李樹斌 張雅璇 王春雨 任敬宇 戴雁峰

（內(nèi)蒙古大學生命科學學院， 內(nèi)蒙古呼和浩特 010021）

1987—1996 年，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV） 感染、侵襲引發(fā)的豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS，又稱豬藍耳病）在美國全面暴發(fā)，隨后該疾病陸續(xù)傳播至北美、歐洲等各個國家和地區(qū)，妊娠母豬感染該病后表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)率顯著增加36.4%，死胎率顯著增加6.6%，而新生仔豬存活率降低6.7%，哺乳期仔豬的存活率減少30.7%，同時，仔豬肺炎嚴重，生長速度劇烈下降[1]。

從1996 年我國發(fā)現(xiàn)首例豬藍耳病開始，至今已有30 余年，藍耳病反復發(fā)作嚴重阻滯了我國生豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。近年來我國出現(xiàn)的高致病性豬藍耳病進一步對我國生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了致命打擊，而且我國的養(yǎng)豬企業(yè)存在豬群密集、流動頻繁等情況，進一步擴大了感染范圍，由于目前商業(yè)化的疫苗只能提供部分保護，因此藍耳病的迅速傳播嚴重損害了養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益，基于PRRSV 入侵機體的機理研發(fā)對應的抗體，提升我國生豬對PRRSV 的抵抗力對保障我國生豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。

1 PRRSV 結(jié)構(gòu)及其感染過程

1.1 PRRSV 及基因組結(jié)構(gòu)

PRRSV 與馬動脈炎病毒（Equine arteritis virus,EAV）、小鼠乳酸脫氫酶病毒（Lactate dehydrogenase elevating virus,LDV）以及猴出血熱病毒（Simian hemorrhagic fever virus,SHFV）等病毒均隸屬于尼多病毒目（Nidovirales）動脈炎病毒科（Arteriviridae）動脈炎病毒屬的主要成員。在電子顯微鏡下觀測，PRRSV 的直徑為50～60 nm，呈球形或橢圓形顆粒，具有相對光滑的外觀，PRRSV 的核衣殼直徑為25～35 nm，呈20 面立體對稱結(jié)構(gòu)，具有電子致密性，同時，核衣殼表面有約5 nm 的突起結(jié)構(gòu)，其外圍被一層脂質(zhì)雙層膜圍繞[2]。

作為不分節(jié)段的單股、正鏈RNA 病毒，PRRSV 的基因組RNA 長度約為15 kb，在其5’端處存在帽子結(jié)構(gòu)（5’-Cap），而3’端具有多聚腺嘌呤核苷酸尾巴結(jié)構(gòu)（3’-polyA），目前的研究報道指出，在病毒復制過程中，3’端的結(jié)構(gòu)域可能是RNA 聚合酶結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域之一。

PRRSV 基因組結(jié)構(gòu)中含有9 個開放閱讀框（open reading frame, ORFs）， 分 別 為 ORF1a、 ORF1b、ORF2a、 ORF2b、 ORF3、 ORF4、 ORF5、 ORF6 及ORF7，以上每個閱讀框之間都與其相鄰的閱讀框之間存在部分的堿基重疊區(qū)域，重疊序列結(jié)構(gòu)為5’-ORF1a和ORF1b-ORF(2-6)ORF7-3’端。

ORF1（ORF1a 與ORF1b 之間存在16 個重疊的核苷酸） 長度約為12 kb，占整個基因組全長的80%。ORF1 閱讀框位于PRRSV 基因組5’端的非編碼前導序列（211 個堿基）之后，其主要功能是編碼部分高度保守的非結(jié)構(gòu)蛋白以及RNA 聚合酶或合成酶等蛋白，在ORF1a 編碼區(qū)中存在絲氨酸蛋白酶區(qū)和富含半胱氨酸區(qū)的疏水區(qū)域，而ORF1b 的序列中存在4 個特異區(qū)域，即聚合酶元序列區(qū)域、蝸牛酶元序列區(qū)域、富含半胱氨酸和組氨酸的鋅指區(qū)域及目前功能尚未明確的保守區(qū)域。在ORF1a 和ORF1b 的重疊區(qū)存在7 個核苷酸結(jié)構(gòu)（UUUAAAC）和形成RNA 擬節(jié)序列，這2 種序列（結(jié)構(gòu)）進一步參與調(diào)控RNA 聚合酶翻譯過程中的核糖體移碼。

