徐倩玉 蘭 玉 劉嘉欣 周新宇 張 剛 鄭志富,*

1 浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 311300；2 浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,浙江杭州 311300；3 文登市佳禾種業(yè)有限公司,山東威海 264400

過去半個(gè)多世紀(jì),農(nóng)作物產(chǎn)量的提高取決于種質(zhì)資源的改良和作物栽培模式的改善。現(xiàn)代農(nóng)業(yè)化學(xué)諸如高效除草劑、殺蟲劑和殺菌劑的開發(fā)與利用給目前的作物栽培模式帶來新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)[1-3]。在一些國家,除草劑的應(yīng)用使雜草危害導(dǎo)致的產(chǎn)量損失下降20%以上[4],但是同類除草劑的長期使用卻引發(fā)抗性雜草的產(chǎn)生、后茬作物的藥害和土壤微生物種群的變化,并且在某種程度上因除草劑在土壤中的積累量增加影響諸如花生果實(shí)等地下收獲器官的品質(zhì)[5-10]。目前普遍認(rèn)為,要克服上述不良影響,必須輪換使用多種不同的高效除草劑,并創(chuàng)制對(duì)多種除草劑具有抗性的一系列作物品種,以及建立多樣化的作物栽培模式。

本文將從以下三方面分析國內(nèi)外研究現(xiàn)狀以及未來發(fā)展動(dòng)態(tài),以期為農(nóng)作物除草劑抗性性狀的遺傳改良和開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 AHAS 抑制劑類除草劑的類別與特點(diǎn)

AHAS 酶存在于所有已知的植物中,在植物的生長發(fā)育中起著重要作用[11]。它的活性隨植物的種類、器官和組織以及發(fā)育階段的不同而變化[12-14]。一般情況下,植物分生組織中AHAS 活性最高[15-16]。AHAS 作為除草劑的作用靶標(biāo),酶活性的喪失將導(dǎo)致植物中支鏈氨基酸(BCAAs,branched-chain amino acids)的合成受阻、植物代謝紊亂、最終植物生長受阻甚至死亡。此外,因?yàn)椴溉閯?dòng)物缺乏由AHAS 介導(dǎo)的支鏈氨基酸合成途徑,因此AHAS 抑制劑對(duì)人和動(dòng)物相對(duì)安全[17]。于是,AHAS 抑制劑的研究一直是高效除草劑開發(fā)領(lǐng)域最為活躍的熱點(diǎn)之一。

目前已被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的AHAS 抑制劑有5 類,分別為磺酰脲類(Sulfonylureas)、咪唑啉酮類(Imidazolinones)、三唑并嘧啶類(Triazolopyrimidines)、嘧啶硫代苯甲酸類(Pyrimidinylthiobenzoates)和磺酰胺羰基三唑啉酮類(Sulfonylamino carbonyltriazolinones)[18]。這些類別的除草劑彼此結(jié)構(gòu)不同,且與AHAS 的底物結(jié)構(gòu)缺乏相似性,因而目前普遍認(rèn)為AHAS 抑制劑不大可能與底物競爭活性位點(diǎn),應(yīng)屬AHAS 的非競爭性抑制劑[18]。除草劑活性的高低取決于對(duì)AHAS 的抑制強(qiáng)度,酵母和擬南芥等AHAS 的晶體結(jié)構(gòu)分析顯示磺酰脲類和咪唑啉酮類抑制劑與酶形成復(fù)合物后可阻斷酶的底物進(jìn)入酶活性位點(diǎn),從而起到了抑制作用,這很好地解析了為何除草劑的分子結(jié)構(gòu)與酶的底物不相似,卻仍然能夠有效地降低酶的活性。這些抑制劑具有專一性或選擇性強(qiáng)的特點(diǎn),能夠阻礙某些雜草的生長,但對(duì)特定農(nóng)作物沒有明顯的抑制活性,除草劑對(duì)雜草和作物的選擇性主要是由不同植物對(duì)降解除草劑和去毒化效力的差異以及吸收和輸導(dǎo)的差異導(dǎo)致的[18-20]。

