尹秀平，朱榕嘉，莊 晨，王 爍，趙春華，宋 坪

1中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院皮膚科，北京 100053 2中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所組織工程研究中心 干細胞新藥研發(fā)及臨床轉(zhuǎn)化研究北京市重點實驗室，北京 100005 3漳州市中醫(yī)院針灸科，福建漳州 363000

脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose mesenchymal stem cells，AMSCs)是一種來源于脂肪組織的成體間充質(zhì)干細胞，具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，在免疫治療方面具有廣闊的應用前景。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs) 能夠?qū)淋巴細胞產(chǎn)生免疫調(diào)控作用，可以抑制促炎性T淋巴細胞的活化、增殖和分化成熟以及改變免疫細胞分泌的細胞因子，使其傾向于抗炎和免疫耐受功能，也可以促進抑制炎癥反應的T淋巴細胞的優(yōu)勢分化，以幫助機體恢復免疫平衡[1]。以T淋巴細胞亞群介導的免疫功能紊亂在尋常型銀屑病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，近年研究顯示輔助性T細胞17(T helper cell 17,Th17)和調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory cells,Treg)兩種不同的T細胞亞群在銀屑病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[2-3]。目前，有文獻報道，尋常型銀屑病患者骨髓和皮膚MSC對T淋巴細胞的免疫調(diào)控作用減弱[4-5]，而筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)尋常型銀屑病患者AMSCs表達及分泌免疫抑炎因子和促炎因子的能力減弱，可能對T淋巴細胞的免疫調(diào)控功能減弱[6]。因此，本研究以尋常型銀屑病患者AMSCs和外周血淋巴細胞為研究對象，采用AMSCs與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)方式，探討患者AMSCs對外周血Treg和Th17細胞亞群比例的作用，以及對這兩種T細胞亞群免疫功能的影響，以期探索尋常型銀屑病T淋巴細胞免疫紊亂的發(fā)生機制，為臨床治療尋常型銀屑病提供理論基礎(chǔ)。

資料和方法

資料標本來源：(1)脂肪間充質(zhì)干細胞：收集尋常型銀屑病患者3 例，均經(jīng)中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院臨床檢查確診為尋常型銀屑病，年齡 15～65 歲，病程6個月～10 年，選取健康志愿者3 名作為對照組。脂肪組織標本均采自腹部脂肪，經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院整形外科進行抽脂手術(shù)獲取。所有患者取材前均征得本人同意，并簽署知情同意書。(2)外周血淋巴細胞：2016年5月至2017年2月在中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院皮膚科就診的進展期尋常型銀屑病患者4例，年齡15～65 歲，病程6個月～10 年。納入標準：就診前1個月未系統(tǒng)使用過生物制劑及免疫抑制劑，包括維甲酸類藥物和免疫抑制劑等。排除標準：①患有其他自身免疫性疾病以及其他重大疾病。②合并其他內(nèi)、外科疾病。

AMSCs的分離、培養(yǎng)采集患者和正常人脂肪組織各50 ml，提取AMSCs，培養(yǎng)于AMSCs專用培養(yǎng)基，傳代培養(yǎng)至第3(P3)代備用。

外周血淋巴細胞的分離、培養(yǎng)用抗凝管采集患者外周血10 ml，淋巴細胞分離液分離外周血淋巴細胞待用。

細胞培養(yǎng)AMSCs 與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)：設(shè)置患者外周血淋巴細胞單獨培養(yǎng)組、患者AMSCs與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組、健康人AMSCs與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組，將培養(yǎng)至P3的 AMSCs 鋪板，待細胞完全貼壁后，將外周血淋巴細胞種植于預先鋪有 AMSCs的6孔板中，外周血淋巴細胞∶AMSCs比例為 10∶1，于PMI1640培養(yǎng)液[內(nèi)含10%胎牛血清、雙抗、白介素-2(interleukin-2，IL-2)]中培養(yǎng)，37 ℃，5% CO2，混合培養(yǎng) 48 h后待測。

Th17和Treg細胞所占比例檢測收集AMSCs 與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)體系中外周血淋巴細胞，按照Th17和Treg 細胞試劑盒(達科為生物技術(shù)股份有限公司)中說明書進行操作，用流式細胞儀檢測Th17和Treg 細胞所占比例，CFlow軟件分析。

實時熒光定量PCR檢測Trizol 法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按實時熒光定量 PCR試劑盒中說明書操作，在 PCR儀上進行實時定量檢測[cDNA合成相關(guān)試劑、實時熒光定量 PCR試劑盒等由寶生物工程(大連)有限公司提供]。對實驗結(jié)果采用 2-[△△ct]的方法進行分析。

酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測細胞因子的表達收集AMSCs 與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)中上清液，按照酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(萊茲生物科技有限公司)中說明書進行操作，在酶標儀上檢測 450 nm處吸光度值，計算標本濃度。

統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行分析處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示,組間比較符合正態(tài)分布者采用方差分析，不符合正態(tài)分布者采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

患者AMSCs對外周血Treg細胞的增殖作用AMSCs與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)2 d后，采用流式細胞術(shù)分別檢測各培養(yǎng)組中Treg細胞比例，結(jié)果顯示，單培養(yǎng)外周血淋巴細胞組Treg細胞占總淋巴細胞的比例為(1.0±0.1)%，健康人AMSCs與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組Treg細胞占總淋巴細胞的比例為(3.2±0.5)%，患者AMSCs與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組Treg細胞占總淋巴細胞的比例為(1.3±0.2)%，與外周血淋巴細胞單培養(yǎng)組比較，健康人AMSCs促進Treg細胞增殖，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.001)，患者AMSCs有促進Treg細胞增殖的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.485)。與健康人AMSCs相比，患者AMSCs促進Treg細胞增殖的作用明顯減弱(P=0.001)(圖1)。

患者AMSCs對外周血Th17細胞的抑制作用AMSCs與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)2 d后，采用流式細胞術(shù)分別檢測各培養(yǎng)組中Th17細胞比例，結(jié)果顯示，單培養(yǎng)外周血淋巴細胞組Th17細胞占總淋巴細胞的比例為(1.1±0.1)%，健康人AMSCs與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組Th17細胞占總淋巴細胞的比例為(0.8±0.3)%，患者AMSCs與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組Th17細胞占總淋巴細胞的比例為(0.8±0.3)%，與外周血淋巴細胞單培養(yǎng)組比較，患者AMSCs與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組和健康人AMSCs與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組Th17細胞比例具有下降趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義，且患者AMSCs與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組Th17細胞比例與健康人AMSCs與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組比較差異無統(tǒng)計學意義(圖2)。

Treg:調(diào)節(jié)性T細胞；PBL：外周血淋巴細胞；AMSCs：脂肪間充質(zhì)干細胞；PE：藻紅蛋白；Foxp3:叉頭轉(zhuǎn)錄因子3

Treg:regulatory cells；PBL：peripheral blood lymphocyte；AMSCs：adipose mesenchymal stem cells；PE：phycoerythrin；Foxp3:transcription factor forkhead box p3

A.PBL單培養(yǎng)組；B.患者AMSCs+PBL共培養(yǎng)組;C.健康人AMSCs+PBL共培養(yǎng)組

A.PBL culture alone group；B.psoriasis AMSCs+PBL co-culture group;C.healthy people AMSCs+PBL co-culture group

圖1流式細胞術(shù)檢測外周血Treg細胞占CD4細胞比例

Fig1Proportion of Treg cells in CD4+cells by flow cytometry

Th17:輔助性T細胞17；IL：白細胞介素；APC：別藻青蛋白；SSC-A：側(cè)向角散射-A

Th17:T helper cell 17；IL：interleukin；APC：allophycocyanin；SSC-A：side scatter-A

A.PBL單培養(yǎng)組；B.患者AMSCs+PBL共培養(yǎng)組;C.健康人AMSCs+PBL共培養(yǎng)組

A.PBL culture alone group；B.psoriasis AMSCs+PBL co-culture group;C.healthy people AMSCs+PBL co-culture group

圖2流式細胞術(shù)檢測Th17細胞占CD4細胞比例

Fig2Proportion of Th17 cells in CD4+cells by flow cytometry

患者AMSCs對外周血淋巴細胞抑炎相關(guān)因子的促進作用AMSCs與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)2 d后，采用實時熒光定量PCR和ELISA檢測各培養(yǎng)組外周血淋巴細胞表達和分泌抑炎細胞因子IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)及Treg細胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3情況，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示：健康人AMSCs與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組中抑炎細胞因子IL-10、TGF-β及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的mRNA與外周血淋巴細胞單培養(yǎng)組相比較呈高表達，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.03，P=0.00，P=0.02)；患者AMSCs與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組中IL-10、TGF-β、Foxp3的mRNA表達與與外周血淋巴細胞單培養(yǎng)組比較有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義；患者AMSCs對外周血淋巴細胞表達TGF-β及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA的促進作用比健康人AMSCs明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.00，P=0.03)，對外周血淋巴細胞IL-10 mRNA的表達有促進趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.09)(表1)。同時，ELISA檢測結(jié)果顯示，患者與健康人AMSCs分泌的IL-10分別為(0.4±0.1)ng/μl、(0.5±0.1)ng/μl,分泌TGF-β分別為(573.5±70.0)ng/μl、(786.3±274.8)ng/μl。與外周血淋巴細胞單培養(yǎng)組淋巴細胞分泌的IL-10、TGF-β水平比較，患者AMSCs與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組淋巴細胞分泌的抑炎細胞因子IL-10水平有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.54)，TGF-β水平上升(P=0.00)；與健康人AMSCs與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組比較，患者AMSCs與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組淋巴細胞分泌抑炎細胞因子IL-10、TGF-β的能力有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.07，P=0.16)(表1)。

