秦波音，王超，任曉楠，譚丹，陳麗香，方鐘，李順，周曉輝

(復旦大學附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508)

隨著每年的流感流行，流感已成為人類面臨的主要公共衛(wèi)生問題之一。每年約15%的全球人口因流感病毒感染而導致嚴重的發(fā)病率和死亡率[1-2]。從1918年西班牙大流感(H1N1亞型)引起約5000萬人的死亡，到1968年香港流感(H3N2型)造成約100萬人的死亡，直至2009年首次出現(xiàn)在墨西哥(甲型H1N1型)后在多國迅速流行，造成約1萬人死亡[3-4]。甲型流感病毒的感染已對人類健康產(chǎn)生極大的威脅并造成了巨大的經(jīng)濟損失。深入探究甲型流感病毒感染致病機制，對抗流感病毒疫苗和藥物的研發(fā)具有重要意義。

甲型流感病毒的感染可引起嚴重的急性肺炎，這種原發(fā)性病毒性肺炎可能會導致急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，這是一種高死亡風險的呼吸綜合征。許多宿主因素與流感感染引起的ARDS有關，其中“細胞因子風暴”是機體天然免疫反應失調(diào)而引起ARDS的一個關鍵因素[5-7]。近期的研究表明，細胞死亡特別是細胞壞死可導致肺支氣管上皮的嚴重退化，雖然在一定程度上控制了病毒的復制，但如引發(fā)起過度炎癥反應則是嚴重的病理病變和高死亡率發(fā)生的重要原因[8-10]。

細胞程序性壞死關鍵調(diào)控分子RIP3參與流感感染后的確切作用還有待探討。本研究通過H1N1 PR8流感病毒分別感染RIP3-/-小鼠和C57BL/6小鼠，結(jié)果顯示RIP3-/-組小鼠生存率顯著提高，兩組小鼠病毒學方面雖無明顯差異，但RIP3-/-組小鼠的病理改變和炎癥應答較對照組減輕。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

H1N1病毒株A/ Puerto Rico/8/34 (簡稱PR8)，由中國科學院上海巴斯德研究所孟廣勛教授惠贈。流感病毒通過雞胚和MDCK細胞培養(yǎng)滴定后，-80℃放置備用，病毒感染實驗均在上海市公共衛(wèi)生臨床中心內(nèi)的動物生物安全二級實驗室(ABSL-2)中開展。

1.1.2 實驗動物及分組

SPF級6～7月齡C57BL/6小鼠和RIP3-/-(C57BL/6背景)小鼠共44只，雌雄各半。C57BL/6小鼠來源于上海市(復旦大學附屬)公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物部【SCXK(滬)2015-0002】，RIP3-/-小鼠由北京生命科學研究所王曉東院士惠贈，兩品系小鼠均飼養(yǎng)于上海市(復旦大學附屬)公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物部SPF區(qū)域【SYXK(滬)2015-0008】中。病毒感染前一天將小鼠轉(zhuǎn)移到ABSL-2。實驗共分為4組：RIP3-/-小鼠解剖組(A組)12只、RIP3-/-小鼠生存曲線組(B組)10只、C57BL/6小鼠解剖組(C組)12只和C57BL/6小鼠生存曲線組(D組)10只。所有操作均符合實驗動物倫理學要求(倫理審批號：IACUC2018-A044-02)。

1.1.3 實驗試劑

DMEM培養(yǎng)液(Gibco，1868707)，異氟烷(上海雅培制藥有限公司，B506)，多聚甲醛固定液(武漢谷歌生物科技有限公司，163307)，Total RNA抽提試劑盒 (QIAGEN GmbH，52906)，One-Step SYBR PrimeScriptPLUS RT-PCR kit (Perfect Real Time，RR096A)，MS INFLAMMATION CBA KIT(BD，552364)。

1.1.4 實驗儀器

CO2培養(yǎng)箱(3111，Thermo，美國)，勻漿機分散機(607EUR，Biospec，美國)，冷凍離心機(Micro 17R，Thermo，美國)，精密高溫干燥箱(DHG-9070C，上海之信儀器有限公司，中國)，熒光定量PCR儀(ViiA7，ABI，美國)，超微量分光光度計(K5600，北京凱奧科技發(fā)展有限公司，中國)，流式細胞儀(LSR Fortessa，BD公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 感染方法和樣本采集

