潘麗霞 朱婧 王青艷 楊登峰

(1 廣西科學(xué)院非糧生物質(zhì)酶解國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，廣西生物質(zhì)產(chǎn)業(yè)化工程院 廣西生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530007；2 廣西科學(xué)院廣西北部灣海洋研究中心，廣西海洋天然產(chǎn)物與組合合成生物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530007)

細(xì)胞色素P450酶(P450s或者CYPs)是一類依賴于亞鐵血紅素，催化多種復(fù)雜氧化反應(yīng)的多功能酶。它廣泛地存在于各種生物體內(nèi)，包括細(xì)菌，真菌，哺乳動(dòng)物以及人體。之所以得名P450，是由于在催化過(guò)程中，其和亞鐵血紅素相互結(jié)合，形成硫醇-亞鐵-一氧化碳復(fù)合物，該復(fù)合物在450nm處具有最大特征吸收波譜[1]。P450不但在有害異物的脫毒，類固醇的生物合成以及人體的藥物代謝中起非常重要的作用[2-3]，而且在天然產(chǎn)物的生物合成中也起到非常關(guān)鍵的作用[4-5]。

放線菌，尤其是其中的鏈霉菌屬，作為抗生素的主要來(lái)源之一，已經(jīng)被人們研究了幾十年。近年來(lái)，該菌屬的P450酶取得了進(jìn)一步的研究進(jìn)展，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：一是隨著基因組測(cè)序技術(shù)的普及化和廉價(jià)化，人們可以從基因組水平發(fā)現(xiàn)P450酶，對(duì)P450酶序列的發(fā)現(xiàn)呈爆發(fā)式增長(zhǎng)，逐漸向大數(shù)據(jù)發(fā)展；二是合成生物學(xué)的快速發(fā)展，人們對(duì)鏈菌屬來(lái)源的抗生素或者活性分子的生物基因簇的合成機(jī)制更加關(guān)注，對(duì)在基因簇中功能未知的P450酶做了深入地酶學(xué)特性鑒定；三是在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方面，相較于真菌或高等生物來(lái)源的P450酶，這些細(xì)菌來(lái)源的P450酶往往不是膜蛋白，這些樣本更容易得到晶體結(jié)構(gòu)，更多鏈霉菌的P450酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得到解析，這對(duì)P450酶的催化機(jī)制和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的研究更加有利；四是鏈霉菌的P450酶不僅操作簡(jiǎn)單而且催化多樣，適合作為研究酶催化改造的素材，化學(xué)研究人員陸續(xù)成功地開(kāi)發(fā)出多種新的催化反應(yīng)[6-8]。在本文中，對(duì)這些方面的最新進(jìn)展都進(jìn)行了綜述。

另外，更多化學(xué)研究人員參與到對(duì)P450的研究中成為近年來(lái)的一個(gè)趨勢(shì)。在化學(xué)合成中，碳?xì)浠罨磻?yīng)是將氧原子插入到不活潑的碳?xì)滏I上，是反應(yīng)最困難和研究最熱門的反應(yīng)之一，這類反應(yīng)也可以由P450催化完成[9-11]。這使得P450酶成為目前在合成生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、酶工程以及有機(jī)化學(xué)中，研究最為廣泛的酶之一。

1 鏈霉菌P450的特點(diǎn)

1.1 P450催化反應(yīng)的類型多

P450催化的反應(yīng)類型之多[12-14]，是非常少見(jiàn)的。目前，在鏈霉菌屬，功能已經(jīng)有試驗(yàn)證實(shí)的P450酶大約有不到200個(gè)左右[15]。按大類主要分為氧化、脫氫、偶合以及各種成鍵反應(yīng)。其反應(yīng)具體涉及十幾個(gè)反應(yīng)類型，具體包括為羥化、環(huán)氧化、芳香環(huán)羥化、脫氫、硝化、芳香環(huán)的偶合、脫?；⑻继兼I形成、碳氮鍵形成、碳氧鍵形成以及碳硫鍵形成反應(yīng)。