2 AHAS 靶酶的特性及其在支鏈氨基酸合成中的作用

纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸,統(tǒng)稱為支鏈氨基酸(BCAAs),它們可在植物與微生物中合成,但動(dòng)物缺乏相應(yīng)的合成途徑。已知有4 種酶參與BCAAs的合成,即乙酰羥酸合酶(AHAS)、酮酸還原異構(gòu)酶、二羥酸脫水酶和轉(zhuǎn)氨酶。在植物研究領(lǐng)域,AHAS 又稱乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase,ALS),是BCAAs 生物合成途徑中催化第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶。它催化2 個(gè)平行反應(yīng),在纈氨酸和亮氨酸合成途徑中,此酶催化縮合反應(yīng)將2 分子丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰乳酸,行使乙酰乳酸合酶的功能；而在異亮氨酸的合成過程中,這種酶催化1 分子丙酮酸與1 分子丁酮酸生成2-乙酰羥基丁酸,故稱乙酰羥酸合酶[18,21]。

植物AHAS 是核基因編碼的質(zhì)體酶。在所有已知的植物中,AHAS 均含質(zhì)體向?qū)蛄?相應(yīng)地,人們只在植物細(xì)胞的質(zhì)體中檢測到AHAS 的活性。AHAS 酶由2 種亞基即催化亞基和調(diào)節(jié)亞基組成,在植物中AHAS 以八聚體形式存在,含4 個(gè)催化亞基和4 個(gè)調(diào)節(jié)亞基[22]。其中大亞基含ThDP,單獨(dú)存在時(shí)仍然具有活性,故被稱為催化亞基；小亞基自身無AHAS 活性,但起著調(diào)節(jié)催化亞基的作用,因此被稱為調(diào)節(jié)亞基。植物AHAS 的催化亞基和調(diào)節(jié)亞基是由不同基因編碼的,各自的基因數(shù)目隨物種而異。譬如,擬南芥含1 個(gè)編碼催化亞基的基因,甘藍(lán)型油菜則含5 個(gè)相應(yīng)基因?，F(xiàn)有大量鑒定催化亞基基因的報(bào)道,而調(diào)節(jié)亞基的基因克隆研究則局限于少量諸如煙草、擬南芥等物種[23-25]。

AHAS 的一個(gè)顯著特點(diǎn)是其活性受產(chǎn)物反饋抑制調(diào)控,小亞基在該過程中發(fā)揮重要作用。植物中的AHAS 調(diào)節(jié)亞基比細(xì)菌和真菌中的相對(duì)應(yīng)亞基要大很多,人們猜測它含2 個(gè)調(diào)節(jié)位點(diǎn),1 個(gè)用于亮氨酸,另1 個(gè)用于纈氨酸或異亮氨酸[18,23-24]。于是,每一個(gè)支鏈氨基酸均能反饋抑制植物AHAS 的活性,并且亮氨酸與纈氨酸或異亮氨酸一起具有協(xié)同反饋抑制效應(yīng)[15-16,18,24-26]。而細(xì)菌和酵母的AHAS 主要或只受纈氨酸反饋抑制調(diào)控[27]。此外,AHAS 酶活性還受輔助因子調(diào)控,二磷酸硫胺(ThDP,thiamine diphosphate)和Mg2+是該酶的輔助因子,ThDP 在Mg2+等二價(jià)金屬離子協(xié)助下結(jié)合到AHAS 的活性位點(diǎn)。但與大多數(shù)依賴于ThDP 的酶不同,植物AHAS酶還需要黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作為輔助因子才能行使其催化功能。