患者AMSCs對外周血淋巴細胞促炎相關(guān)因子的抑制作用AMSCs與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)2 d后，采用實時熒光定量PCR和ELISA檢測各培養(yǎng)組中外周血淋巴細胞表達和分泌促炎細胞因子IL-17、IL-23及Th17的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子維A酸相關(guān)孤獨受體γt(retinoid-related orphan nuclear receptor γt,RORγt)情況，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，患者AMSCs與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組促炎因子IL-17、IL-23的mRNA和健康人AMSCs與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組IL-17、IL-23的mRNA與外周血淋巴細胞單培養(yǎng)組比較差異無統(tǒng)計學意義，患者AMSCs與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組RORγt的mRNA和健康人AMSCs與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組RORγt的mRNA與外周血淋巴細胞單培養(yǎng)組比較呈低表達(P=0.00)；與健康人相比，患者AMSCs與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組促炎細胞因子IL-17、IL-23及轉(zhuǎn)錄因子RORγt的mRNA水平無變化(表2)。同時，ELISA檢測結(jié)果顯示，患者和健康人不分泌IL-17，分泌IL-23分別為(2.9±0.4)ng/μl、(6.1±4.2)ng/μl。與外周血淋巴細胞單培養(yǎng)組淋巴細胞分泌的IL-23、IL-17水平比較，患者AMSCs與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組促炎細胞因子IL-23和健康人AMSCs與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組IL-23水平具有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，患者AMSCs與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組IL-17水平無變化，健康人AMSCs與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組IL-17水平具有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義；與健康人比較，患者AMSCs與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)組外周血淋巴細胞分泌的促炎細胞因子IL-23、IL-17水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

表 1 qRT-PCR和ELISA檢測AMSCs對外周血淋巴細胞抑炎相關(guān)因子表達和分泌的影響Table 1 Effect of AMSCs on expression and secretion of anti-inflammatory cytokines in peripheral blood lymphocytes by qRT-PCR and

qRT-PCR：實時熒光定量聚合酶鏈式反應；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附劑測定法；TGF-β:轉(zhuǎn)化生長因子-β；P1：患者AMSCs+PBL共培養(yǎng)組與PBL單培養(yǎng)組比較；P2：健康人AMSCs+PBL共培養(yǎng)組與PBL單培養(yǎng)組比較；P3：患者與健康人AMSCs+PBL共培養(yǎng)組比較

qRT-PCR：quantitative real-time polymerase chain reaction；ELISA：enzyme-linked immunosorbent assay；TGL-β:transforming growth factor-β；P1：psoriasis AMSCs+PBL co-culture group compared with PBL culture alone group；P2：healthy people AMSCs+PBL co-culture group compared with PBL culture alone group；P3：psoriasis AMSCs+PBL co-culture group compared with healthy people AMSCs+PBL co-culture group

表 2 qRT-PCR 和ELISA檢測AMSCs對外周血淋巴細胞促炎相關(guān)因子表達和分泌的影響Table 2 Effect of AMSCs on expression and secretion of pro-inflammatory related factors in peripheral blood lymphocytes by qRT-PCR 和

RORγt:維A酸相關(guān)孤獨受體γt；P1：患者AMSCs+PBL共培養(yǎng)組與PBL單培養(yǎng)組比較；P2：健康人AMSCs+PBL共培養(yǎng)組與PBL單培養(yǎng)組比較；P3：患者與健康人AMSCs+PBL共培養(yǎng)組比較

RORγt:retinoid-related orphan nuclear receptor γt;P1：psoriasis AMSCs+PBL co-culture group compared with PBL culture alone group；P2：healthy people AMSCs+PBL co-culture group compared with PBL culture alone group；P3：psoriasis AMSCs+PBL co-culture group compared with healthy people AMSCs+PBL co-culture group

