丁振華，蘇芳莉,2①，孫 權(quán)

1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)水利學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.遼寧雙臺(tái)河口濕地生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站，遼寧 盤錦 124112；3.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

重金屬鎘是環(huán)境中的持久性污染物，具有隱蔽性、滯后性、微量致毒性以及強(qiáng)移動(dòng)性等污染特點(diǎn)[1]，在植物根、莖、葉及果實(shí)中的大量累積不僅會(huì)影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，而且還會(huì)隨著食物鏈進(jìn)入人體，危害人類健康[2-3]。而蘆葦作為重金屬鎘的超富集植物，通過(guò)獨(dú)特的生理代謝過(guò)程，經(jīng)過(guò)溶解、沉淀、凝聚、絡(luò)合、吸附等反應(yīng)，可以將鎘以不同離子形態(tài)賦存積累[4-5]，從而減少鎘對(duì)植物毒害作用并提高植物耐受性。當(dāng)鎘與蛋白質(zhì)結(jié)合形成螯合物時(shí)，可限制鎘在植物體內(nèi)的移動(dòng)性，使鎘不能再移動(dòng)和釋放，因此鎘在植物體內(nèi)被限制運(yùn)輸?shù)角o葉，絕大部分保留在根部。蘆葦(Phragmitesaustralis)對(duì)鎘的吸收與鎘在蘆葦體內(nèi)各部位分配以及鎘與蘆葦體內(nèi)物質(zhì)的結(jié)合形態(tài)等因素有關(guān)[6]。在蘆葦對(duì)鎘的富集過(guò)程中，谷胱甘肽起到十分重要的作用[7]，谷胱甘肽不僅能直接結(jié)合重金屬離子，而且還是植物絡(luò)合素的合成前體。植株體內(nèi)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是谷胱甘肽生物合成中的關(guān)鍵酶[2]，決定了谷胱甘肽生物合成的速率和數(shù)量，對(duì)蘆葦富集積累重金屬鎘的能力具有巨大影響。

作為鎘的超富集植物，蘆葦是遼河濕地的優(yōu)勢(shì)物種，對(duì)于濕地水質(zhì)凈化，保障遼河口濕地瀕危物種棲息地水質(zhì)質(zhì)量具有重要的生態(tài)作用，蘆葦通過(guò)吸收鎘等重金屬，并其保留在蘆葦根中，使?jié)竦氐闹亟饘俚玫焦潭ǎ瑴p小對(duì)周邊動(dòng)植物及環(huán)境的威脅。為探究鎘脅迫下蘆葦對(duì)氯化鈉提取態(tài)鎘(SCd)的富集規(guī)律及螯合吸附鎘過(guò)程中γ-GCS對(duì)重金屬鎘脅迫的反應(yīng)，通過(guò)不同濃度鎘溶液對(duì)蘆葦進(jìn)行脅迫培養(yǎng)，分析蘆葦根莖葉中SCd的含量特征和γ-GCS活性變化，揭示蘆葦對(duì)鎘的富集規(guī)律，為遼河口濕地有效凈化重金屬污染選育優(yōu)良的蘆葦品種，提高河口區(qū)重金屬污染的凈化效率提供理論依據(jù)，為保護(hù)遼河口濕地生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定及瀕危物質(zhì)棲息地安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2016年4—11月在沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)水利綜合試驗(yàn)場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行。將蘆葦種植于白塑料桶(直徑40 cm，高40 cm)中，每個(gè)生長(zhǎng)期選擇生長(zhǎng)狀況基本一致的植株進(jìn)行取樣。試驗(yàn)共設(shè)置6組，第1～5組分別灌溉不同濃度CdCl2溶液(0.5、1.0、2.0、3.0和50 mmol·L-1)進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)計(jì)5桶蘆葦同時(shí)灌溉，分別用于蘆葦5個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的樣品采集，第6組為全生長(zhǎng)期清水灌溉培養(yǎng)。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，以清水灌溉和CdCl2溶液灌溉做對(duì)照，共布設(shè)90桶。

按照《主要作物生育時(shí)期劃分及觀測(cè)標(biāo)準(zhǔn)》中劃分作物生育階段的標(biāo)準(zhǔn)，將蘆葦整個(gè)生長(zhǎng)期劃分為發(fā)芽期、展葉期、拔節(jié)期、抽穗期和成熟期5個(gè)階段。其中，發(fā)芽期為4月末—5月中旬；展葉期為5月中旬—6月下旬；快速生長(zhǎng)期為7月上旬—8月中旬；抽穗期為8月中旬—9月上中旬；成熟期為9月中旬—10月上中旬。

