康亞男 張小波 劉 濤 張 倩 張 英 朱秀同 趙玉龍 吳雅清 鄭朝朝 劉 博

（1 瑞普（保定） 生物藥業(yè)有限公司， 河北保定 071000； 2 天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司， 天津 300308；3 廊坊市加一農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司， 河北廊坊 065000； 4 衡水市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心， 河北衡水 053099）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的豬的一種高度接觸性傳染病，臨床以高熱、皮膚和內(nèi)臟廣泛性出血、神經(jīng)癥狀、腹瀉、死亡為主要特征。非洲豬瘟病毒（ASFV）是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員。ASFV 是一個(gè)復(fù)雜的二十面體DNA 病毒，病毒粒子包含許多同軸心結(jié)構(gòu)，外部有六角形膜，病毒粒子的平均直徑大約為200 nm。豬病學(xué)資料顯示[1]，ASFV 有22 個(gè)基因型，截止目前國(guó)內(nèi)專(zhuān)家相關(guān)報(bào)道稱(chēng)ASFV 已有24 個(gè)基因型，我國(guó)流行的是基因Ⅱ型、血清8 群，與俄羅斯和東歐國(guó)家的流行毒株屬于同一分支。

ASFV 基因組包括一個(gè)線(xiàn)性的雙鏈DNA 分子，病毒基因組大小170～190 kb，能編碼100 種以上的蛋白質(zhì)分子。ASFV 存在于急性病豬的血液、組織液、體液、分泌物和排泄物中，具有很強(qiáng)的生存能力，具有適應(yīng)溫度、pH 值范圍廣，在pH 值4～13.2 的范圍內(nèi)均能穩(wěn)定存活。該病毒感染途徑和傳播方式眾多，健康豬與病豬或其污染物直接接觸、間接接觸，通過(guò)消化道、呼吸道、血液、污染車(chē)輛等均能感染該病。感染ASFV 后2～3 d即可排毒，可持續(xù)數(shù)周，康復(fù)后仍可排毒。

1 非洲豬瘟疫病發(fā)展情況[2-4]

20 世紀(jì)20 年代，非洲豬瘟病毒首次在肯尼亞被發(fā)現(xiàn)，1957 年在伊比利亞半島流行，20 世紀(jì)90 年代中期馬耳他、意大利、法國(guó)、比利時(shí)、荷蘭相繼發(fā)生非洲豬瘟疫情，1978 年撒丁島發(fā)生疫情，至今非洲豬瘟在撒丁島呈地方性流行。2007 年非洲豬瘟首次進(jìn)入高加索地區(qū)，2009 年傳入俄羅斯，2012 年從俄羅斯轉(zhuǎn)向?yàn)蹩颂m，2013 年轉(zhuǎn)入白俄羅斯，2014 年直接進(jìn)入了歐盟國(guó)家，如立陶宛、波蘭、拉脫維亞、愛(ài)沙尼亞等國(guó)家。2015 年至2018 年期間，家豬發(fā)生非洲豬瘟的報(bào)道只有1 起，其他均為野豬感染案例。

2018 年8 月，我國(guó)遼寧沈陽(yáng)發(fā)生首例非洲豬瘟疫情，中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國(guó)家非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室吳曉東研究員[4]報(bào)告的數(shù)據(jù)顯示，截至2019 年10月底，全國(guó)已有31 個(gè)省份發(fā)生非洲豬瘟疫情158 起，其中家豬感染154 起、野豬感染4 起，共撲殺生豬116萬(wàn)頭。2019 年1 月，蒙古國(guó)6 個(gè)地區(qū)發(fā)生10 起非洲豬瘟疫情，撲殺生豬1 144 頭；2019 年2 月，越南地區(qū)發(fā)生非洲豬瘟疫情，共撲殺生豬379.85 萬(wàn)頭。2018 年我國(guó)發(fā)生疫情最嚴(yán)重的地區(qū)有遼寧、安徽、黑龍江等，2019 年發(fā)生疫情最嚴(yán)重的地區(qū)有貴州、海南、廣西、云南等。