由于產(chǎn)物的負(fù)反饋機(jī)制調(diào)控著AHAS 酶活性,因此人們通常難以通過增強(qiáng)BCAAs 合成途徑中的酶基因表達(dá)水平提高植物組織中的BCAAs 含量。最近Chen 等通過遺傳篩選獲得擬南芥耐BCAAs 的突變體,并發(fā)現(xiàn)VALINE-TOLERANT 1(VAT1)位點(diǎn)的突變使其具有纈氨酸抗性。VAT1編碼AHAS 調(diào)節(jié)亞基,在幼嫩、快速生長組織高度表達(dá)。他們還發(fā)現(xiàn)表達(dá)突變型vat1基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥顯著增加纈氨酸的耐受性,并積累高水平BCAAs[25]。這一結(jié)果顯示通過打破AHAS 調(diào)節(jié)亞基的產(chǎn)物負(fù)反饋機(jī)制,人們有望提高作物中的BCAAs 含量。另一有趣發(fā)現(xiàn)是,水稻AHAS 催化亞基中某些位點(diǎn)的突變(W548L 或S627I)也能夠減弱產(chǎn)物的負(fù)反饋調(diào)控效應(yīng),并使BCAAs 的積累增加2～3 倍[26]。這些結(jié)果表明AHAS的2 個(gè)亞基同時(shí)參與產(chǎn)物的負(fù)反饋調(diào)控,有效地削弱這種機(jī)制可能成為提高作物中BCAAs 水平的一種手段。

3 植物中AHAS 抑制劑類除草劑的抗性機(jī)制

3.1 靶標(biāo)抗性

在農(nóng)業(yè)上,抗咪唑啉酮類或磺酰脲類除草劑的農(nóng)作物種質(zhì)創(chuàng)制取得了較大進(jìn)展,目前已獲得具有除草劑抗性的玉米、小麥、大麥、水稻、棉花、大豆、油菜、向日葵、甜菜、萵苣、番茄、煙草等作物的種質(zhì)資源[22,28-38]。在這些作物中,因AHAS 基因突變產(chǎn)生的除草劑抗性具有顯性或半顯性的特點(diǎn),且常呈單基因遺傳[22]。

現(xiàn)有大量證據(jù)顯示,多數(shù)情況下作物乃至雜草中AHAS 抑制劑除草劑抗性的形成與AHAS 催化亞基的某些氨基酸殘基改變引起植物對(duì)除草劑的敏感性下降或與AHAS 表達(dá)量的增加有關(guān),這種抗性屬于典型的AHAS 靶標(biāo)抗性(TSR,target-site-based resistance)。在很多具有除草劑抗性的植物中,AHAS催化亞基上的Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654 氨基酸殘基(相對(duì)于擬南芥AHAS 催化亞基的氨基酸位置)常被其他氨基酸殘基取代。氨基酸殘基Ala122、Pro197 和Ala205 位于酶的氮端,而Asp376、Trp574 和Ser653位于碳端[39]。Ala122、Ala205、Ser653、Gly654 殘基的取代使植物具有很高的咪唑啉酮類抗性[22,40-41],而Pro197 殘基的取代則賦予很高的磺酰脲類抗性,同時(shí)還使植物具有較高的三唑并嘧啶類和/或咪唑啉酮類抗性[30,42-47]。取代Trp574 殘基能使AHAS 酶具有很高的咪唑啉酮類、磺酰脲類和三唑并嘧啶類除草劑抗性[29,40,46,48-49],同時(shí)對(duì)嘧啶硫代苯甲酸類也有抗性。取代Arg377 殘基能使植物同時(shí)獲得三唑并嘧啶類、磺酰脲類以及磺酰胺羰基三唑啉酮類除草劑抗性。而取代Asp376 殘基則使植物對(duì)所有已知的AHAS 抑制劑產(chǎn)生抗性。這些發(fā)現(xiàn)說明,AHAS 催化亞基中的某些氨基酸很可能是多種除草劑的共同結(jié)合位點(diǎn),而某些氨基酸則專一影響特定種類除草劑與AHAS 酶的結(jié)合[18,50]。因此,AHAS 的某些氨基酸點(diǎn)突變只對(duì)單一或少數(shù)十分相似的抑制劑產(chǎn)生抗性,而某些特定氨基酸的點(diǎn)突變則能使此酶具有抗多種除草劑的功能。根據(jù)這一特性推測,使用同一類除草劑中的2 個(gè)或2 個(gè)以上AHAS 抑制劑篩選某一作物誘變?nèi)后w有可能獲得抗2 種或2 種以上除草劑的突變體,不過,這種假設(shè)是否成立尚需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3.2 非靶標(biāo)抗性

