吳紅梅，劉學文，文格波，唐旻*

(1. 生物化學與分子生物學研究所，南華大學，湖南 衡陽 421001； 2. 南華大學第一附屬醫(yī)院，湖南 衡陽 421001)

隨著物質(zhì)生活水平的提高，人們攝入大量的高脂肪食物導致體重超標，甚至出現(xiàn)過度肥胖和代謝紊亂，并引起一系列心血管疾病，如糖尿病、冠心病和心衰[1-2]。在正常生理情況下，線粒體將心肌細胞儲存在脂肪酸和葡萄糖中的化學能轉(zhuǎn)化為高能磷酸化合物ATP，為心臟收縮提供能量。脂肪酸和葡萄糖氧化生成的還原當量NADH或者FADH2，在氧化磷酸化過程中形成一個跨線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子電化學梯度，H+從線粒體內(nèi)膜面順濃度梯度經(jīng)ATP合酶流回基質(zhì)面時，ATP生成[3]。高脂飲食導致心肌細胞中脂肪酸和葡萄糖的代謝發(fā)生紊亂，細胞收縮功能相關(guān)的ATP利用率降低，心臟收縮功能受到抑制，心衰發(fā)生[4]。敲除小鼠脂酶Atgl導致大量的脂肪聚集，出現(xiàn)嚴重的心肌病[5]。且有研究發(fā)現(xiàn)游離的脂肪酸促進H+經(jīng)解偶聯(lián)蛋白回流至線粒體基質(zhì)中，導致ATP生成不足，心臟收縮功能缺陷[6]。因此，心肌能量代謝紊亂是心衰發(fā)生的重要機制之一。

果蠅是研究人類疾病的經(jīng)典模式動物， 65%人類疾病基因在果蠅中找到同源基因[7]。果蠅心臟發(fā)育過程與人類早期胚胎心管發(fā)育極其相似，例如，果蠅心臟發(fā)育基因tinman的同源基因nkx2.5在哺乳動物中參與同樣的功能[8]。另外，哺乳動物代謝相關(guān)的酶類在果蠅中亦高度保守[9-10]。近年來新技術(shù)的發(fā)展，尤其是成體心臟功能分析平臺在果蠅中建立，促進發(fā)現(xiàn)了一系列基因的新功能，如轉(zhuǎn)錄因子pygopus，信號轉(zhuǎn)導蛋白編碼基因integrin-linkedkinase，以及神經(jīng)酰胺酶cdase，參與成體心臟功能[11-14]。基于果蠅的高度保守性以及完善的成體心臟功能分析平臺，高脂飲食誘導果蠅心衰模型的建立將為研究心衰發(fā)生發(fā)展的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

野生型黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)品系w1118，來自于美國伯明翰品系中心，飼養(yǎng)于南華大學果蠅培養(yǎng)室，晝夜各半交替。

1.1.2 果蠅培養(yǎng)基

1 L培養(yǎng)基中含有玉米粉84 g，蔗糖62 g，瓊脂6 g，酵母粉6 g，丙酸6 mL，為本實驗中的非高脂食物(non-fat diet，NFD)配方。在非高脂食物的基礎(chǔ)上加入了7.5%，15%，或者30%的椰油(百分數(shù)為非高脂食物與椰油的重量比)，作為含不同濃度椰油的高脂食物(high-fat diet，HFD)配方。

1.1.3 實驗試劑與儀器

NaCl，KCl，CaCl2，MgCl2，HEPES，NaH2PO4，NaHCO3，Sucrose，Trehalose購于上海生工，三酰甘油測定試劑(Thermo Fisher, TR22421)，Trizol(Invitrogen, 15596026)，DNase I(Invitrogen，AM2222), Eva Green熒光染料(Solis BioDyne, 08-25-00001)，cDNA 合成試劑盒(Applied Biosystems， 4368814)。