ORF2～ORF7 分布在PRRSV 基因組的約3.5 kb 3’端，ORF7 終止密碼子后為114 個堿基的非編碼區(qū)和僅20 個堿基的3’-poly（A）尾巴序列。ORF2～ORF7 主要的生物學功能是負責編碼病毒中的結(jié)構(gòu)蛋白，如囊膜糖蛋白（如GP5 蛋白）、基質(zhì)蛋白（M 蛋白）及核衣殼蛋白（N 蛋白）等。由ORF6 編碼的M 蛋白和由ORF7編碼的N 蛋白為PRRSV 結(jié)構(gòu)中的優(yōu)勢結(jié)構(gòu)蛋白，其氨基酸序列相對保守，目前已被用于疾病診斷的靶抗原[2-4]。

1.2 PRRSV 分型

根據(jù)PRRSV 的抗原性、基因組及致病性等特性，目前可將PRRSV 分為2 個主要亞型，即歐洲型（主要以LV 株為代表株）和美洲型（主要以ATCC-VR2332株為代表株）[5,6]，基因組學和遺傳學相關(guān)研究結(jié)果表明，PRRSV 在RNA 合成過程中極易發(fā)生RNA 基因組的點突變、堿基缺失、添加和取代等過程，從而導致PRRSV的突變頻率極高，而且大量針對不同地區(qū)PRRSV 的序列分析結(jié)果進一步證實PRRSV 歐洲型和美洲型之間的確存在極大的序列差異性，其核苷酸的同源性僅為55%～70%。

PRRSV 的歐洲型與美洲型毒株中5’UTR 和3’UTR 的序列差異非常顯著，其同源性顯著低于50%。在歐洲型毒株的5’UTR 結(jié)構(gòu)域中存在221～223 個核苷酸，而在美洲型毒株中，序列相對保守的5’UTR 結(jié)構(gòu)域中存在189～190 個核苷酸，僅存在個別堿基的置換或缺失情況。與歐洲型毒株相比，美洲型毒株的3’UTR 序列更長，2 種毒株3’UTR 堿基序列的同源性顯著低于60%，此外，2 種毒株的polyA 數(shù)量間的差異性進一步影響了PRRSV 的復制過程。

通過深入分析、比對歐、美型毒株的序列的差異，結(jié)果表明歐、美型毒株之間，ORF1 序列的差異性較大，而ORF1 序列的差異性主要是由ORFla 序列的差異性所決定，分析原因認為，Nsp1β 及Nsp2 等非保守氨基酸的差異性決定了歐、美型毒株之間的差異性。作為歐、美型毒株間變異最大的編碼區(qū)域之一，Nsp2 具有種間特異性，其生物學功能是參與調(diào)控PRRSV 對細胞或組織的嗜性。有研究報道指出，Nsp2 的活性與PRRSV 毒株的致病性密切相關(guān)。

1.3 PRRSV 感染豬的過程

在PRRSV 感染豬群的過程中，該病毒可以通過環(huán)境應激、垂直傳播及水平傳播等途徑進入病豬鼻腔中，粘附后破壞鼻腔黏膜組織及纖毛結(jié)構(gòu)，進一步導致纖毛失去其原有生理功能，不能有效地過濾病毒入侵；隨著PRRSV 入侵咽喉及支氣管腔，病毒進一步定植于支氣管腔上皮細胞處，快速引發(fā)豬咳嗽及大喘氣；隨著感染的深入，PRRSV 進一步降低了豬對支原體等病原的抵抗性，導致了鼻腔內(nèi)纖毛的大量脫落及纖毛上皮細胞的急性損傷，同時抑制了纖毛的擺動，導致纖毛喪失其甩動黏液的功能。

