雷少青，王雅楓，周璐，張元，夏中元，蘇娃婷

(武漢大學人民醫(yī)院麻醉科，武漢 430060)

糖尿病是一種以持續(xù)高血糖為主要特征的代謝紊亂性疾病，其控制不良往往會導致心臟、腦、腎、眼、周圍神經等多種組織器官功能損害，因而被社會廣泛關注。流行病學資料顯示：近70%的2型糖尿病患者存在慢性肝損害，其中最為常見的是非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)[1-2]，但由于肝具有較強的代償功能且早期肝損傷不明顯，因而糖尿病所導致的肝病變未引起臨床醫(yī)師及患者重視。研究顯示，NAFLD與糖尿病可相互促進，并形成惡性循環(huán)，從而加速疾病進展[3-4]。盡管糖尿病患者易發(fā)生肝損害的具體機制不詳，但已有證據表明高血糖所導致的氧化應激是其發(fā)生發(fā)展的重要始發(fā)因素[5]。叉頭狀轉錄因子O亞型1(forkhead transcription factor of class O1)是機體調控代謝的重要因子，其活性受胰島素負性調控[6]。在糖尿病狀態(tài)下，FoxO1過度活化可增加脂肪酸的攝取及氧化，同時抑制葡萄糖氧化利用率，當脂肪酸攝入量超過細胞的代謝能力時，將導致細胞線粒體功能紊亂而產生過量ROS(reactive oxygen species)致細胞損傷[7-8]。由此可見，FoxO1過度活化也可能是糖尿病氧化應激的重要機制。盡管如此，目前關于氧化應激與FoxO1過度活化在糖尿病肝損害中的具體作用關系仍然不明。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是一種含巰基的自由基清除劑，并是抗氧化劑谷胱甘肽的前體，因此被廣泛用來去除氧化應激所產生的ROS[9]。本研究旨在觀察2型糖尿病大鼠肝組織的抗氧化狀態(tài)及FoxO1的活性，并觀察抗氧化劑NAC干預對其的影響，以探究糖尿病相關肝損害的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

24只SPF級雄性SD大鼠，7～8周齡，180～220 g，由湖北省實驗動物研究中心提供【SCXK(鄂)2015-0018】，飼養(yǎng)于武漢大學人民醫(yī)院動物實驗中心【SYXK(鄂)2015-0027】。

1.1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素與N-乙酰半胱氨酸(NAC)購自美國Sigma公司；超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛和三磷酸腺苷(比色法)含量測定試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司；一抗FoxO1購自美國Santa Cruz公司；預染Marker、GAPDH、H3、Caspase-3與二抗購自美國Cell Signaling公司；全自動生化分析儀(日本東芝公司)；美國強生血糖分析儀。

1.2 方法

1.2.1 模型制作

SD大鼠以標準飲食適應性喂養(yǎng)1周后，按計算機產生的隨機數列將大鼠分為正常對照組(C)、糖尿病組(D)及NAC治療組(D+NAC)。D組與D+NAC組給予高脂飲食喂養(yǎng)4周后開始造糖尿病模型。造模前禁食12 h，腹腔注射小劑量STZ(25 mg/kg)，連續(xù)3 d血糖值超過11.1 mmol/L為2型糖尿病成功模型。D+NAC組大鼠灌胃給予NAC 1.5 g/(kg·d)[9]，C組與D組大鼠給予同體積生理鹽水。C組大鼠給予標準飲食，D組與D+NAC組大鼠繼續(xù)給予高脂飲食，持續(xù)8周。

1.2.2 標本收集與指標檢測

(1)一般指標

試驗期間，每周監(jiān)測大鼠血糖、體重一次，NAC治療后第4周與第8周分別記錄24 h進食量與飲水量。實驗結束時，記錄體重、肝重，并計算肝重指數=肝重/體重×100%。

(2)樣本收集

實驗結束后，大鼠經戊巴比妥鈉(65 mg/kg)麻醉及肝素抗凝后，處死大鼠，從下腔靜脈收集血液，隨后獲取肝組織，所有標本(血漿與肝組織)于-80℃冰箱保存。

(3)血漿指標檢測

全自動生化分析儀檢測三酰甘油(triglyceride，TG)、血漿游離脂肪酸(free fat acid，FFA)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平；應用試劑盒檢測血漿MDA水平，所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