將4組實驗小鼠分別標記稱重，小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，用40 μL含5.25×103TCID50PR8的DMEM病毒液滴鼻感染，將流感病毒液通過小鼠的一個鼻孔緩慢滴入，至完全吸收，滴鼻動作過程需輕柔。感染完成后將小鼠放回獨立送風隔離籠具(IVC)中正常飼養(yǎng)。感染后14 d內(nèi)，每天觀察小鼠狀態(tài)并進行體重稱量,記錄小鼠生存情況(若體重下降大于等于25%則記為倫理死亡)，在感染后第3、7天分別處死A組和C組小鼠各6只(3雄/3雌)。取整個肺組織稱重并拍照，左葉肺4%多聚甲醛固定，剩下肺分裝后速凍于液氮，轉(zhuǎn)移保存于-80℃冰箱待用。小鼠體重變化計算：根據(jù)每日體重變化，計算體重變化率=(感染后當天體重-0 d體重)/0 d體重×100%，小鼠肺指數(shù)計算：根據(jù)處死小鼠的肺濕重和體重計算肺指數(shù),肺指數(shù)=小鼠的肺重/小鼠的體重×100%[11]。

1.2.2 qRT-PCR 檢測肺病毒載量

取右葉部分肺組織，以0.05 g肺組織/500 μL PBS 的比例勻漿。使用Total RNA抽提試劑盒抽提肺組織中的總RNA，抽提產(chǎn)物用超微量分光光度計測定核酸濃度和吸光度值(A260/280為1.90～2.25)。將抽提好的RNA用One-Step SYBR RT-PCR kit進行肺病毒載量檢測。采用實驗室建立的檢測方案[11]，擴增體系為25 μL: TaqMan PCR基礎液12.5 μL，引物10 μmol/ L，RNA模板2.5 μL。按照以上體系加樣后，通過熒光定量PCR儀進行擴增。擴增程序為：42℃ 10 min；95℃ 1 min；95℃ 15 s，60℃ 45 s，45個循環(huán)。管家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的上游引物:(5′-AGGTCGGTGAACGGATTTG-3′);下游引物: (5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′)。流感病毒的上游引物: (5′-AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-3′); 下游引物: (5′-CAAAGCGTCTACGCTGC AGTCC-3′)。根據(jù)2-ΔΔCt的方法計算組織總RNA中的相對病毒載量。

1.2.3 CBA檢測細胞因子

相關炎性細胞因子的檢測均嚴格參照流式微珠陣列術(BD CBA Mouse Inflammation Kit，美國)說明書進行操作。

1.2.4 肺組織病理檢測

取實驗小鼠肺左葉，置于4%多聚甲醛溶液中進行固定，石蠟包埋，常規(guī)HE染色后，光鏡下觀察組織病理學變化。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 RIP3缺失對小鼠體重和死亡率的影響

流感病毒感染后，每日稱重，觀察小鼠狀態(tài)并記錄小鼠死亡情況。WT組和RIP3-/-組小鼠分別在攻毒后第2天和第3天起活動開始減少，反應遲鈍。第3天后，兩組小鼠均出現(xiàn)豎毛蜷縮、厭食和體重迅速下降。第7天后WT組小鼠出現(xiàn)弓背死亡，兩組小鼠體重下降至第8～9天開始逐漸恢復。第3天后，兩組小鼠的體重降低比率為：WT組> RIP3-/-組，但兩組小鼠體重總體改變趨勢差異無顯著性，均為感染后前8天體重逐漸降低，第8天后體重開始逐漸恢復(圖1)。WT組小鼠第7天出現(xiàn)死亡，至第14天時，其死亡率為87.5%，RIP3-/-組小鼠第9天出現(xiàn)死亡，至第14天時，其死亡率為50%，故RIP3-/-組小鼠死亡率顯著低于WT組(P< 0.05，圖2)。提示RIP3的缺失可降低小鼠死亡率。

圖1 攻毒后小鼠體重變化百分率Figure 1 The body weight change ratio of the mice after virus inoculation

注：WT組與RIP3-/-組相比差異有顯著性，*P< 0.05。圖2 攻毒后小鼠生存率Note. Significant difference between the groups of WT and RIP3-/- mice, *P< 0.05.Figure 2 Survival rates of the mice after virus inoculation

2.2 RIP3缺失對病毒載量和肺指數(shù)的影響

在感染后第3、7天分別對兩組小鼠進行解剖取材。取整個肺組織測得肺指數(shù)，用肺勻漿上清進行病毒載量分析。結(jié)果顯示兩組小鼠病毒載量在第3天和第7天無明顯差異。而從肺指數(shù)上看，兩組小鼠第7天比第3天肺炎癥都嚴重，但差異均無顯著性(圖3)?？梢?，流感病毒PR8感染后，RIP3的缺失對病毒載量和肺指數(shù)基本無影響。