1.2 試驗(yàn)材料及裝置

供試植物蘆葦于2015年4月采自遼寧遼河口國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)試驗(yàn)區(qū)。挖取帶有健康芽眼且未萌發(fā)的蘆葦根狀莖，每段截成約20 cm，將根外部包適量土壤，裝入麻袋，灑適量清水以保證根系濕潤(rùn)，運(yùn)回試驗(yàn)地，立即移栽試驗(yàn)池的土壤中，定時(shí)澆水以保證成活。經(jīng)1 a無(wú)污染培養(yǎng)后移栽到沙基培養(yǎng)塑料桶(直徑40 cm、高40 cm)中。

1.3 鎘溶液配置及灌溉

在每個(gè)生長(zhǎng)期取樣前一周，將分析純氯化鎘配置的濃度為0.5、1.0、2.0、3.0和5.0 mmol·L-1的CdCl2溶液分別灌入蘆葦桶內(nèi)，每桶均灌入10 L溶液，剩余由清水灌溉補(bǔ)充保持土面以上5 m水層以保障蘆葦正常生長(zhǎng)。以全生長(zhǎng)期灌溉清水的蘆葦和5個(gè)生長(zhǎng)期均灌入鎘溶液的蘆葦作為對(duì)照。鎘溶液灌入7 d后，于當(dāng)天13：00—16：00取樣并做好試驗(yàn)前的樣品處理。

1.4 樣品采集及處理方法

(1)取樣方法：選擇長(zhǎng)勢(shì)相近的3株植株，小心截取蘆葦莖葉并挖出地下根部，用蒸餾水沖洗干凈，吸水紙吸干表面水分，放入自封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)Cd含量的測(cè)定：蘆葦總鎘含量測(cè)定采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(iCAP-7000)測(cè)定；蘆葦鎘形態(tài)及含量測(cè)定采取分級(jí)萃取法，分別稱取2.00 g蘆葦根、莖和葉片新鮮樣品，剪成1～2 mm2的碎片，置于燒杯中，加入37.5 mL提取劑，在30 ℃恒溫箱中放置過(guò)夜(17～18 h)，次日回收提取液，再加入同樣體積該提取液，浸取2 h后再回收提取液，重復(fù)2次，即在24 h內(nèi)提取4次，集4次提取液(共150 mL)于燒杯中，消煮測(cè)定。樣品消煮后用φ=10%硝酸定容，采用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定。

(3)γ-GCS活性的測(cè)定：選取蘆葦健康植株，沒(méi)有變色，沒(méi)有蟲咬、沒(méi)有水漬變壞的新生根莖葉部位，準(zhǔn)確稱取0.1 g放入研缽中，液氮快速研磨至粉碎，加入磷酸緩沖液，充分振蕩后，離心提取上清液，使用ELISA試劑盒測(cè)定酶活性。酶活性單位定義為：在特定的條件下，1 min能轉(zhuǎn)化1 μmoL底物的酶量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對(duì)蘆葦根莖葉中的氯化鈉提取態(tài)鎘的含量采用Excel 2013 和SPSS 19.0軟件對(duì)每個(gè)生長(zhǎng)期的蘆葦根部的鎘含量進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，并對(duì)鎘溶液濃度與蘆葦根莖葉中γ-GCS活性間的關(guān)系進(jìn)行回歸分析。

對(duì)蘆葦γ-GCS活性基于邏輯斯特曲線進(jìn)行分析，即：

(1)

式(1)中,Y為γ-GCS活性，U·mL-1；r為蘆葦γ-GCS活性的內(nèi)稟增長(zhǎng)率，即γ-GCS活性最大增長(zhǎng)速率，%；k為環(huán)境容納量，即環(huán)境條件所能容許的γ-GCS最大活性，U·mL-1；t為生長(zhǎng)時(shí)間，d；A為與初始條件有關(guān)的常數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆葦根莖葉中氯化鈉提取態(tài)鎘(SCd)含量

