng)，改善肝纖維化程度，提示腸道菌群對非酒精性肝脂肪性病變具有一定保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組大鼠肝組織中AST、ALT 活性明顯降低，表明BIFI具有保護(hù)慢性酒精所致肝功能損傷的功能。另外，與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組肝組織和血清中TG、TC 含量明顯減少，破碎和炎性肝細(xì)胞數(shù)量減少，肝組織損傷程度明顯減輕，表明BIFI具有改善慢性酒精性肝損傷過程中脂質(zhì)堆積的功能，與Chen等[16]在高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝大鼠中研究一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BIFI對CALI大鼠脂肪堆積的抑制作用和對肝功能損傷的保護(hù)作用可被SIRT1抑制劑Tenovin-6特異性地抑制，提示BIFI對CALI大鼠脂肪代謝的促進(jìn)作用和對肝功能損傷的保護(hù)作用可能與SIRT1通路有關(guān)。

SIRT1在哺乳動物體內(nèi)廣泛表達(dá)，通過調(diào)節(jié)組蛋白乙?；?去乙?；?，調(diào)節(jié)DNA與組蛋白的結(jié)合狀態(tài)，影響基因轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞凋亡、能量代謝、炎癥反應(yīng)、氧化還原平衡等生理過程中發(fā)揮重要作用[17]。Jeon等[18]發(fā)現(xiàn)，SIRT1在肥胖性脂肪肝小鼠肝組織中表達(dá)下調(diào)，敲除SIRT1可顯著增加脂肪肝小鼠肝病變程度和炎癥水平，提示SIRT1可能預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖性肝損傷。另外Liangpunsakul等[19]發(fā)現(xiàn)，乙醇喂養(yǎng)小鼠可導(dǎo)致其肝中ChREBP表達(dá)上調(diào)，抑制其表達(dá)則可改善乙醇所致小鼠肝損傷。Gao等[20]研究發(fā)現(xiàn)，香石酸可通過促進(jìn)SIRT1表達(dá)，抑制ChREBP表達(dá)抑制酒精性肝損傷大鼠肝組織中氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，降低大鼠血脂水平，保護(hù)酒精所致大鼠肝損傷。以上研究表明，SIRT1/ChREBP在脂肪性肝損傷中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，CALI組大鼠肝組織SIRT1蛋白表達(dá)明顯降低，ChREBP蛋白表達(dá)明顯增高，與過往文獻(xiàn)報道一致，表明SIRT1/ChREBP參與酒精所致大鼠肝損傷過程。進(jìn)一步研究顯示，與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組大鼠肝組織SIRT1蛋白表達(dá)明顯增高，ChREBP蛋白表達(dá)明顯降低，表明BIFI具有激活SIRT1表達(dá)，抑制ChREBP表達(dá)的可能。同時，這種調(diào)節(jié)SIRT1、ChREBP蛋白的作用被SIRT1抑制劑Tenovin-6特異地抑制，提示BIFI可能通過促進(jìn)SIRT1表達(dá)，抑制ChREBP表達(dá)，抑制肝中脂質(zhì)合成。

綜上所述，BIFI可能通過促進(jìn)SIRT1表達(dá)，抑制ChREBP表達(dá)，減輕CALI大鼠體內(nèi)脂質(zhì)合成，實(shí)現(xiàn)對慢性酒精性肝損傷大鼠的肝保護(hù)作用。