葛煦，張彩勤，趙勇，白冰，譚鄧旭，張賀，師長宏

(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，西安 710032)

近紅外(near-infrared, NIR)熒光染料具有高消光系數(shù)和較大的斯托克斯位移[1]，而正常組織在NIR光譜中幾乎沒有自發(fā)熒光，這樣可以使用NIR染料使信號與背景的比值最大化，從而通過影像學(xué)模式有效檢測腫瘤發(fā)生的部位[2]，具有特異性強(qiáng)、時間分辨率高、干擾小等優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于臨床腫瘤的術(shù)中導(dǎo)航，尤其術(shù)中腫瘤切緣、殘留灶和轉(zhuǎn)移灶的識別。吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)是唯一被美國 FDA 批準(zhǔn)用于臨床的 NIRF 染料[3]，但其缺乏腫瘤特異性，穩(wěn)定性差，在正常肝中也會顯示高的吸收，易造成假陽性信號[4]。目前，NIR熒光成像在腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用方面顯示出巨大的潛力，許多NIR化合物，如Cy5.5和IR800-CW，在用特異性抗原或?qū)嶒?yàn)肽標(biāo)記后已成功用于腫瘤模型的診斷[5]。

七甲川菁(heptamethine carbocyanine, HC)近紅外熒光染料能夠被腫瘤細(xì)胞吸收并特異性聚集于腫瘤部位，不需標(biāo)記任何靶標(biāo)便可直接用于前列腺癌(prostate cancer, PCA)移植模型的活體成像，具有成像和靶分子的雙重功能[6-7]。我們前期合成并篩選了一系列七甲川菁NIR染料，包括MHI-148和IR-783[8]。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對該類染料的吸收主要通過缺氧和活化的HIF1α/OATPs信號實(shí)現(xiàn)，從而使該類染料具有了腫瘤靶向性[6]。依據(jù)該特征本研究計(jì)劃將IR-783與化療藥物吉西他濱綴合形成偶聯(lián)化合物(near-infrared-gemcitabine，NIRG)[7]，連續(xù)注射臨床肝癌標(biāo)本異種移植(patient-derived xenograft，PDX)小鼠模型，利用其識別腫瘤的特性轉(zhuǎn)運(yùn)化療藥物，通過活體成像實(shí)時監(jiān)測化合物治療效果，實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向治療。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

20只6～7周齡的雄性BALB/c 裸鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司 【SCXK(京)2014-0001】，飼養(yǎng)在第四軍醫(yī)大學(xué)屏障設(shè)施內(nèi)【SYXK(陜)2014-001】。所有動物實(shí)驗(yàn)均獲得第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會的批準(zhǔn)(No. 17018)。

1.1.2 細(xì)胞系和試劑

人肝癌細(xì)胞系Hep3B2.1-7(Hep3B)購自美國ATCC細(xì)胞庫，通過慢病毒轉(zhuǎn)染Luc-Puro構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Luc的細(xì)胞系(Hep3B-Luc)，由本實(shí)驗(yàn)室保存[7]。細(xì)胞培養(yǎng)在10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液中，含1% 青霉素/鏈霉素(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)。肝癌手術(shù)標(biāo)本來自西京醫(yī)院肝膽脾胰外科(實(shí)驗(yàn)室編號分別為C64003，C34566和B66873)，相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)均獲得西京醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號：2015432)。MitoTracker(貨號ab112144)和LysoTracker(貨號ab112136)以及CEA(貨號ab4451)、AFP(貨號ab46799)和OATP(貨號ab15441)抗體購自Abcam公司，HIF1α(貨號610958)抗體購自BD公司。七甲川菁近紅外熒光染料IR-783與化療藥物吉西他濱綴合形成的偶聯(lián)化合物NIRG(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見參考文獻(xiàn)7)由美國Cedars-Sinai Medical Center(Los Angeles，CA)的 Leland Chung教授提供[7]。