2.3 RIP3缺失對小鼠肺組織病理學損傷

圖4 RIP3-/-和WT小鼠肺大體病理改變(肉眼觀察)Figure 4 Gross appearance of the lungs of RIP3-/- and WT mice (unaided viewing)

在感染后第3、7天分別對兩組小鼠肺組織取材發(fā)現(xiàn)，肉眼可見兩組小鼠均出現(xiàn)不同程度的肺病理改變并伴有充血現(xiàn)象。感染后第3天，WT組小鼠肺病變范圍達10%～20%，RIP3-/-組小鼠未見顯著病變；感染后第7天，兩組小鼠均較第3天充血嚴重，但WT組小鼠肺病變范圍達70%～80%，而RIP3-/-組只有30%～40%(圖4)。HE染色鏡下觀察(圖5)：兩組小鼠感染后第7天病理損傷均比第3天嚴重：肺泡間隔增寬，肺炎癥細胞浸潤增加。而同一時間點，RIP3-/-組小鼠較WT組小鼠病理損傷較輕，在感染后第3天，RIP3-/-組較WT組肺泡結(jié)構(gòu)完整，炎癥細胞浸潤較少；感染后第7天，WT組肺間隔增寬顯著，肺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞, 肺實變明顯，肺泡壁毛細血管擴張充血出血，而RIP3-/-組小鼠則相比損傷較輕。表明流感病毒PR8感染后, RIP3-/-的缺失可減少小鼠肺組織病理損傷。

2.4 RIP3缺失對炎癥因子釋放的影響

為研究RIP3信號通路在小鼠感染PR8后，在誘導機體產(chǎn)生炎癥細胞因子中發(fā)揮的作用。用CBA實驗對感染后第3、7天的WT和RIP3-/-小鼠肺組織勻漿中相關細胞因子進行檢測。發(fā)現(xiàn)感染后第3天，TNF-α在RIP3-/-小鼠中顯著減少(P< 0.05)，感染后第7天，IFN-γ在RIP3-/-組小鼠中顯著增多(P< 0.05)，而IL-6、MCP-1水平在兩個時間點則均未達到統(tǒng)計學差異(圖6)。

圖3 攻毒后小鼠肺病毒載量和肺指數(shù)Figure 3 Viral loads and lung weight body weight ratios in the WT and RIP3-/- mice after virus inoculation

注：B箭頭表示肺泡間隔顯著增厚，有大量血細胞滲出；F箭頭表示肺泡結(jié)構(gòu)完全破環(huán)，炎性細胞大量浸潤。圖5 WT和RIP3-/-小鼠肺的病理改變(HE染色)Note. B. Arrow indicates significant thickening of the alveolar septum with numerous blood cells. F. Arrow represents complete breakdown of the alveolar structure with infiltration of a large number of inflammatory cells.Figure 5 Histopathological changes in the lung tissues of WT and RIP3-/- mice (HE staining)

注：WT組與RIP3-/-組相比差異有顯著性，*P< 0.05。圖6 PR8攻毒后小鼠細胞因子應答Note. Significant difference in cytokines of the groups of WT and RIP3-/- mice, *P< 0.05.Figure 6 Levels of different cytokines in the WT and RIP3-/- mice after infection of PR8 influenza virus

3 討論

甲型流感病毒(IAV)是一種帶有負股、單鏈、分節(jié)的RNA基因組的包膜病毒，它是禽類和哺乳動物中流感病毒的主要病原體。急性IAV感染伴隨著被感染的肺原發(fā)性上皮細胞和成纖維細胞的溶解，以及在體內(nèi)呼吸道上皮細胞的破壞。在病毒復制的生命周期或?qū)υ摬《镜拿庖邞鹬校拗骷毎鸬街匾淖饔肹10,12]。有報道指出，細胞死亡例如細胞凋亡，可能是一種宿主防御機制，限制病毒在感染早期的傳播和宿主的免疫病理[13]。

真核細胞的死亡機制包括細胞凋亡(apoptosis)、自噬(autophagy)和壞死(necrosis)。凋亡一般不引起炎癥，而壞死與自噬則可能導致炎癥。壞死的形態(tài)學特點明顯異于前兩者，表現(xiàn)為細胞膜和細胞核溶解，細胞內(nèi)容物外溢，常伴隨炎癥的發(fā)生。而近些年的研究表明，在一定條件下細胞壞死也有信號通路參與調(diào)控，稱為程序性壞死(necroptosis或programmed necrosis)。2009年，Cho[14]和Zhang[15-16]等先后發(fā)表3篇報道，揭示了受體相互作用蛋白激酶(receptor-interacting proteins, RIPs)參與調(diào)控細胞壞死的分子機制。RIPs家族成員中RIP1和RIP3可通過RHIM基序(RIP homotypic interaction motif)相互作用，二者相互結(jié)合及相互磷酸化對程序性壞死起關鍵調(diào)節(jié)作用。