在氧化反應(yīng)中，最基本的反應(yīng)是羥化反應(yīng)。在天然產(chǎn)物的合成中，大部分的P450酶是起到羥化的功能，大約占到所有功能的三分之二。P450也能催化環(huán)氧化反應(yīng)和芳香環(huán)的羥化反應(yīng)。環(huán)氧化反應(yīng)經(jīng)?？梢栽诰弁肿拥暮铣芍锌吹?，因?yàn)檫@樣的分子往往具有很多碳碳雙鍵，可以發(fā)生環(huán)氧化來(lái)保持構(gòu)型。例如PimD(CYP161A2)催化聚烯抗生素納他霉素(pimaricin)的碳4位和碳5位產(chǎn)生環(huán)氧化[16]。OleP(CYP010D1)是一個(gè)在竹桃霉素(oleandomycin)合成中負(fù)責(zé)環(huán)氧化的P450酶，它環(huán)氧化碳8位和8a位上的兩個(gè)碳原子[17]。阿嗪霉素B(azinomycin B)的生物合成途徑中的AziB1是催化芳香環(huán)的羥化反應(yīng)的P450酶，它負(fù)責(zé)芳香環(huán)萘甲酸上的羥化反應(yīng)[18]。這類羥化反應(yīng)的機(jī)制，被認(rèn)為是首先發(fā)生在芳香環(huán)上的環(huán)氧化反應(yīng)，環(huán)氧化開(kāi)環(huán)，借助氫氫轉(zhuǎn)移完成芳香環(huán)的重構(gòu)。

脫氫反應(yīng)中，P450酶可以完成2個(gè)或更多電子的脫氫反應(yīng)，將一個(gè)sp3雜化的碳原子變?yōu)橐粋€(gè)sp2或者sp1雜化的碳原子。對(duì)于脫氫反應(yīng)的分類不是十分清楚，因?yàn)樵诮?jīng)過(guò)2～3次脫氫后往往伴隨著非酶反應(yīng)的脫水，最終，形成酮、醛和酸。XiaM是一個(gè)在吲哚倍半萜廈霉素A(xiamycin A)生物合成途徑中，將甲基轉(zhuǎn)化為羧酸，還產(chǎn)生醇醛等中間體的P450酶[19]。另一個(gè)例子是在新型血管生成抑制劑Borrelidin途徑中的BorJ，它可以在一個(gè)四電子氧化的過(guò)程，將一個(gè)甲基轉(zhuǎn)化為一個(gè)醛[20]。另一類脫氫反應(yīng)是由P450的去飽和酶完成的。當(dāng)?shù)孜镒優(yōu)樽杂苫问?，就?huì)在拔取氫原子和羥化之間產(chǎn)生一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)，羥化的產(chǎn)物和去飽和的產(chǎn)物之間是不能互相轉(zhuǎn)化的。一般是羥化的產(chǎn)物為主產(chǎn)物，但有時(shí)也有去飽和的產(chǎn)物是主要的產(chǎn)物的情況。在lactimidomycin(LTM)的生物合成中，LtmK可以將95%以上的LTM轉(zhuǎn)化為8,9-dihydro-LTM。同時(shí)，產(chǎn)生小于5%的8S和9R的羥化產(chǎn)物[21]。GdmP(CYP105U1)是一個(gè)在格爾德霉素(geldanamycin)生物合成中的去飽和酶，允許自由基重綁定到底物上，在其發(fā)酵菌的發(fā)酵液中分離到兩種立體構(gòu)型的羥化產(chǎn)物[22-23]。這些結(jié)果表明去飽和反應(yīng)是可以由酶反應(yīng)來(lái)控制的。