1.2 方法

1.2.1 肝癌細(xì)胞對NIRG的特異性吸收

為了測定NIRG在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合部位，人肝癌細(xì)胞系Hep3B在24孔板培養(yǎng)24 h后分別加入MitoTracker(200 nmol/L)或 LysoTracker(75 nmol/L)37℃ 作用30 min后，PBS洗滌，加入NIRG溶液(20 μmol/L)繼續(xù)作用30 min，PBS洗滌后，在熒光顯微鏡下觀察NIRG在線粒體和溶酶體中的結(jié)合(Olympus IX71, Olympus, Melville, NY, Jap，配備ICG濾光片，發(fā)射/激發(fā)：750-800/820-860 nm)。

1.2.2 肝癌裸鼠皮下移植瘤的NIRF 成像

實(shí)驗(yàn)中裸鼠麻醉采用腹腔注射氯胺酮(100 mg/mL)和甲苯噻嗪(20 mg/mL)混合溶液，手術(shù)和成像實(shí)驗(yàn)中采用異氟烷吸入麻醉。

將不同濃度的Hep3B-Luc細(xì)胞(1×106，3×106，和9×106)分別接種裸鼠右后肢皮下。兩周后，上述裸鼠腹腔注射NIRG 1 μmol/(L·kg)溶液100 μL，24 h后采用配備有ICG濾光片的(發(fā)射/激發(fā)：750-800/820-860 nm)小動物活體成像系統(tǒng)(Lumina II Small Animal Optical Imaging System)檢測腫瘤部位NIRF 強(qiáng)度。同時按照1.5 mg/mouse劑量腹腔注射熒光素酶底物(Gold Biotechnology，Olivette, MO, USA)，同樣檢測腫瘤部位生物發(fā)光強(qiáng)度(bioluminescence intensity，BLI)，分析NIRF 強(qiáng)度與BLI信號的相關(guān)性。

1.2.3 IR-783介導(dǎo)的化療藥物對肝癌PDX模型的治療

來自臨床的肝癌手術(shù)標(biāo)本被切成3 mm3大小，無菌浸泡處理后，套管針移植入裸鼠背部皮下(每組5只)。1月后，腫瘤開始生長，計(jì)數(shù)為F0代，取其組織塊用4%多聚甲醛固定后，切片，進(jìn)行HE染色。腫瘤一抗AFP 37℃孵育2 h，加入二抗(羊抗鼠)室溫孵育20 min，DAB顯色后，蘇木精復(fù)染脫水透明封片晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察。同時免疫組織化學(xué)測定HIF1α和OATP的表達(dá)。PDX模型腫瘤組織連續(xù)傳代。取其F3代瘤組織移植裸鼠皮下，待腫瘤長至100 mm3后，分成兩組(每組5只)分別腹腔注射 NIRG(10 mg/kg)和生理鹽水，每周2次，連續(xù)治療4周，測定腫瘤大小，繪制腫瘤生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 肝癌皮下移植瘤對NIRG的特異性吸收

利用人肝癌細(xì)胞系Hep3B-Luc成功建立裸鼠皮下移植模型，分別注射NIRG染料和熒光素底物后，活體成像同時測定腫瘤部位NIRF信號和生物發(fā)光(BIL)信號。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NIRG特異性富集于腫瘤部位，隨著腫瘤的生長，NIRF信號和BIL信號均增強(qiáng)(圖1A)，且二者具有良好的相關(guān)性(R2=0.99716，圖1B)。

注：裸鼠皮下注射肝癌Hep3B-Luc細(xì)胞后建立的移植模型分別注射酶底物和NIRG后進(jìn)行NIRF/BLI成像(1A)。計(jì)算 NIRF強(qiáng)度與BLI信號強(qiáng)度的相關(guān)性(n=5)(1B)。圖1 定量分析NIRG在肝癌模型中介導(dǎo)的熒光信號Note. Hep3B-Luc cells were subcutaneously injected into nude mice. The implanted models were injected with the enzyme substrate and NIRG, and subjected to NIRF/BLI imaging (1A). The correlation between NIRF intensity and BLI signal was calculated (n=5) (1B).Figure 1 Quantitative analysis of fluorescent signals mediated by NIRG in liver cancer models