在支原體等抗原的催化作用下，PRRSV 可特異性地與細胞表面的CD151 分子、CD163 分子、硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate, HS）、唾液酸粘附素（Sialoadhesin, Sn）以及波形蛋白（Vimentin）等受體進行特異性結(jié)合，促進自身經(jīng)胞吞作用進入豬肺泡巨噬細胞（porcine alveolar macrophage），并在肺泡巨噬細胞中快速擴增，進而導致肺泡巨噬細胞的破裂、溶解以及肺泡巨噬細胞數(shù)量顯著下降，從而抑制豬肺泡的正常生理功能，并引發(fā)機體產(chǎn)生免疫抑制。肺泡巨噬細胞的破裂導致PRRSV 進一步隨著血液循環(huán)系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)擴散至全身，并進一步在血液巨噬細胞和單核細胞中快速擴繁，進一步引發(fā)全身性敗血癥狀、淋巴腫大及相應肺臟器官損傷等，嚴重時導致豬個體死亡[4,7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，以上這些受體中CD163 是PRRSV 感染宿主細胞的必需受體。

2 CD163 與PRRSV 感染的相關(guān)性研究

在機體的免疫過程中，巨噬細胞起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，其機理與成熟的巨噬細胞和它的前體——單核細胞密切相關(guān)，上述2 類細胞在機體免疫過程中形成高度特異化的細胞亞群，密切參與機體的免疫過程。巨噬細胞亞群的生物學功能主要取決于巨噬細胞表面的不同特異性受體，如補體受體（Complement receptor）、清道夫受體（scavenger receptor）、Fc 受體（The Fc receptor）、生長因子、粘附分子和可溶性介質(zhì)受體等。其中，包括了膠原型受體、C 型外源凝集素受體、富含亮氨酸或半胱氨酸重復序列型受體等成員的清道夫受體家族功能基本相似，但其結(jié)構(gòu)多種多樣，按照其結(jié)構(gòu)特性，可將清道夫受體家族進一步依次劃分為8 個類型（A-H）。

CD163 作為富半胱氨酸清道夫受體（scavenger receptor cysteine-rich domain, SRCR） 超家族的主要成員之一，其I 型跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域是PRRSV 感染細胞必需的結(jié)構(gòu)，而且不同動物之間跨膜域的蛋白序列也具有良好的保守性，其生物學功能與受體分子與細胞膜的錨定過程密切相關(guān)。

2.1 CD163 結(jié)構(gòu)和功能

CD163 蛋白的分子量約為130 kDa，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3 部分組成，CD163 的胞外區(qū)是由9 個重復的SRCR（scavenger receptor cysteine rich）結(jié)構(gòu)域和2 個脯氨酸—絲氨酸—蘇氨酸富集結(jié)構(gòu)域（PST）構(gòu)成的。CD163 中的每個SRCR 結(jié)構(gòu)域均由100～110 個氨基酸殘基構(gòu)成，需要指出的是除第8 個SRCR 結(jié)構(gòu)域中存在6 個半胱氨酸殘基外，其余的SRCR 結(jié)構(gòu)域均只含有8 個半胱氨酸殘基[10]。