偶合反應(yīng)中，芳香環(huán)的偶合反應(yīng)常常對(duì)天然產(chǎn)物起到多種不同的作用，能夠創(chuàng)造出結(jié)構(gòu)的多樣性，如黑莫他丁(himastatin)和julichromes[24-25]；能夠使柔性的骨架更加地剛性，如糖肽抗生素(glycopeptide antibiotics, GPA)和星形孢菌素(staurosporine)[26-27]；還能夠聚合單體產(chǎn)生防曬的天然產(chǎn)物，如黑色素(melanins)[28]。天藍(lán)色鏈霉菌的CYP158A1和CYP158A2分別可以聚合淡黃霉素(flaviolins)形成可以抵抗紫外線輻射的多聚體。盡管這兩個(gè)蛋白有60%的序列同源性和相同的底物結(jié)合模式，但CYP158A1只形成二聚體的flaviolins，而CYP158A2至少形成4種flaviolins的聚合體[29-30]。相似的，灰色鏈霉菌的P450酶(CYP107F1)順序地催化氧化1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene(THN)[31]，首先完成分子間的?；己戏磻?yīng)，再通過(guò)一個(gè)分子內(nèi)的?；己戏磻?yīng)，最后，形成黑色素。目前，對(duì)于許多雙酰基偶合反應(yīng)，還不是很清楚這些酶是利用自由基機(jī)制，還是利用正離子機(jī)制。

成鍵反應(yīng)中，StaP(CYP245A1)是一個(gè)負(fù)責(zé)分子內(nèi)碳碳鍵形成的P450酶，它是在星形孢菌素的生物合成途徑中，在兩個(gè)chromopyrrolic acid的吲哚環(huán)之間形成碳碳鍵，經(jīng)過(guò)一系列的質(zhì)子化和異構(gòu)化反應(yīng)產(chǎn)生吲哚并咔唑(indolocarbazole)的六元環(huán)[32]。TxtE是一個(gè)來(lái)源于植物病原菌鏈霉菌的P450酶，參與植物毒素thaxtomins的生物合成，產(chǎn)生碳氮鍵的硝化發(fā)生在色氨酸的碳4位[33-34]。HmtT負(fù)責(zé)催化黑莫他丁中六氫吡咯環(huán)的碳氮鍵形成，氮原子進(jìn)攻碳2位，形成碳氮鍵，碳3位上的羥基離去。相似的，StaN(CYP244A1)借助糖上碳5位的羥化，形成糖苷鍵，接著質(zhì)子化脫水產(chǎn)生親電的氧鎓正離子[35-36]。SgvP是一個(gè)在灰綠霉素(griseoviridin)的生物合成中，形成一個(gè)包含硫醇烯基團(tuán)的9元環(huán)。據(jù)推測(cè)，這個(gè)反應(yīng)是通過(guò)環(huán)氧化不飽和的胺基，引起硫原子親核進(jìn)攻α碳原子催化碳硫鍵的形成[37-38]。

1.2 P450催化反應(yīng)的選擇性好

由于羥基的引入，P450的催化往往具有構(gòu)型和構(gòu)象的立體選擇性。在天然產(chǎn)物合成的過(guò)程中，這些反應(yīng)可以讓產(chǎn)物構(gòu)型更穩(wěn)定，同時(shí)，在天然產(chǎn)物的多樣性中發(fā)揮非常重要的作用。在糖肽抗生素中最大的特點(diǎn)，是它的七肽骨架形成多個(gè)雙芳香橋(C-C)或者雙酰脂橋(C-O-C)，如著名的萬(wàn)古霉素。這些結(jié)構(gòu)是由P450酶催化完成的，而且，這個(gè)結(jié)構(gòu)的存在與否與這類化合物的活性密切相關(guān)的。如果線性的或者不完整的萬(wàn)古霉素中間體，就會(huì)失去了原有的良好的抗菌活性。在鏈霉菌中，GPAA47934具有4個(gè)這樣的芳香橋，而萬(wàn)古霉素只有3個(gè)這樣的芳香橋。4個(gè)CYP165家族的P450酶，StaH、StaG、StaF和StaJ分別負(fù)責(zé)C-O-D環(huán)，F(xiàn)-O-G環(huán)，D-O-E環(huán)和A-B環(huán)合成[31,39]。這些酶都具有自身獨(dú)特地催化位點(diǎn)，并形成具有立體選擇性的結(jié)構(gòu)。