果蠅成體心臟生理學功能分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)由高速EM-CCD攝像機(Hamamatsu C9300，日本)和Semi-automatic heartbeat數(shù)據(jù)采集分析軟件組成。熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX connect，美國)，小型離心機(Eppendorf 5424, 德國)，PCR儀(Bio-Rad T100，美國)。

1.2 方法

1.2.1 果蠅飼養(yǎng)

收集5～10 d新孵化的雌性果蠅，分組用非高脂食物，7.5%，15%，30%高脂食物在20℃下培養(yǎng)5 d(椰油的熔點在22℃左右)。

1.2.2 三酰甘油含量測試

收集5～10 d新孵化的雌性果蠅，分組用非高脂食物，7.5%，15%，30%高脂食物在20℃下培養(yǎng)5 d，然后轉(zhuǎn)入空管中放置30 min，再轉(zhuǎn)移至1.5 mL Eppendorf 管中(每管12只)，稱量其體重，-80℃凍存。在Eppendorf管中加入1∶1的氯仿和甲醇混合液100 μL，研磨，4000 r/min離心5 min。取5 μL上清液加入170 μL三酰甘油測定試劑，37℃ 反應(yīng)10 min，分光光度計測量OD 550下的吸光度值。根據(jù)標準曲線，測量三酰甘油的絕對含量。三酰甘油相對含量=三酰甘油絕對含量/果蠅體重。

1.2.3 負向趨地性測試

果蠅有天生的負向趨地性。當果蠅被放入豎直放置的直管中，它們本能的向上爬行，爬行速度反映了果蠅運動能力。將20只果蠅倒入標有刻度的直管中，用固定裝置固定。將固定好的直管敲擊桌面，從果蠅全部震下去的那一刻開始計時，攝像5 s，記錄果蠅第5 s時所在的高度(直管刻度標記)。根據(jù)三酰甘油測試結(jié)果，實驗設(shè)計非高脂組NFD和30%高脂組HFD，每組記錄100只果蠅，每只果蠅測試5次，以確保實驗的可重復性。

1.2.4 成體心臟功能分析

FlyNap麻醉NFD和30%HFD組果蠅2～5 min；在擬果蠅體液內(nèi)環(huán)境的緩沖液(108 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，2 mmol/L CaCl2，8 mmol/L MgCl2，15 mmol/L HEPES，1 mmol/L NaH2PO4，4 mmol/L NaHCO3，10 mmol/L Sucrose， 5 mmol/L Trehalose，pH=7.1)下解剖果蠅，去除腹部表皮及相連內(nèi)臟，真空泵小心吸取去除脂肪組織。高速EM-CCD攝像機以130幀/s的速度拍攝果蠅心臟跳動30 s，獲得M-mode圖。M-mode圖以時間為X軸，展現(xiàn)了果蠅心壁邊緣對稱的兩點隨時間軸移動的軌跡變化圖。通過軟件分析獲得果蠅的收縮和舒張直徑，心跳周期、心臟收縮力以及心臟是否規(guī)律跳動等成體心臟生理功能分析指標。心臟收縮力=(舒張直徑—收縮直徑)/ 舒張直徑。詳細方法見文獻[15]。

1.2.5 RNA提取和實時定量PCR

收集NFD和30%HFD組果蠅心管，每組3個生物樣品重復，每個樣品50只果蠅心管，Trizol試劑按照常規(guī)步驟提取mRNA。DNase I消化RNA樣品中的殘留DNA，然后取1 μg RNA做反向PCR合成cDNA 20 μL，再稀釋10倍。取2 μL稀釋的 cDNA為模板，Eva Green 作為熒光染料，以28SrRNA作為內(nèi)參基因，熒光實時定量PCR測量fa2h，CG6277，CG3699，CG9914，lip2等基因的表達情況。28SrRNA引物序列F: CCCAGTGCTCTGAATGTCAA，R：ATGACGAGGCATTTGGCTAC；fa2h引物序列 F: CCAAAGTCGAGCCAAAGGGA，R：CAGTCCACTAG GTGCTCCATAC；CG6277引物序列F: ACTACCATC AGTTGTGGGCTC， R：GACGCGCTCAGATTCCTTGA；CG3699引物序列 F: GCCCTCGATCAGTTCA CCAA， R： GTCGACGATGCCAATGTTCC；CG9914引物序列 F: AAGGCGCTCTACAAGCAGTT， R：TCGACCAG AGGCACGTAGTA；lip2引物序列 F: AAGGCGCACA TAATTCGGC， R： ATTGTGCACTTCGTGGCTGA。