如圖1所示，鎘溶液灌溉條件下蘆葦根內(nèi)SCd的單位積累量變化明顯，各濃度間差異顯著，且均與對(duì)照存在極顯著差異(P<0.01)。在同一生長(zhǎng)期內(nèi)，不同濃度鎘溶液灌溉下蘆葦根內(nèi)SCd的單位積累量會(huì)隨著鎘濃度的變大而增加，除5.0 mmol·L-1條件下之外，各生長(zhǎng)期均表現(xiàn)為3.0 mmol·L-1鎘溶液灌溉條件下SCd單位積累量最大，是2.0 mmol·L-1條件下的1.3～1.8倍，是1.0 mmol·L-1條件下的2～4倍，是0.5 mmol·L-1條件下的3～8倍。而隨著蘆葦生長(zhǎng)，同一濃度灌溉條件下蘆葦根內(nèi)SCd的單位積累量也會(huì)逐漸增加。其中5.0 mmol·L-1鎘溶液灌溉條件下根內(nèi)SCd的單位積累量在展葉期增加迅速，是發(fā)芽期鎘單位積累量的6.1倍，從展葉期到成熟期SCd的單位積累量增加緩慢且在快速生長(zhǎng)期之后略低于3.0 mmol·L-1條件下SCd的單位積累量；0～3.0 mmol·L-1鎘濃度灌溉時(shí)，SCd的單位積累量在快速生長(zhǎng)期之前均呈上升趨勢(shì)，濃度越大增長(zhǎng)越快，快速生長(zhǎng)期之后根中SCd的單位積累量增加緩慢，到成熟期時(shí)SCd的單位積累量達(dá)到最大，成熟期時(shí)3.0 mmol·L-1條件下根中SCd的單位積累量為3 984.16 mg·kg-1。

鎘溶液灌溉條件下蘆葦莖內(nèi)SCd的單位積累量變化明顯，各濃度間差異顯著，且均與對(duì)照存在極顯著差異(P<0.01)。鎘溶液灌溉下蘆葦莖內(nèi)SCd的單位積累量會(huì)隨著鎘濃度的提高和蘆葦生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。同一生長(zhǎng)期內(nèi)，各濃度灌溉條件下蘆葦莖內(nèi) SCd的單位積累量均表現(xiàn)為高濃度大于低濃度，各生長(zhǎng)期表現(xiàn)為5.0 mmol·L-1鎘溶液灌溉條件下SCd的單位積累量最大，是3.0 mmol·L-1條件下的1～1.5倍，是2.0 mmol·L-1條件下的1.3～2.0倍，是1.0 mmol·L-1條件下的1.5～3.0倍，是0.5 mmol·L-1條件下的3～5倍。同一濃度灌溉條件下，蘆葦莖內(nèi)SCd的單位積累量從大到小均表現(xiàn)為成熟期>抽穗期>快速生長(zhǎng)期>展葉期>發(fā)芽期；不同濃度條件下蘆葦莖內(nèi)SCd的單位積累量的增長(zhǎng)速度也隨濃度的提高而增加，即灌溉濃度越大SCd的單位積累量增加越快；在蘆葦生長(zhǎng)到快速生長(zhǎng)期之后，莖內(nèi)SCd的單位積累量增長(zhǎng)速度開始變緩，成熟期時(shí)蘆葦莖內(nèi)SCd的單位積累量與快速生長(zhǎng)期相比增加極少。

圖1 蘆葦根莖葉中氯化鈉提取態(tài)鎘(SCd)含量Fig.1 The content of sodiumchloride-extraction cadmium (SCd) in Phragmites australis