2.2 肝癌細(xì)胞與 NIRG染料的特異性性結(jié)合

熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)NIRG信號聚集于肝癌細(xì)胞Hep3B(圖2)。為了進(jìn)一步明確NIRF染料在細(xì)胞器內(nèi)的結(jié)合部位, 我們將Hep3B 細(xì)胞和NIRG分別與MitoTracker、LysoTracker特異性探針共孵育。結(jié)果如圖2，NIRG近紅外熒光信號共定位于Hep3B細(xì)胞黃色的MitoTracker探針或綠色的LysoTracker 探針部位，提示NIRF染料在腫瘤細(xì)胞內(nèi)結(jié)合的部位分別為線粒體和溶酶體。

2.3 肝癌PDX模型的建立及NIRF活體成像

三例肝癌手術(shù)標(biāo)本移植裸鼠皮下后，平均大約3個月后才形成肉眼可見的腫瘤，待腫瘤長至500 mm3后，連續(xù)體內(nèi)傳代3次后，腫瘤生長的潛伏期穩(wěn)定至20 d。取原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤HE染色發(fā)現(xiàn)，二者在組織形態(tài)方面保持了較好的一致性(圖3)。免疫組織化學(xué)檢測顯示肝癌特異性抗原AFP高表達(dá)，與NIRF染料特異性吸收相關(guān)的抗原HIF1α和OATP均高表達(dá)(圖4)。

注：NIRF為化合物NIRG在腫瘤細(xì)胞內(nèi)激發(fā)的熒光，綠色為溶酶體特異性探針，橙色為線粒體特異性探針，DAPI為細(xì)胞核特性探針。圖2 NIRG特異性聚集于肝癌細(xì)胞的線粒體和溶酶體(×1200)Note. NIRF is the fluorescence of compound NIRG excited in tumor cells. Green is the lysosome-specific probe. Orange is the mitochondrion-specific probe and DAPI is the nuclear probe.Figure 2 NIRG specifically clusters in mitochondria and lysosomes of liver cancer cells(×1200)

2.4 NIRG介導(dǎo)的靶向藥物對肝癌PDX模型的治療效果

三例肝癌PDX模型成瘤后，分組在7、14、21和28 d注射NIRG溶液，F(xiàn)3代裸鼠皮下移植瘤，腹腔注射NIRG溶液后，24 h進(jìn)行NIRF活體成像均可以檢測到腫瘤部位有特異性熒光，確認(rèn)了NIRG染料在肝癌PDX模型中的腫瘤靶向性，活體成像結(jié)果見圖5。該化合物能夠在腫瘤部位特異性聚集，誘導(dǎo)較強(qiáng)的近紅外熒光。連續(xù)注射NIRG化合物后能夠顯著抑制腫瘤的生長(圖6)，在三種肝癌PDX移植模型中均顯示出治療效果，說明該化合物兼具熒光成像和腫瘤靶向轉(zhuǎn)運(yùn)化療藥物的能力。

圖3 肝癌PDX模型瘤組織的病理形態(tài)(×400)Figure 3 Histopathological analysis of PDX models of liver cancer(×400)