1.3 P450催化反應(yīng)的功能多

P450在催化過(guò)程中，往往一個(gè)酶具有多步催化功能。最為著名的是PikC(CYP107L1)，它可以催化完成在不同大環(huán)內(nèi)脂環(huán)上的7個(gè)不同位置的羥化反應(yīng)，它可以催化12元環(huán)內(nèi)脂產(chǎn)生抗生素酒霉素(methymycin)和新酒霉素(neomethymycin)，在不同位置完成兩次羥化反應(yīng)產(chǎn)生抗生素novamethymycin[40-41]，也可以催化13元環(huán)抗生素那波霉素(narbomycin)產(chǎn)生苦霉素(pikromycin)[42-43]。來(lái)源于鏈霉菌Streptomyces thioluteus的P450酶AurH，在金鏈菌素(aureothin)的生物合成中，催化合成具有立體選擇性的四氫呋喃環(huán)。兩個(gè)碳氧鍵按順序地形成：首先是碳7位的亞甲基產(chǎn)生一個(gè)羥化的中間體，然后，是新產(chǎn)生的羥基和碳9a位[44-45]。目前，還不知道是否這種雜環(huán)化是利用一個(gè)雙羥基中間體還是自由基中間體來(lái)完成，相似的機(jī)制也出現(xiàn)在阿維菌素的合成過(guò)程中。

1.4 P450在基因組水平大量存在

不同于一般細(xì)菌中，P450數(shù)量較少或者甚至沒(méi)有，例如大腸埃希菌和鼠傷寒沙門菌都沒(méi)有P450酶基因的存在[46-47]，在鏈霉菌中，存在相對(duì)多的P450酶基因。例如兩個(gè)工業(yè)化生產(chǎn)菌種，阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)和天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)，分別產(chǎn)生阿維菌素和放線紫紅素，已經(jīng)完成了全基因組的測(cè)序[48-49]。在這兩個(gè)菌種中，都發(fā)現(xiàn)了大量的P450酶基因，分別是18個(gè)和33個(gè)，占到全部編碼基因的0.2%和0.4%[50-51]。這個(gè)數(shù)字大大高于其他細(xì)菌中的P450數(shù)量。目前，在鏈霉菌中，大概有180個(gè)功能已知P450酶，無(wú)論是通過(guò)體外試驗(yàn)、基因敲除，還是異源表達(dá)和結(jié)構(gòu)學(xué)研究，但還有大量未知功能的P450酶有待于去進(jìn)一步功能解析。

2 鏈霉菌P450的最新進(jìn)展

2.1 P450在合成生物學(xué)上的進(jìn)展

2015年，中科院南海海洋所的張長(zhǎng)生課題組完成了heronamide生物合成途徑中的后修飾的P450酶HerO的發(fā)現(xiàn)，該酶催化碳8位的羥化反應(yīng)[52]?？股豲leandomycin生物合成途徑中的負(fù)責(zé)環(huán)氧化的P450酶OleP也完成了功能和結(jié)構(gòu)的鑒定工作，該酶是目前唯一一個(gè)在未激活碳碳鍵上完成環(huán)氧化的P450酶[53]。利用比較全基因組學(xué)，挖掘thiolactomycin的生物合成基因簇時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)不常見(jiàn)的P450酶，該酶負(fù)責(zé)thiotetronate ring的形成[54]。在研究pentalenolactone的時(shí)候，在最后一步修飾時(shí)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)催化氧化重排的P450酶[55]。在platensimycin的生物合成途徑中，發(fā)現(xiàn)了形成脂環(huán)的P450酶[56]。另外，對(duì)pimaricin基因簇中的P450酶的刪除，可以產(chǎn)生一些新的結(jié)構(gòu)類似物，這些類似物表現(xiàn)出更好的的抗真菌活性[57]。同樣的情況，也出現(xiàn)在natamycin的生物合成中[58]。