植物對(duì)AHAS 除草劑的抗性并非總是由靶標(biāo)抗性機(jī)制所致,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),很多抗這類除草劑的雜草含有非靶標(biāo)抗性(NTSR,non-target-sitebased resistance)機(jī)制[47,51-55]。某些虞美人(Papaver rhoeas)在AHAS 基因沒有發(fā)生突變的情況下仍能對(duì)甲氧咪草煙產(chǎn)生抗性,另一些虞美人亦因苯磺隆的遷移速率提高或甲氧咪草煙的代謝速率加快而對(duì)AHAS 抑制劑產(chǎn)生抗性,這些現(xiàn)象說明在一些虞美人中存在NTSR 機(jī)制[47]。Scarabel 等[52]發(fā)現(xiàn)虞美人對(duì)甲氧咪草煙所產(chǎn)生的NTSR 在連續(xù)2 個(gè)世代均可遺傳；對(duì)磺酰脲類的三氟甲磺隆所產(chǎn)生的NTSR 能在F1代觀察到并且可以遺傳給F2代；對(duì)三唑并嘧啶亞類的雙氟磺草胺所產(chǎn)生的NTSR 在F2代出現(xiàn)。這些結(jié)果說明虞美人對(duì)不同種類除草劑所產(chǎn)生的交互抗性是由多個(gè)不同的基因控制,且這種抗性很可能是由多個(gè)具有中度抗除草劑效應(yīng)的未知位點(diǎn)經(jīng)世代累加逐漸形成的。另外,某些播娘蒿(Descurainia sophiaL.)雜草中也存在NTSR,這是因?yàn)榧?xì)胞色素P450 抑制劑——馬拉硫磷(malathion)能大幅逆轉(zhuǎn)其對(duì)苯磺隆的抗性[53]。相應(yīng)地,RNA-Seq 分析顯示,該雜草中可能存在多個(gè)候選基因參與植物體內(nèi)除草劑的降解過程。與缺乏除草劑抗性的播娘蒿相比,抗除草劑的播娘蒿含有26 個(gè)差異表達(dá)基因,其中包括4 個(gè)cytochrome P450s、1 個(gè)ABC 運(yùn)輸?shù)鞍缀? 個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因。后續(xù)的qRT-PCR 驗(yàn)證表明與CYP96A13 和ABCC1 運(yùn)輸?shù)鞍淄吹? 個(gè)基因在抗除草劑的播娘蒿中過量表達(dá)[53]。再者,在耐煙嘧磺隆除草劑的某些馬唐(Digitaria sanguinalisL.)雜草中和對(duì)多種AHAS 除草劑(如煙嘧磺隆、五氟磺草胺和雙草醚)具有交互抗性的剪刀草(Sagittaria trifoliaL.)中均不存在靶標(biāo)基因的突變位點(diǎn),但馬拉硫酸處理能有效逆轉(zhuǎn)其對(duì)除草劑的抗性；相應(yīng)地,這些耐除草劑雜草具有較高的除草劑代謝速率。這些結(jié)果表明細(xì)胞色素P450 參與了某些雜草的NTSR 機(jī)制的形成,該機(jī)制對(duì)雜草除草劑抗性的產(chǎn)生起著重要作用[54-55]。