討 論

尋常型銀屑病是一種慢性、炎癥性、免疫性皮膚病，其病理機制錯綜復雜，目前普遍認為，尋常型銀屑病的發(fā)病機制與免疫紊亂密切相關(guān)，目前對其的研究聚焦于Th17、Treg及二者分泌的眾多細胞因子。Th17 是一種新近發(fā)現(xiàn)的促炎性細胞，過度活化的 Th17 釋放IL-17、IL-23 等多種炎癥細胞因子，并與樹突狀細胞、角質(zhì)形成細胞等共同作用，形成細胞因子瀑布，連級放大炎癥反應，最終誘導角質(zhì)形成細胞過度增殖、中性粒細胞聚集。研究表明尋常型銀屑病患者外周血中Th17 細胞比例升高，且尋常型銀屑病患者外周血中 IL-17、IL-23水平顯著高于健康人[7-9]。相反，Treg 細胞主要通過分泌 IL-10 和 TGF-β等抑炎性細胞因子，在維持機體免疫耐受、機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[10]。Yan等[11]發(fā)現(xiàn)進展期尋常型銀屑病患者Treg 細胞數(shù)目降低，而靜止期和正常對照組外周血Treg 細胞數(shù)目無變化。

間充質(zhì)干細胞是一種具有自我復制功能的成體干細胞，對T淋巴細胞具有獨特的免疫調(diào)控功能，可以通過細胞與細胞直接接觸和分泌IL-10、吲哚胺2 3-雙加氧酶 和 TNF-α 等多種可溶性因子抑制促炎性 T 淋巴細胞的活化、增殖和分化成熟以及改變免疫細胞分泌的細胞因子，使其傾向于抗炎和免疫耐受功能，也可以促進抑制炎癥反應的T 淋巴細胞的優(yōu)勢分化，以幫助機體恢復免疫平衡[1]，有研究顯示，人骨髓來源的MSCs可下調(diào)Th17 特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt 的表達，調(diào)節(jié)Th17的功能[12]。同時有研究表明，尋常型銀屑病患者皮損組織來源的MSCs在體外與外周血 T 細胞共同培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)健康人皮膚組織來源的MSCs 對 T 細胞的增殖有抑制作用，但尋常型銀屑病患者體內(nèi)的MSCs 對 T 細胞增殖的抑制作用明顯減弱[13]。筆者在前期對健康人和尋常型銀屑病患者AMSCs免疫功能的比較研究中發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)時，尋常型銀屑病AMSCs較健康人AMSCs分泌的抑炎因子IL-10、吲哚胺2 3-雙加氧酶、TGF-β及Toll樣受體3等下降，腫瘤壞死因子-α、干擾素-Y等促炎細胞因子增強，尋常型銀屑病AMSCs較健康人AMSCs免疫調(diào)控能力減弱[6]。

本研究通過AMSCs與患者外周血淋巴細胞共培養(yǎng)，探究患者AMSCs對外周血淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)作用。研究顯示健康人和患者AMSCs可以促進Treg淋巴細胞增殖，但與健康人相比，患者AMSCs促進Treg淋巴細胞增殖的能力明顯減弱，同時，患者AMSCs促進Treg淋巴細胞的核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及外周血淋巴細胞中IL-10和TGF-β表達及分泌的能力下降。推測可能是患者AMSCs表達和分泌抑炎因子的能力下降，導致促進Treg淋巴細胞優(yōu)勢分化的能力減弱有關(guān)。另外，健康人和患者AMSCs都可以下調(diào)Th17淋巴細胞比例，但是患者AMSCs對外周血Th17淋巴細胞比例的改變與健康人AMSCs相比無影響，患者和健康人AMSCs抑制Th17淋巴細胞轉(zhuǎn)錄因子RORγt及外周血淋巴細胞中促炎因子IL-17、IL-23表達和分泌的作用不明顯，且兩組細胞的作用無差異，推測患者AMSCs對Th17淋巴細胞的免疫調(diào)控作用影響較弱。

綜上，本研究表明與健康人相比，尋常型銀屑病患者AMSCs調(diào)控外周血Treg淋巴細胞免疫抑炎功能的能力明顯減弱，而對外周血Th17淋巴細胞的促炎功能無影響，但因本研究樣本量較小，且患者病情嚴重程度有差異等原因，可能致使研究有偏倚，另外，患者AMSCs具體如何參與調(diào)控尋常型銀屑病外周血淋巴細胞免疫功能紊亂的病理機制尚不清楚，因此，有待進一步獲得更多病例進行深入研究。