2 非洲豬瘟診斷技術(shù)

非洲豬瘟抗原檢測(cè)方法有紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)、熒光抗體試驗(yàn)、PCR 技術(shù)、熒光定量PCR 技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等[5]?？贵w檢測(cè)技術(shù)主要是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。

2.1 紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)（HAD）

HAD 最適合用來(lái)評(píng)估發(fā)生疑似疫病的豬群。該試驗(yàn)是利用紅細(xì)胞能吸附在體外培養(yǎng)的感染ASFV 的巨噬細(xì)胞膜表面。ASFV 誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)病變前，紅細(xì)胞能在巨噬細(xì)胞周?chē)纬傻湫偷拿倒寤ōh(huán)，這是ASFV 病毒的特異性。但是目前文獻(xiàn)報(bào)道，有的分離株能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞出現(xiàn)病變，但是不能形成紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。

2.2 直接免疫熒光（DIF） 試驗(yàn)

免疫熒光檢測(cè)方法主要用于豬的脾臟、肺臟、淋巴結(jié)、腎臟等組織器官的抗原檢測(cè)，組織觸片或者冷凍切片后，利用特異性的熒光抗體與抗原結(jié)合的原理，通過(guò)顯微鏡觀察熒光顯色結(jié)果。該方法的局限性是不能用于鑒定不產(chǎn)生HAD 的非洲豬瘟病毒毒株。該方法對(duì)于急性病例的檢出率高，但對(duì)于亞急性和慢性病例的檢出率較低。

2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

目前，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是檢測(cè)ASFV 最常用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。針對(duì)不同的基因設(shè)計(jì)不同的特異性引物，能達(dá)到快速診斷的目的。早在2009 年我國(guó)曾少靈等[6]利用GenBank 上公布的非洲豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因vp73的序列，設(shè)計(jì)了特異性引物，建立了ASFV 的PCR 診斷方法，并與世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的方法進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果顯示2 種方法的特異性相當(dāng)，自建方法的靈敏度高于OIE 推薦方法至少100 倍。2012 年吳憶春等[7]根據(jù)ASFV vp73 基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立了非洲豬瘟病毒PCR 檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)靈敏度能達(dá)到10-7ng/μL。張倩等[8]建立了非洲豬瘟與豬瘟雙重PCR方法，對(duì)ASFV 和CSFV 的最低檢出量均可達(dá)到100 pg，為ASFV 和CSFV 的臨床鑒別診斷和流行病學(xué)的調(diào)查提供了有效的技術(shù)支持。

2.4 熒光定量PCR 法

熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR,RTFQ PCR）是美國(guó)Applied Biosystems 公司1996 年推出的一種新定量試驗(yàn)技術(shù)，它是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線(xiàn)監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程的一種核酸定量檢測(cè)的新技術(shù)，具有敏感性高、特異性好、定量準(zhǔn)確、快速、實(shí)時(shí)等特點(diǎn)。在我國(guó)，隨著PCR 技術(shù)的發(fā)展，對(duì)非洲豬瘟病毒的研究也邁上了新的臺(tái)階。自2009 年以來(lái)，陸續(xù)建立了非洲豬瘟病毒熒光PCR 診斷法，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)技術(shù)空白。2009 年，天津出入境檢驗(yàn)檢疫局董志珍等[9]利用ASFV的p54 基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)了特異性引物，并合成FAM 基團(tuán)標(biāo)記的探針，建立了熒光定量PCR 法，最低可檢出15 個(gè)拷貝數(shù)/μL 的樣品，靈敏度和特異性較高。2010 年，黃萍等[10]利用ASFV 的p72 基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)了引物和探針，建立了熒光定量PCR 法，該方法的敏感性達(dá)到100 個(gè)拷貝數(shù)。同年，曾少靈等[11]利用ASFV 的vp73 基因的保守序列設(shè)計(jì)了引物和TaqMan 探針，建立了熒光PCR 檢測(cè)方法，該方法的最低檢測(cè)限為10 個(gè)拷貝數(shù)/μL，與OIE 推薦的熒光PCR 檢測(cè)方法靈敏度和特異性均相當(dāng)。