除了AHAS 抑制劑類除草劑,其他類型除草劑也能誘發(fā)雜草產(chǎn)生NTSR。大穗看麥娘(Alopecurus myosuroides,black-grass)雜草能對(duì)3 種乙酰輔酶A 羧化酶(ACCase)抑制劑和1 種AHAS 抑制劑產(chǎn)生抗性。試驗(yàn)顯示,多重抗性的形成可能需要3個(gè)以上NTSR位點(diǎn)同時(shí)存在。某些NTSR 位點(diǎn)只能賦予植物對(duì)某一種特定除草劑產(chǎn)生抗性,而對(duì)試驗(yàn)中的其他除草劑沒有效應(yīng)[51],這說明不同除草劑可能在植物中誘發(fā)產(chǎn)生不同的NTSR 機(jī)制。最近報(bào)道指出,日本看麥娘(Alopecurus japonicus)雜草中ACCase 抑制劑類除草劑精噁唑禾草靈抗性的形成與細(xì)胞色素P450 CYP72A 亞族的3 個(gè)成員以及細(xì)胞色素P450 家族中的CYP81 表達(dá)上調(diào)有關(guān)[56]。另外,NTSR 也存在于對(duì)草甘膦(作用于烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶,EPSPS)、百草枯和烯禾啶以及其他ACCase 抑制劑表現(xiàn)出多重抗性的意大利黑麥草中[57]。此外,某些長芒莧[Amaranthus tuberculatus(var.rudis)]雜草能對(duì)多種4-羥苯(基)丙酮酸雙(加)氧酶(HPPD)抑制劑類除草劑(硝磺草酮、環(huán)磺酮、苯唑草酮)產(chǎn)生抗性,而細(xì)胞色素P450 抑制劑能使該雜草喪失對(duì)環(huán)磺酮的抗性,這說明該雜草NTSR 形成的一個(gè)主要因素與細(xì)胞色素P450 酶活性的增強(qiáng)加速了HPPD 抑制劑類除草劑的代謝速率相關(guān)[58]。

迄今,NTSR 在農(nóng)作物中的研究甚少,而且其重要性被嚴(yán)重低估[59-60]。研究表明秈稻對(duì)AHAS 抑制劑除草劑雙草醚具有耐受性,而粳稻品種則對(duì)此敏感。圖位克隆法與互補(bǔ)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)秈稻對(duì)雙草醚的耐受性是由1 個(gè)新的細(xì)胞色素P450 單加氧酶CYP72A31 控制[60]。CYP72A31 轉(zhuǎn)基因水稻與擬南芥植株對(duì)雙草醚的耐受性與該基因的表達(dá)量相關(guān),而且CYP72A31 過表達(dá)擬南芥植株還對(duì)芐嘧磺隆產(chǎn)生耐受性,說明雙草醚與芐嘧磺隆均能在CYP72A31 作用下轉(zhuǎn)化為低毒化合物[60]。CYP72A31的除草劑專一性不同于另一細(xì)胞色素P450 單加氧酶,即CYP81A6,后者只能賦予植物對(duì)芐嘧磺隆的耐受性。由此推測CYP72A31 基因是田間雜草防治研究的一個(gè)潛在遺傳資源,為一些作物的分子設(shè)計(jì)育種提供了新的思路[60]。