2.2 P450在結(jié)構(gòu)生物學(xué)上的進(jìn)展

最早的P450酶的晶體結(jié)構(gòu)是于1985年被解析，是一個(gè)來(lái)自于惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的P450酶(CYP101A1)[59]。隨后，每年P(guān)450的結(jié)構(gòu)都會(huì)有較大幅度的增長(zhǎng)。到目前為止，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(protein data bank, PDB)中，來(lái)自于鏈霉菌的有29個(gè)，13個(gè)是來(lái)自于聚酮的，8個(gè)是來(lái)自于非核糖體肽的，3個(gè)是來(lái)自于聚酮-非核糖體肽雜合體的，4個(gè)是來(lái)自于萜的生物合成途徑。另外，還有一個(gè)是未知功能。

2017年，參與griseoviridin生物合成的P450酶SgvP，作為第一個(gè)形成碳硫鍵的P450酶，得到了2.6埃的晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)顯示Pro237在碳硫鍵的合成中起到關(guān)鍵作用[60]。糖肽抗生素合成中，NRPS(nonribosomal peptide synthetase)中的X-domain和P450的復(fù)合物結(jié)構(gòu)也得到了解析，為NRPS與外源蛋白相關(guān)作用的研究提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[61]。糖肽teicoplanin中負(fù)責(zé)環(huán)化D-O-E環(huán)的OxyA的晶體結(jié)構(gòu)也得到了解析[62]。另外，一些來(lái)源于鏈霉菌中新的P450酶結(jié)構(gòu)也到的了解析，如參與消炎藥物diclofenac和阿維菌素合成的CYP105D7和CYP107L2[63-64]。

2.3 P450在分子改造上的進(jìn)展

PikC是一個(gè)對(duì)十元環(huán)和十二元環(huán)大環(huán)內(nèi)脂都能進(jìn)行兩位點(diǎn)羥化的P450酶。這是一個(gè)系統(tǒng)研究的酶，從野生型、共結(jié)晶以及突變型的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，到計(jì)算機(jī)模擬，產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用平臺(tái)的構(gòu)建，將非專一性改造為可以進(jìn)行精準(zhǔn)羥基化的酶。首先，是它的晶體結(jié)構(gòu)和不同底物YC-17和那波霉素的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)(PDB ID: 2C6H,2C7X)獲得了解析[65]，結(jié)果表明紅霉脫氧糖胺以兩種不同的方式和酶結(jié)合，一種是深埋的，一種是暴露的。消除Asp50的負(fù)電荷可以明顯地增加酶的活性，在突變體Asp50Asn的晶體結(jié)構(gòu)中，底物和酶都是以深埋的方式結(jié)合的，這樣，它的兩步底物結(jié)合機(jī)制被推測(cè)。利用底物工程化的技術(shù)，可以將碳10位和碳12位的產(chǎn)物從原來(lái)1:4變?yōu)?0:1[66]。另外，通過(guò)分子動(dòng)態(tài)模擬和底物工程化策略，在共結(jié)晶結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，結(jié)合計(jì)算機(jī)計(jì)算，對(duì)P450酶PikC進(jìn)行蛋白質(zhì)工程，得到了可以催化不活潑碳?xì)滏I的新活力，現(xiàn)在該酶已經(jīng)構(gòu)建成為工業(yè)應(yīng)用的一個(gè)平臺(tái)[67]。