鎘溶液灌溉條件下蘆葦葉內(nèi)SCd的單位積累量變化明顯，各濃度間差異顯著，且均與對(duì)照存在極顯著差異(P<0.01)。在同一生長(zhǎng)期內(nèi)，不同濃度鎘溶液灌溉下蘆葦葉內(nèi)SCd的單位積累量會(huì)隨著鎘濃度的變大而增加，除5.0 mmol·L-1條件下之外，各生長(zhǎng)期均表現(xiàn)為3.0 mmol·L-1鎘溶液灌溉條件下SCd的單位積累量最大，是2.0 mmol·L-1條件下的1～1.5倍，是1.0 mmol·L-1條件下的1.5～2.5倍，是0.5 mmol·L-1條件下的3～6倍。而隨著蘆葦生長(zhǎng)，同一濃度灌溉條件下蘆葦葉內(nèi)SCd的單位積累量也會(huì)逐漸增加。其中5.0 mmol·L-1鎘溶液灌溉條件下葉內(nèi)鎘SCd的單位積累量在快速生長(zhǎng)期前增加迅速，從快速生長(zhǎng)期到成熟期SCd的單位積累量則增加緩慢，而且在快速生長(zhǎng)期之后就低于3.0 mmol·L-1條件下SCd的單位積累量，在成熟期甚至低于2.0 mmol·L-1條件下SCd的單位積累量。0～3.0 mmol·L-1鎘濃度灌溉時(shí)，SCd的單位積累量在抽穗期之前均呈上升趨勢(shì)，濃度越大增長(zhǎng)越快，快速生長(zhǎng)期之后葉中SCd的單位積累量增加緩慢，到成熟期時(shí)達(dá)最大，成熟期時(shí)3.0 mmol·L-1條件下葉中SCd的單位積累量為824.19 mg·kg-1。

2.2 蘆葦根莖葉中氯化鈉形態(tài)鎘積累量所占比例

由圖2可知，在不同濃度鎘溶液灌溉條件下，各生長(zhǎng)期蘆葦根部SCd的積累量均大于莖部和葉部。成熟期時(shí)，根部最大積累量為3 984.16 mg·kg-1，是莖部的7.33倍、葉部的4.83倍。

圖2 蘆葦各部位氯化鈉提取態(tài)鎘(SCd)所占比例Fig.2 The content of cadmium (SCd) in Phragmites australis

蘆葦根部SCd積累量的共同特征是： SCd的積累量占各種形態(tài)鎘總積累量的比例隨著生長(zhǎng)期的變化微小，隨濃度升高的變化明顯。各濃度灌溉條件下，5.0 mmol·L-1灌溉組中SCd的積累量所占總鎘的比例最高，成熟期時(shí)達(dá)57.15%，其次為3.0 mmol·L-1灌溉組，成熟期時(shí)所占比例為54.69%；0.5 mmol·L-1灌溉組中SCd的積累量所占總鎘的比例最低，成熟期時(shí)為46.64%。蘆葦莖部SCd積累量所占總鎘的比例隨灌溉濃度和生長(zhǎng)期的變化無(wú)明顯特征，均在40%浮動(dòng)；蘆葦葉部SCd積累量所占總鎘的比例隨灌溉濃度和生長(zhǎng)期的變化亦無(wú)明顯特征，均在43%上下浮動(dòng)。

2.3 蘆葦根莖葉中γ-GCS活性的變化特征

蘆葦根莖葉中γ-GCS活性的變化特征如圖3所示。

圖3 蘆葦根莖葉中γ-GCS活性Fig.3 The γ-GCS Activities in Phragmites australis

在不同濃度鎘溶液灌溉條件下，蘆葦根莖葉中γ-GCS活性均有明顯增加。除成熟期外，在各個(gè)生長(zhǎng)期中，蘆葦根莖葉中γ-GCS活性均會(huì)隨著灌溉濃度升高而增加，且均在5.0 mmol·L-1灌溉條件出現(xiàn)活性最大值；同一濃度灌溉條件下，蘆葦根莖葉中γ-GCS活性則會(huì)隨著蘆葦生長(zhǎng)而呈先增高后降低的趨勢(shì)，其中根中γ-GCS活性在快速生長(zhǎng)期出現(xiàn)最大值，5.0 mmol·L-1灌溉條件下根中γ-GCS活性為對(duì)照組的5.8倍；莖中γ-GCS活性在展葉期出現(xiàn)最大值，5.0 mmol·L-1灌溉條件下莖中γ-GCS活性為對(duì)照組的4.2倍；葉中γ-GCS活性在抽穗期出現(xiàn)最大值，γ-GCS活性為對(duì)照組的3.5倍。

2.4 蘆葦對(duì)γ-GCS活性的動(dòng)力學(xué)分析

因清水灌溉下蘆葦γ-GCS活性差異不顯著，故僅對(duì)鎘溶液灌溉下蘆葦γ-GCS活性基于邏輯斯特曲線做回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同鎘濃度下γ-GCS活性的回歸方程及變化參數(shù)Table 1 Regression equation and variation parameters of γ-GCS activity under different cadmium concentrations