綜上所述,植物對(duì)AHAS 抑制劑類除草劑所產(chǎn)生的抗性分為TSR 與NTSR。TSR 通常由AHAS 催化亞基的某些氨基酸殘基發(fā)生改變引起植物對(duì)除草劑的敏感性下降或由AHAS 表達(dá)量增加所致,而NTSR 則與除草劑的代謝速率、去毒效力以及吸收和運(yùn)輸速率有關(guān)。AHAS 抑制劑與其他類型除草劑在特定條件下均能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生NTSR,在很多情況下細(xì)胞色素P450 參與這種機(jī)制的形成。但由于在單一高等植物個(gè)體中存在200 個(gè)以上不同基因編碼的細(xì)胞色素P450 酶,目前仍無法清晰地回答下述3個(gè)問題：(i)究竟哪些特定的細(xì)胞色素P450 能夠?qū)Ｒ坏厥怪参飳?duì)特定種類除草劑產(chǎn)生抗性[61]；(ii)與NTSR 相關(guān)的基因突變是否位于某一編碼細(xì)胞色素P450 的基因的啟動(dòng)子/5'-UTR/3'-URA 或編碼區(qū)上,并最終影響此酶的活性；(iii)與NTSR 相關(guān)的基因突變是否位于某個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子上,從而影響多個(gè)細(xì)胞色素P450 基因的表達(dá)。還有,雖然代謝抗性被認(rèn)為是一種非常重要的NTSR 機(jī)制,但是目前人們還不清楚究竟還有哪些基因直接參與NTSR 的形成[62]。此外,最近發(fā)現(xiàn),雖然野燕麥(Avena fatuaL.)對(duì)多種除草劑產(chǎn)生的抗性由NTSR 機(jī)制所致,但谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)與相關(guān)酶在野燕麥中的表達(dá)量增加并非直接參與提高精噁唑禾草靈或咪唑乙煙酸除草劑的代謝速率[63]。Burns 等認(rèn)為這些酶活性的提高增強(qiáng)了廣義防御網(wǎng)絡(luò)對(duì)除草劑的應(yīng)答反應(yīng)。雜草長期在半致死劑量除草劑處理下產(chǎn)生的響應(yīng),如同植物在很多非生物和生物脅迫下產(chǎn)生的響應(yīng),最終導(dǎo)致NTSR 機(jī)制的形成。NTSR 與系統(tǒng)獲得性馴化(SAR,systemic acquired acclimation)和系統(tǒng)獲得性抗性(SAA,systemic acquired resistance)具有某些共同特性[63-66]。

4 展望

利用高效除草劑降低雜草危害促進(jìn)了省工省時(shí)的現(xiàn)代簡化農(nóng)業(yè)體系的建立,但是在此基礎(chǔ)上發(fā)展高效均衡的多元化作物耕作制度所必需的一個(gè)前提是創(chuàng)制獲得對(duì)不同類別除草劑具有多種抗性機(jī)制的作物新品種。在此情形下,我們可以通過使用不同類別的除草劑,降低單一除草劑的使用對(duì)土壤微生物種群的變化造成的負(fù)面影響以及前茬作物田殘留除草劑對(duì)后茬作物產(chǎn)生的藥害,同時(shí)還可降低抗除草劑雜草產(chǎn)生的頻率。目前,抗咪唑啉酮類或磺酰脲類除草劑的農(nóng)作物種質(zhì)創(chuàng)制工作進(jìn)展迅速,但針對(duì)其他除草劑的農(nóng)作物種質(zhì)創(chuàng)制鮮有報(bào)道。相比玉米、小麥、水稻、棉花、大豆、油菜等主要農(nóng)作物,花生除草劑抗性性狀的遺傳改良研究進(jìn)展緩慢。在很多花生產(chǎn)區(qū),以麥田套作和夏直播花生為主的栽培模式很普遍,因而麥田除草劑的使用會(huì)在一定程度上影響花生的生長,從而降低了利用這種栽培模式提高復(fù)種指數(shù)與高效利用有限耕地資源所帶來的益處。上述事實(shí)表明,創(chuàng)制獲得一系列對(duì)不同芽前和芽后除草劑具有抗性的花生和其他農(nóng)作物種質(zhì)資源對(duì)完善不同作物的輪作種植制度有重要意義。

如前所述,AHAS 中的某些氨基酸殘基與特定抑制劑的結(jié)合具有專一性,而另一些氨基酸殘基則是多種除草劑的共有結(jié)合域[18,52],因而AHAS 中氨基酸突變位點(diǎn)的差異在很大程度上決定了植物對(duì)除草劑抗性的專一性和廣譜性?？梢酝茰yAHAS 中某些特定氨基酸的改變有可能允許同一類抑制劑中的不同化合物或結(jié)構(gòu)相近的不同除草劑有效地結(jié)合到AHAS 的某些相同位點(diǎn),若使用由多種AHAS 抑制劑組成的復(fù)配劑篩選特定作物的誘變?nèi)后w,有可能獲得對(duì)多種除草劑具有耐受性的新種質(zhì)資源,開展這種嘗試性的研究有望拓寬作物種質(zhì)資源庫。