AurH是一個(gè)存在于聚酮抗生素金鏈菌素生物合成途徑中的多功能P450酶，分子改造是使其接受新的底物，產(chǎn)生新的產(chǎn)物。AurH隨機(jī)的氧化碳7位和碳9a位導(dǎo)致四氫呋喃的形成。它的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:3P3L, 3P3O, 3P3X, 3P2Z)是第一個(gè)CYP151A亞家族的P450酶結(jié)構(gòu)。蛋白配體對(duì)接模式顯示底物的吡喃酮環(huán)占據(jù)了一個(gè)疏水的活性口袋，通過(guò)改變活性口袋大小，來(lái)實(shí)現(xiàn)新反應(yīng)。突變體Phe89Trp和Thr239Phe明顯地減小了酶的催化效果，并且產(chǎn)生了一種新的金鏈菌素的類似物[68]。大的氨基酸色氨酸和苯丙氨酸借助位阻效應(yīng)改變了底物吡喃酮的綁定模式。這些突變體催化立體選擇六電子的轉(zhuǎn)化，借助羥基和醛基的中間體，將沒(méi)有活性的碳9a位上的甲基變?yōu)轸人帷Ｍ瑫r(shí)，在相關(guān)突變體菌種的發(fā)酵液中，分離到新型的結(jié)構(gòu)類似物。

在分子改造方面，美國(guó)加州大學(xué)的Arnold課題組做出了非常的突出的貢獻(xiàn)。TxtE是第一個(gè)報(bào)道的有效催化硝化底物色氨酸的酶，分子改造是改變其底物結(jié)合位點(diǎn)，將硝化反應(yīng)的位點(diǎn)從色氨酸的碳5位變?yōu)樯彼岬奶?位。它的單獨(dú)晶體結(jié)構(gòu)和含有色氨酸底物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到解析，但是由于天然狀態(tài)下該酶F-G環(huán)的不穩(wěn)定，導(dǎo)致并沒(méi)有搞清楚該環(huán)是如何和底物色氨酸如何相互作用的。借助計(jì)算機(jī)分子動(dòng)態(tài)模擬軟件，使用馬爾科夫狀態(tài)，對(duì)F-G環(huán)的開(kāi)環(huán)、閉環(huán)和過(guò)渡態(tài)3種狀態(tài)進(jìn)行了重構(gòu)。處于F-G環(huán)上的His176對(duì)于酶的不同狀態(tài)起到關(guān)鍵的控制作用[69]。計(jì)算結(jié)果顯示增加了176位的空間位阻，導(dǎo)致底物結(jié)合位點(diǎn)的偏移。

3 結(jié)語(yǔ)

P450酶作為自然界中存在最廣泛和催化最多樣的酶，在鏈霉菌屬?gòu)V泛存在，對(duì)它們的研究還只是一小部分，有待于進(jìn)一步研究。P450酶作為一個(gè)金屬蛋白，在催化過(guò)程中，可以說(shuō)借助蛋白為載體，實(shí)現(xiàn)了金屬催化。而更多化學(xué)背景的研究人員開(kāi)始利用P450酶完成一些新的催化反應(yīng)，將酶催化和過(guò)渡金屬催化相結(jié)合，讓生物學(xué)和化學(xué)充分融合，相信這個(gè)方向還會(huì)有更多有意思的研究出現(xiàn)。同時(shí)，借助計(jì)算機(jī)的動(dòng)態(tài)模擬和共結(jié)晶的晶體學(xué)手段，相信對(duì)于P450酶的研究可以更上一個(gè)臺(tái)階，從分子水平對(duì)P450酶的催化機(jī)制做進(jìn)一步解析，為后續(xù)的蛋白質(zhì)改造奠定理論基礎(chǔ)。結(jié)合定向改造的方法，讓這些酶發(fā)揮出更大的作用，完成更多特異性的反應(yīng)。另外，基因組研究的快速發(fā)展加速了酶的研究，人們不再單純的依賴表型或現(xiàn)象去發(fā)現(xiàn)酶，全基因組測(cè)序技術(shù)可以讓你馬上發(fā)現(xiàn)所有備選的酶，為快速研究酶提供了新的可能。目前，本課題組以圍繞部分鏈霉菌的P450展開(kāi)結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，相關(guān)工作會(huì)在后續(xù)報(bào)道。