1.3 統(tǒng)計學方法

所得數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0 軟件處理，組間比較采用t-檢驗或卡方檢驗，P< 0.05 時認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食導致果蠅體內(nèi)三酰甘油含量升高

采用三酰甘油檢測試劑盒測試了高脂喂食果蠅體內(nèi)的三酰甘油含量，結(jié)果顯示：非高脂喂食果蠅，7.5%，15%，30%高脂喂食果蠅體內(nèi)三酰甘油含量分別為14.5，19.5，21.0，25.1 μg/mg(圖1)。隨著食物中椰油含量的遞增，果蠅體內(nèi)三酰甘油含量呈逐漸遞增的趨勢，與人類相近。后續(xù)實驗只選取30%椰油喂食果蠅作為實驗組(HFD組)，非高脂食物喂養(yǎng)果蠅作為對照組(NFD組)。

注：3次生物樣品重復，t-檢驗，*P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.0001。圖1 高脂喂食果蠅體內(nèi)三酰甘油含量隨椰油濃度呈劑量遞增Note. 3 biological replicates, t-test, *P< 0.05, **P< 0.01, *** P< 0.001.Figure 1 The triglyceride level is dose-dependently increased with coconut oil

2.2 高脂飲食將顯著影響果蠅活動力

負向趨地性實驗，拍攝第5 s時果蠅所在的高度。結(jié)果顯示：高脂喂食果蠅(30%椰油)，在6～8 cm處、2～6 cm處、2 cm 以下的比例分別為29%，52%和19%，而高脂喂食果蠅的比例分別為1%，17%，和82%(圖2)。約80%的非高脂喂食果蠅位于2 cm以上位置，相反，約80%的高脂喂食果蠅位于2 cm以下位置，提示果蠅活動能力減弱。

注：每組100只果蠅，每只果蠅統(tǒng)計5次?？ǚ綑z驗，P< 0.001。圖2 負向趨地性實驗發(fā)現(xiàn)高脂喂食果蠅活動力減弱Note. 100 flies were tested in each group. Each fly was counted 5 times. Chi-squared test, P< 0.0001.Figure 2 High-fat diet altered physical activity in Drosophila using negative geotaxis assay

2.3 高脂飲食導致心臟功能衰退

利用果蠅成體心臟生理學功能分析平臺，拍攝果蠅在半解剖條件下的心臟跳動情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂食物喂食果蠅導致心跳周期縮短(圖3A)，心臟舒張直徑明顯減小(圖3B)，心臟收縮直徑不變(圖3B)，心臟收縮力明顯下降(圖3C)，其差異有顯著性(P< 0.05)；果蠅心電圖M-mode顯示心臟跳動出現(xiàn)了輕微的心率不齊現(xiàn)象(圖3D)。高脂飲食誘導的果蠅心衰模型建立。

注：每組分析25只果蠅，t-檢驗，*P< 0.05, ** P< 0.01, *** P< 0.001；M-mode圖，藍色線條代表收縮直徑，紅色線條代表舒張直徑，綠色線條代表心跳周期，紅色箭頭處有輕微的不規(guī)律跳動情況。圖3 高脂飲食誘導心臟功能紊亂Note. At least 20 flies were analyzed per each group. t-test， *P< 0.05, ** P< 0.01, ***P< 0.001. M-mode: blue line and red line represent systolic diameter and diastolic diameter respectively. Green line represents heart period. Red Arrow points to irregular heart beat.Figure 3 High-fat diet treatment induced heart failure in Drosophila Melanogaster