在掌握除草劑抗性與靶標(biāo)突變位點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系基礎(chǔ)上,當(dāng)今高效基因編輯技術(shù)(如CRISPR/Cas9 等)的發(fā)展可為創(chuàng)制多樣化的除草劑抗性性狀的種質(zhì)資源提供革命性的解決方案[65-69]。Li 等和Svitashev 等試圖將含有能賦予除草劑抗性的突變DNA 模板整合到由CRISPR/Cas9 引起的斷裂DNA 雙鏈(DSB)中,并成功地在大豆和玉米中獲得了源于該突變序列的除草劑抗性性狀[65-66]。不過,因在DSB 修復(fù)過程中通常難以提供足夠的DNA 模板,而使其在植物基因組編輯中的應(yīng)用受到了限制。值得注意的是,一種融合了胞苷脫氨酶(BE3)的新型Cas9 在無供體DNA 模板的情況下實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)的單核苷酸替換,使得植物基因組的堿基編輯變得更加可行[67],現(xiàn)已運(yùn)用該基因編輯技術(shù)獲得了抗除草劑的水稻和擬南芥[68-69]。目前,Li 等使用RNA 作為同源重組修復(fù)的模板,并分別利用核酶自切割和具有RNA/DNA雙重切割能力的基因編輯系統(tǒng),獲得后代無轉(zhuǎn)基因成分的抗AHAS 抑制劑類除草劑水稻植株[70]。該工作開辟了利用植物RNA 作為同源供體模板進(jìn)行同源修復(fù)的新方向,是植物基因組編輯領(lǐng)域的重大進(jìn)展?？梢灶A(yù)見,農(nóng)作物的除草劑靶標(biāo)抗性的創(chuàng)制將會(huì)變得更加容易。相反,因?yàn)槟壳皩?duì)NTSR 機(jī)制知之甚少,尚不清楚究竟由哪些基因參與NTSR 的形成,所以無法充分利用當(dāng)代高效基因編輯技術(shù)創(chuàng)制具有NTSR 性狀的種質(zhì)資源。NTSR 抗性機(jī)制在植物除草劑抗性性狀形成中占有重要地位,它還能與一種新的抗性機(jī)制——穩(wěn)態(tài)耐性(meostatic tolerance)協(xié)同參與植物除草劑抗性的形成[71],所以將來一個(gè)重要研究方向是剖析植物中NTSR 形成的生化與分子機(jī)制,以便結(jié)合高效基因編輯技術(shù)快速培育具有非靶標(biāo)抗性性狀的作物新品種。

值得指出的是,某些特定AHAS 除草劑抗性性狀除在田間雜草防治中起重要作用外,還具有其他應(yīng)用價(jià)值。其一,除草劑靶酶AHAS 在支鏈氨基酸合成過程中起重要作用,某些氨基酸位點(diǎn)的突變能夠降低或消除產(chǎn)物對(duì)AHAS 的負(fù)反饋抑制,這種機(jī)制的產(chǎn)生會(huì)在一定程度上加強(qiáng)植物中支鏈氨基酸的生物合成,因此該類除草劑抗性性狀的開發(fā)可在一定程度上為將來研發(fā)富含這類人體必需氨基酸的特色作物新品種提供某種基礎(chǔ)。不過需要注意,目前尚不清楚AHAS 特性的改變是否也會(huì)對(duì)脂類、糖類以及其他物質(zhì)的合成造成某些影響,所以我們必須合理地評(píng)估特定作物中AHAS 抑制劑除草劑抗性性狀的利用價(jià)值。其二,某些AHAS 除草劑抗性性狀可應(yīng)用于化學(xué)殺雄。葉面噴施低劑量的苯磺隆可以選擇性地誘導(dǎo)雄性不育,目前這種方法在油菜雜交種的生產(chǎn)上已得到了有效應(yīng)用[72]。