(4)肝組織氧化應激指標檢測

將部分肝組織進行勻漿，提出上清液及BCA法測定蛋白濃度后，檢測肝組織標本中的SOD、CAT、GSH-Px和MDA水平，所有操作按試劑盒說明書進行。

(5)肝組織ATP含量測定

ATP水平可以直接反映線粒體功能。將上述的肝組織上清液經BCA法測定蛋白濃度后，用試劑盒檢測肝組織標本中的ATP水平，操作按試劑盒說明書進行。

(6)Western blot分析肝組織總蛋白中的Caspase-3及細胞質與細胞核中FoxO1蛋白表達水平

嚴格按照碧云天生物蛋白提取試劑盒說明書提取肝組織總蛋白及細胞質與細胞核蛋白，BCA法測定其蛋白濃度。上樣量為50～100 μg，10%～12.5% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后轉到PVDF膜；常溫封閉2 h后，加入一抗Caspase-3(1∶1000, Cell Signaling)，FoxO1 (1∶500, Santa Cruz Biotechnology)，GAPDH (1∶2000, Cell Signaling)，H3 (1∶1000, Cell Signaling)，4℃孵育過夜；再次洗膜后加入二抗(anti-rabbit IgG，1∶10 000, Cell Signaling)中室溫孵育2 h；按奧德賽 (Gene Company Limited) 操作人員手冊掃描條帶，分析并導出蛋白條帶，計算目標條帶灰度值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較

如表1所示，在實驗結束階段，與C組相比，D組大鼠24 h進食量與飲水量、血糖水平及肝重指數明顯增加，而體重明顯減輕(P<0.01)。與D組比較，D+NAC組大鼠24 h進食量與飲水量均有減少(P< 0.05)，但血糖水平、體重及肝重指數未有統計學改變。值得注意的是，在本實驗的前期研究中，我們未發(fā)現NAC干預對正常大鼠的一般情況有顯著影響(結果未顯示)，因此在后續(xù)實驗中未檢測C+NAC組大鼠相關指標的變化。

2.2 各組大鼠血漿TG、FFA、ALT、AST及MDA水平

如表2所示，與C組相比，D組大鼠血漿中TG、FFA、ALT、AST及MDA水平均顯著增加(P<0.01)；與D組比較，D+NAC組大鼠血漿TG、FFA、ALT、AST與MDA水平均明顯降低(P<0.05)，但仍明顯高于C組(P<0.05)。

2.3 各組大鼠肝組織SOD、CAT、GSH-Px、MDA及ATP水平

如表3所示，與C組比較，D組大鼠肝組織中SOD、CAT與GSH-Px活性及ATP含量均顯著降低(P<0.05)，而脂質過氧化物MDA含量明顯增加(P<0.01)；與D組比較，D+NAC組大鼠SOD、CAT與GSH-Px活性及ATP含量均明顯增加(P<0.05)，MDA含量盡管仍高于C組但顯著低于D組(P<0.05)。

表1 各組大鼠一般情況Table 1 General characteristics of rats at the end of the study(n=8,

注：與C組比較,*P<0.05，**P<0.01；與D 組比較，#P<0.05。C：正常對照組；D：糖尿病組；D+NAC：糖尿病+N-乙酰半胱氨酸治療組。(下表和圖同)。

Note. Compared with group C,*P<0.05,**P<0.01. Compared with group D,#P<0.05. C: control group; D: diabetic group; D+NAC: diabetes with N-acetylcysteine (NAC) treated group.(The same in the following Figures and Tables).

表2 各組大鼠血漿TG、FFA、ALT、AST及MDA水平Table 2 Plasma levels of TG, ALT, AST and MDA in rats of each

表3 各組大鼠肝組織SOD、CAT、GSH-Px及MDA水平Table 3 The levels of SOD, CAT, GSH-Px and MDA in liver tissues of rats in each group(n=8,

2.4 各組大鼠肝組織Caspase-3表達水平

如圖1所示，與C組比較，D組大鼠肝組織Caspase-3表達水平顯著降低(P< 0.01)，提示糖尿病肝組織凋亡水平增加；抗氧化劑NAC治療后顯著降低Caspase-3表達水平。

圖1 各組大鼠肝組織Caspase-3蛋白表達水平Figure 1 Caspase-3 expression in liver tissues of rats in each group

2.5 各組大鼠肝組織FoxO1活性水平

如圖2所示，與C組比較，D組大鼠肝組織細胞質成分中FoxO1表達顯著降低，而細胞核中FoxO1表達顯著增加(P< 0.01)，提示糖尿病肝組織FoxO1活性顯著增強；抗氧化劑NAC治療后顯著降低FoxO1活性水平。

圖2 各組大鼠肝組織細胞質與細胞核中的FoxO1蛋白表達水平Figure 2 FoxO1 expression in cytoplasm and nucleus of liver tissues of rats in each group