3 討論

吉西他濱是一種脫氧胞苷類似物，具有廣泛的抗腫瘤活性，但其非特異性生物分布往往會引起嚴(yán)重的不良副反應(yīng)[9]。常規(guī)化療藥物無腫瘤靶向性，無法將治療劑特異性遞送至腫瘤組織。配有熒光基團(tuán)的分子前體藥物已經(jīng)成為監(jiān)測藥物輸送和釋放過程的有用工具。它允許實(shí)時監(jiān)測治療效果和減少藥物劑量，避免潛在副作用[10]。已報(bào)道七甲川菁染料主要通過缺氧和活化的HIF1α/OATPs信號識別腫瘤細(xì)胞，由于HIF1α和OATPs在大部分腫瘤細(xì)胞中普遍高表達(dá)，因此該類染料具有了腫瘤靶向性，在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌等腫瘤中均有報(bào)道其腫瘤成像的靶向性[5-8,10-12]。Shi等[13]嘗試將抗腫瘤藥物氮芥與近紅外熒光染料IR-780碘化物結(jié)合，構(gòu)建了新的靶向藥物IR-780NM，該化合物兼具有腫瘤靶向性和近紅外熒光成像能力。將七甲川菁化合物IR-783與單胺氧化酶小分子抑制劑氯吉靈共軛結(jié)合后，形成了新的腫瘤靶向藥物，該化合物能將化療藥物特異性轉(zhuǎn)運(yùn)至人前列腺癌裸鼠移植模型腫瘤部位，有效抑制腫瘤的生長[14]。

常規(guī)化療藥物很難通過血腦屏障(BBB)和血腫屏障(BTB)[15]，七甲川菁染料作為藥物載體，與化學(xué)治療藥物共價結(jié)合后，促進(jìn)藥物穿透血液腫瘤屏障(BTB)，有效抑制腦腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，延長荷瘤小鼠的存活時間[7]。本研究中我們選擇臨床三例肝癌手術(shù)標(biāo)本，成功制備了PDX模型，通過組織病理學(xué)分析確認(rèn)了移植瘤與原發(fā)瘤的相似性，所有移植瘤均保持了AFP的高表達(dá)。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)PDX腫瘤標(biāo)本中HIF1α和OATPs的高表達(dá)，與七甲川菁染料識別腫瘤細(xì)胞的機(jī)制相吻合。因此，為了提高化療藥物的腫瘤靶向性，我們嘗試將IR-783與吉西他濱(gemcitabine)共軛結(jié)合成為IR-783-gemcitabine(NIRG)。該化合物在肝癌PDX裸鼠的移植模型中，能夠通過近紅外熒光成像顯示腫瘤的發(fā)生，符合七甲川菁染料的腫瘤靶向性近紅外熒光特征并且可以顯著抑制腫瘤的生長，顯示出良好的腫瘤靶向特異性和成像特性。

注：裸鼠移植瘤和病人原發(fā)瘤中AFP高表達(dá)；PDX移植瘤中HIF1α和OATP均高表達(dá)。圖4 肝癌PDX模型瘤組織的免疫組織化學(xué)分析(×400)Note. AFP was highly expressed in both nude mouse-transplanted tumors and primary tumors; both HIF1α and OATP were highly expressed in PDX tumors.Figure 4 Immunohistochemical analysis of PDX models of liver cancer(×400)

注：三個PDX移植瘤部位均檢測到特異性近紅外熒光。圖5 肝癌PDX模型的NIRF活體成像Note. Specific near-infrared fluorescence was detected in all three PDX xenografts.Figure 5 NIRF live imaging of PDX models of liver cancer

注：NIRG均顯著抑制三種肝癌PDX移植瘤的生長(n=5)。圖6 NIRG化合物對肝癌PDX模型的治療效果Note. NIRG significantly inhibits the growth of the three types of liver cancer PDX xenografts (n=5).Figure 6 The therapeutic effect of NIRG on PDX models of liver cancer

總之，新型七甲川菁染料衍生物-藥物綴合物NIRG是檢測和治療人類肝腫瘤的有效制劑。本研究結(jié)果為NIR染料的臨床應(yīng)用和未來發(fā)展都提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。這樣的共軛結(jié)合物不僅具備了近紅外熒光成像的特性，在未來的抗癌治療中可能成為重要的備選藥物。