近期研究表明，在體內(nèi)無節(jié)制的細胞壞死可導致肺支氣管上皮的嚴重退化，盡管一定程度上控制了流感病毒的復制，但還是增加了宿主的死亡率[17]。此外，一些高致病性的H1N1和H5N1型甲型流感病毒感染后，宿主對這些毒株的過度免疫應答和炎癥反應是引起嚴重的病理病變和高死亡率的重要原因[8-10]。雖然有研究報道：Shoko Nogusa等[18]用4000 EID50(雞胚半數(shù)感染量)的H1N1 PR8對RIP3-/-和WT小鼠進行接種研究，該研究認為細胞程序性壞死關鍵分子RIP3在IAV感染后，RIP3驅(qū)動的細胞死亡和炎性小體激活并共同作用，可消除受感染細胞從而限制病毒傳播，提示RIP3在機體對抗IAV中起到保護作用。

但本研究中使用細胞培養(yǎng)擴增來源的H1N1 PR8(5.25×103TCID50)感染6～7月齡的RIP3-/-和WT組小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RIP3-/-組小鼠生存率顯著高于WT組小鼠，且WT組小鼠第8天出現(xiàn)死亡，而RIP3-/-組小鼠第9天才出現(xiàn)死亡。影響生存率因素主要為以下兩方面：病毒方面因素及宿主自身的免疫應答方面。本研究對感染小鼠后第3天和第7天肺病毒載量、肺組織病理及肺炎癥應答作了進一步檢測。結(jié)果顯示，兩組小鼠的病毒載量并無顯著性差異；但RIP3-/-組小鼠的肺組織大體病理表現(xiàn)明顯輕于WT組小鼠，而HE顯示炎癥病理也輕于WT組，這表明RIP3-/-組小鼠的肺炎癥及損傷較WT組顯著減輕。提示造成高死亡率及嚴重體重損失很可能與體內(nèi)的高炎癥應答有關，而并非受病毒因素的影響。細胞因子檢測顯示，RIP3-/-組小鼠肺內(nèi)部分炎性細胞因子(TNF-α)產(chǎn)生的減少，與炎癥病理減輕表形一致；而第7天時RIP3-/-組分泌的IFN-γ顯著高于WT組，但具體機制尚不清楚。IFN-γ是一類具有免疫調(diào)節(jié)效應的細胞因子，它的產(chǎn)生在病毒入侵后可以限制病毒的復制，并增強宿主免疫對機體發(fā)揮保護作用。

有研究報道，在LPS誘導的細胞炎癥模型中，RIP3缺失的骨髓來源的巨噬細胞和樹突狀細胞均不能產(chǎn)生炎性細胞因子[19-20]，揭示了RIP3介導的程序性壞死在促炎細胞因子產(chǎn)生中的促進作用。但炎癥是一把雙刃劍。根據(jù)Shoko Nogusa等的研究及本文的實驗結(jié)果，我們推測由于在RIP3-/-組小鼠中，程序性壞死信號通路在關鍵分子RIP3敲除后，壞死通路被抑制，從而減少了促炎性細胞因子的產(chǎn)生，而擁有完整壞死通路的WT組則促發(fā)了大量炎性細胞因子的產(chǎn)生。炎癥可以限制病毒復制，起到一定保護作用；但炎癥過度的情況下也會導致宿主的炎癥病理損傷，從而引起高病死率。本研究報道了與Shoko Nogusa等不一致的結(jié)果，可能是由于病毒來源不同(雞胚來源或細胞培養(yǎng)來源)、病毒滴度高低不同(需用同一方法滴定才能比較)、小鼠月齡不同，導致炎癥處于不同的狀態(tài)，從而導致不同的結(jié)局。

總之，在本研究實驗條件下，觀察到RIP3介導的程序性壞死信號通路在流感病毒H1N1 PR8引起的急性感染中起到一定的炎癥病理作用。深入探討RIP3介導的程序性壞死信號通路在流感病毒中的作用有助于揭示其致病機制，從而可能為研發(fā)臨床治療流感病毒感染的新藥提供潛在的靶標。