3 討論

現代生活方式和飲食習慣使得糖尿病及肥胖人群不斷增多，臨床上糖尿病相關的肝損害也越來越常見[10]。糖尿病狀態(tài)下糖利用障礙，而脂肪動員代償性增加，使得血漿游離脂肪酸增多，從而對機體產生毒性作用。肝能通過促進脂肪酸氧化和轉化為甘油三酯儲存在肝細胞內，從而適應糖尿病高脂質環(huán)境，這一方面導致肝組織氧化應激增強，另一方面致使肝細胞甘油三酯堆積而產生脂肪變性[11]。隨著糖尿病的進展，肝功能逐漸受損，導致胰高血糖素等激素滅活減少、胰島素抵抗加重、白蛋白合成障礙等一系列病理變化，從而形成惡性循環(huán)，最終加速了糖尿病及肝病變的進展[12]。

本研究采用高脂飲食與小劑量STZ腹腔注射誘導2型糖尿病大鼠模型，實驗中糖尿病大鼠出現典型的“三高一少”臨床癥狀，同時大鼠還表現為肝功能、線粒體功能與血脂異常，具體表現為ALT、AST、ATP、FFA及 TG水平均明顯增加。此外，糖尿病大鼠肝組織caspase-3表達水平增高，進一步發(fā)現血漿和肝組織中脂質過氧化產物MDA濃度顯著上升，這提示肝凋亡亡及氧化應激水平增加。NAC是目前較為常用的一種抗氧化劑，在我們前期研究中，其灌胃劑量在每日1.5 g/kg持續(xù)4周時可有效降低機體的氧化應激水平[9]，并能減輕糖尿病心肌功能紊亂及缺血后再灌注損傷[13]。在本研究中，我們應用NAC治療8周后，ALT、AST、FFA、TG、ATP及調亡水平均顯著降低。這表明抗氧劑NAC可部分抑制2型糖尿病大鼠肝組織氧化損傷、線粒體與肝功能減退及脂質異常代謝。

目前關于糖尿病導致肝損害的具體機制尚未完全闡明，但大量臨床研究發(fā)現活性氧自由基(ROS)增多被認為是NAFLD的始發(fā)因素和中心環(huán)節(jié)[5, 14]。SOD、CAT及GSH-Px是機體最為重要的內源性抗氧化酶，其活性能反映機體的抗氧化能力。本研究發(fā)現2型糖尿病大鼠肝組織中SOD、CAT及GSH-Px活性均顯著降低， NAC干預明顯升高了這三種抗氧化酶的活性。這提示NAC具有增強2型糖尿病大鼠肝組織內源性抗氧化能力的作用，這可能是其減輕糖尿病肝損害的有關機制。

FoxO家族是近年研究的一個熱點，其在調控細胞周期、氧化應激、能量代謝等方面具有重要作用。目前已發(fā)現四種FoxO家族成員：FoxO1、FoxO3、FoxO4及FoxO6。其中，FoxO1在調節(jié)代謝方面尤為重要，其活性受胰島素負性調節(jié)[6]。在糖尿病狀態(tài)下，胰島素絕對或相對不足均會導致FoxO1活性增強，從而增加脂肪動員，致使FFA濃度顯著增加，過量的FFA進入肝并超過肝的氧化能力，造成大量TG在肝中蓄積形成脂肪肝。此外，過量的FFA也會抑制胰島素的釋放、干擾胰島素的功能[15]，這會加重糖尿病，因而形成惡性循環(huán)。這提示糖尿病相關肝損害的發(fā)生和發(fā)展與FoxO1活性顯著增加密切相關。由于高血糖與高血脂均可以引起機體氧化應激的增強，因而在本實驗中我們特別檢測了抗氧化劑NAC對肝FoxO1活性的影響。我們發(fā)現2型糖尿病肝組織FoxO1活性顯著增強，而抗氧化劑NAC可以顯著抑制其活性。這表明糖尿病肝FoxO1活性增強與氧化應激有關，通過減輕糖尿病氧化應激從而抑制FoxO1活化的措施或許是減輕糖尿病肝損害的重要途徑。

綜上所述，抗氧化劑NAC可以減輕實驗性2型糖尿病相關肝損害，其機制可能與其增強機體抗氧化能力、減少血脂代謝與線粒體功能異常并抑制FoxO1過度活化有關。本研究初步探討了抗氧化劑對2型糖尿病相關肝損害中氧化應激及FoxO1的影響，以期為糖尿病相關肝損害臨床藥物的研發(fā)提供理論依據。