從表1可知，不同濃度鎘溶液灌溉條件下蘆葦γ-GCS活性的內(nèi)稟增長(zhǎng)率(r值)變化不大，因此可將r值看作是一個(gè)不受鎘濃度影響的常數(shù)，而不同濃度鎘溶液灌溉對(duì)于蘆葦γ-GCS活性的環(huán)境容納量影響則較大，鎘濃度越高，蘆葦γ-GCS活性的容納量越高。

3 討論

植物遭受重金屬脅迫時(shí)會(huì)通過(guò)自身調(diào)節(jié)來(lái)減少金屬對(duì)自身生長(zhǎng)的影響[8-10]。進(jìn)入蘆葦體內(nèi)的鎘對(duì)蛋白質(zhì)或其他有機(jī)化合物中的巰基有很強(qiáng)的親合力，在作物體內(nèi)鎘常與蛋白質(zhì)結(jié)合[11-12]，這種結(jié)合形態(tài)既會(huì)減少以自由態(tài)存在的鎘離子，使其有效性和移動(dòng)性降低；但其與體內(nèi)功能蛋白相結(jié)合，對(duì)蛋白功能發(fā)生干擾，造成植物生理、生化代謝過(guò)程紊亂[13]。ANTONOVICS等[14]研究發(fā)現(xiàn)，與植物中蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)的鎘常以SCd形式存在。楊居榮等[11]通過(guò)對(duì)冬小麥、旱稻等8種作物的篩選研究發(fā)現(xiàn)，8種作物體內(nèi)以SCd形式結(jié)合的鎘含量均占很大比例；在香菇和大豆中亦是SCd形式為主[15]。筆者研究結(jié)果表明蘆葦在受到Cd脅迫時(shí)，進(jìn)入蘆葦體內(nèi)的絕大部分Cd被富集在根部，而遷移至其他部位的較少，而在蘆葦不同部位內(nèi)均以NaCl提取態(tài)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，這一結(jié)果與YE等[16]和江行玉等[17]的結(jié)論一致。灌溉鎘濃度增加時(shí)，蘆葦植株根、莖、葉的SCd積累量呈先增加后減少的趨勢(shì)，同時(shí)蘆葦γ-GCS活性也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，表明一定濃度鎘脅迫會(huì)促進(jìn)蘆葦對(duì)鎘吸收富集，但過(guò)量的鎘將會(huì)對(duì)蘆葦?shù)恼ＩL(zhǎng)代謝造成影響[18]。同時(shí)，根據(jù)根莖葉部位之間SCd的積累量變化及蘆葦吸收總鎘比例的分析發(fā)現(xiàn)，在Cd脅迫下蘆葦體內(nèi)不同形態(tài)鎘的積累量均有增加，其中SCd的增加最顯著，正是由于這種增加，使得蘆葦富集鎘的總量增加。因此在以蘆葦為主的濕地中，蘆葦富集鎘后主要集中在根部，減少了濕地生產(chǎn)生活中鎘的危害，以保證濕地生態(tài)系中動(dòng)植物的正常生長(zhǎng)。對(duì)蘆葦體內(nèi)鎘結(jié)合蛋白的產(chǎn)生及去向以及多年灌溉鎘溶液對(duì)蘆葦遺傳物質(zhì)的影響及優(yōu)良蘆葦品種的篩選，仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)不同鎘溶液灌溉脅迫下各個(gè)時(shí)期蘆葦根莖葉不同部位中各種形態(tài)鎘的總積累量進(jìn)行對(duì)比可知，成熟期時(shí)根部的總鎘積累量最大，為3 984.16 mg·kg-1，是莖部的7.33倍，葉部的4.83倍。同時(shí)，蘆葦根部SCd占總鎘的比例隨灌溉濃度增加小幅度升高，成熟期時(shí)5.0 mmol·L-1灌溉下達(dá)到最大，為57.15%；而SCd在蘆葦莖部和葉部中占總鎘的比例隨灌溉濃度和生長(zhǎng)期的變化無(wú)明顯變化，生長(zhǎng)周期內(nèi)莖部SCd約占莖中總鎘含量的40%左右，葉部SCd約占葉中總鎘的43%左右。同時(shí)蘆葦各部位γ-GCS活性隨鎘濃度升高呈先升高后降低的趨勢(shì)。