2.4 代謝相關(guān)基因的表達變化

為了進一步研究高脂飲食誘導果蠅心衰的分子機制，檢測了高脂喂食果蠅心臟的RNA表達變化，結(jié)果顯示：與正常喂食果蠅相比，參與代謝相關(guān)基因fa2h，CG6277，CG3699，CG9914，lip2的表達明顯下調(diào)，分別為正常對照的31.7%，49.7%，30.0%，45.3%，67.0%(圖4)，提示果蠅心臟功能紊亂與脂代謝失調(diào)相關(guān)。

注：以28S rRNA作為內(nèi)參基因，比較非高脂喂食果蠅和高脂喂食果蠅心臟RNA表達變化，t-檢驗，*P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001。圖4 高脂飲食導致心臟代謝相關(guān)基因表達下調(diào)Note.Compare the relative expression changes between NFD and HFD treatment with 28S rRNA as reference gene， t-test，*P< 0.05, ** P< 0.01, *** P< 0.001.Figure 4 High-fat diet treatment causes the down regulation of metabolic gene

3 討論

高脂飲食可引起多個基因、多個器官的變化，與癌癥、糖尿病以及心血管疾病都存在著正相關(guān)性，很難確定它對特定疾病的影響。且心衰是一個復雜的病理性過程，多因素參與。高脂飲食人群常常伴隨著冠狀動脈粥樣硬化導致心肌缺血，進而發(fā)展為心力衰竭，直接作用于心肌細胞的脂毒性很難被研究。果蠅是一個開放的淋巴循環(huán)系統(tǒng)，直接由支氣管供養(yǎng)，避免了由于心肌缺血而導致的心力衰竭。且果蠅的遺傳分析技術(shù)手段成熟，解決了在小鼠中研究多基因遺傳相互作用困難的問題。因此，利用簡單的模式動物果蠅作為研究模型，建立高脂飲食誘導心衰模型，將幫助人們從心肌細胞能量代謝的角度闡釋心衰發(fā)生發(fā)展的分子機制。

心力衰竭是指由于心臟收縮或舒張功能發(fā)生障礙，不能將靜脈回心血量充分排出心臟。實驗結(jié)果顯示高脂喂食果蠅三酰甘油含量顯著性升高且出現(xiàn)了心臟收縮力下降等一系列心臟功能紊亂，與高脂喂食小鼠的心衰表型基本一致[16]，提示高脂飲食誘導的心衰模型建立成功。實時定量PCR實驗發(fā)現(xiàn)，脂酶編碼基因CG6277和lip2表達下調(diào)。脂酶催化脂類的酯鍵水解，參與脂類的消化和運輸中，可以將三酰甘油轉(zhuǎn)化為甘油和脂肪酸。且參與脂肪酸β-氧化的輔酶A脫氫酶基因CG9914和CG3699表達下調(diào)，而心臟所需ATP大約70%來自脂肪酸氧化，因此我們推測脂代謝受到抑制可能是高脂飲食誘導果蠅心衰發(fā)生的主要原因。

環(huán)境因素與遺傳因素一起共同參與心衰的發(fā)生[17]。Xiao等[18]報道了DNA甲基化參與了心肌肥大的發(fā)生，心臟收縮力明顯下降。大鼠全基因組測序顯示H3K4me3在正常和心衰心肌細胞中存在顯著差異[19]。表觀遺傳學修飾與心血管疾病的發(fā)生存在著相關(guān)性，飲食可以改變基因表觀遺傳學修飾[20-22]。因此，我們期待通過構(gòu)建高脂飲食誘導果蠅心衰模型，為研究高脂飲食-表觀遺傳修飾-心衰發(fā)生的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。