2.5 其他檢測(cè)方法

2.5.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）

James 等[12]以ASFV 異構(gòu)酶Ⅱ型基因?yàn)榘悬c(diǎn)構(gòu)建的LAMP 檢測(cè)方法，其靈敏度不低于330 個(gè)拷貝數(shù)。楊吉飛等[13]利用p72 基因設(shè)計(jì)引物，建立了非洲豬瘟病毒的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。將LAMP 與OIE 參考的PCR 檢測(cè)方法進(jìn)行比較，該項(xiàng)技術(shù)對(duì)非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室提供的非洲豬瘟病毒17 個(gè)毒株的基因組均能進(jìn)行成功的擴(kuò)增。

2.5.2 交叉引物擴(kuò)增——試紙條法

面對(duì)非洲豬瘟的挑戰(zhàn)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所豬烈性傳染病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建立了一種交叉引物擴(kuò)增——診斷試紙聯(lián)用的檢測(cè)方法。該方法可完成現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但是該方法為單通道檢測(cè)方法，難以實(shí)現(xiàn)疫病的普查。

2.6 抗體檢測(cè)技術(shù)

2.6.1 膠體金試紙條法

張?chǎng)斡畹萚14]建立了p54 抗體膠體金檢測(cè)法，分別以葡萄球菌A 蛋白（SPA）和抗p54 多克隆抗體作為檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，制作了ASFV p54 抗體檢測(cè)膠體金免疫分析試紙條，臨床樣品的符合率高于OIE 推薦的ELISA 方法，該項(xiàng)技術(shù)在今后ASFV 的防控中具有良好的應(yīng)用前景。

2.6.2 ELISA 抗體檢測(cè)方法

非洲豬瘟病毒有54 種結(jié)構(gòu)蛋白，大部分的結(jié)構(gòu)蛋白具有良好的抗原性，其中p72、vp73、p54、p30 等蛋白常被作為研究對(duì)象。梁云浩[15]針對(duì)非洲豬瘟病毒蛋白p54 進(jìn)行了克隆表達(dá)，建立了血清抗體間接ELISA測(cè)定的方法，該方法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，為凈化非洲豬瘟病毒奠定了基礎(chǔ)?；诜侵挢i瘟病毒p54蛋白抗原表位，曹琛福[16]同樣建立了血清抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，并形成了深圳市地方性標(biāo)準(zhǔn)《非洲豬瘟病毒抗體檢測(cè)阻斷酶聯(lián)免疫吸附法》 （SZDB/Z 131-2015），為我國(guó)動(dòng)物疫病檢測(cè)提供了標(biāo)準(zhǔn)性指導(dǎo)文件。

3 小結(jié)

自2018 年8 月非洲豬瘟疫情在我國(guó)發(fā)生以來(lái)，針對(duì)非洲豬瘟病毒抗原、抗體檢測(cè)的技術(shù)層出不窮，中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心組織了非洲豬瘟現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)評(píng)審，對(duì)各種檢測(cè)方法進(jìn)行了技術(shù)把關(guān)，為非洲豬瘟病毒疫病防控提供了技術(shù)保證。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所針對(duì)非洲豬瘟病毒疫苗的研制有了突破性進(jìn)展，該病的防控和凈化歷程是長(zhǎng)期的過(guò)程，ASFV 的早期診斷是控制和預(yù)防非洲豬瘟病毒蔓延的重要手段，快速、準(zhǔn)確、便捷的診斷技術(shù)是發(fā)展的重要方向[17]。