早期研究結(jié)果表明，CD163 可作為有核紅細胞的附著受體，密切參與調(diào)節(jié)體內(nèi)紅細胞的生成過程。隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)表達CD163 蛋白的巨噬細胞具有清除血液中血紅素的作用，在該過程中，CD163 蛋白質(zhì)的第3 個富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域暴露于巨噬細胞表面，在Ca2+和pH 值的調(diào)控下，該結(jié)構(gòu)域可特異性地結(jié)合血紅素—結(jié)合珠蛋白（hemoglobin haptoglobin complex, Hb-Hp）復合體，隨后將其運輸至早期細胞內(nèi)體中，之后，CD163 迅速脫離復合體，重新轉(zhuǎn)移到巨噬細胞的細胞膜表面，而Hb-Hp 復合物則在溶酶體中被進一步水解。因此，CD163 介導的細胞內(nèi)吞作用可以快速清除細胞周圍的Hb-Hp 復合物，從而使組織或細胞不受Hb 引發(fā)的氧化損傷等不利情況。另外，CD163與Hb-Hp 復合物的特異性結(jié)合可進一步激活如IL-10、Fe2+、CO 和膽紅素等炎癥相關(guān)因子的釋放。

此外，CD163 在人和小鼠的單核細胞/巨噬細胞表面特異性表達，而且密切參與巨噬細胞的分化過程[11]。CD163 的表達水平受促炎信號和抑炎信號調(diào)控，并在免疫應答過程中發(fā)揮著重要的作用。目前在臨床血液和體液中均可檢測到可溶性CD163（soluble CD163,sCD163）的表達，這種由CD163 胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的復合物可在臨床上作為單獨的生物標記物?？扇苄缘腃D163 和跨膜的CD163 分子均具有很強的抗炎癥作用，但只有可溶性的CD163 分子對T 細胞的增殖有抑制作用[11]。同時，CD163 還是PRRSV 和SHFV11 等病毒感染過程中的關(guān)鍵受體。

2.2 CD163 在PRRSV 入侵過程中的作用

在豬體內(nèi)，PRRSV 主要感染豬肺泡巨噬細胞（Porcine alveolar macrophage, PAM）。研究人員在對PAM 細胞的cDNA 表達文庫篩選時發(fā)現(xiàn)，在細胞中過表達CD163 蛋白后，可以將PRRSV 非易感細胞系轉(zhuǎn)變?yōu)镻RRSV 易感細胞系。如在PAM 細胞系3D4/21（把SV40 的大T 抗原轉(zhuǎn)入已構(gòu)建的永生化細胞系）中，發(fā)現(xiàn)該永生細胞系并不能感染PRRSV，并且在這個細胞系中并沒有檢測到CD163 分子的表達水平[12]，但在永生化細胞系中對CD163 進行過表達則導致細胞系容易感染PRRSV，細胞系中高表達CD163 后，PRRSV 對細胞系的感染能力急劇增加，而且細胞內(nèi)產(chǎn)生的病毒滴度顯著高于MARC-145 細胞感染PRRSV 后產(chǎn)生的病毒滴度。

同時，在不能感染PRRSV 的細胞系（LLC-PK1、PK-0809、BHK-21 和NLFK 細胞系） 中對CD163 進行過表達，可以使這些細胞系易被PRRSV 感染并產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，而且在自然狀態(tài)下，Dulac 細胞（PK15 細胞亞系）和PK15 細胞均無法感染PRRSV，但過表達CD163 分子后卻能使上述2 種細胞系易被PRRSV 感染。

Genus Plc 公司和美國密蘇里大學在2016 年合作，利用最新的CRISPR-Cas9 技術(shù)培育出了CD163 基因缺失的基因編輯豬，系列攻毒試驗結(jié)果表明，CD163 基因缺失豬不能被PRRSV 感染，這個關(guān)鍵性的成果進一步表明CD163 是PRRSV 感染豬宿主必需的受體[13]。

盡管在上述非易感PRRSV 細胞系中瞬時過表達CD163 分子能夠使其轉(zhuǎn)變?yōu)橐赘蠵RRSV 細胞系，但內(nèi)化的病毒粒子水平極低，而且PRRSV 只在部分細胞中表現(xiàn)出數(shù)量的上調(diào)[14]，這表明CD163 在PRRSV 的內(nèi)化過程中并不是起著關(guān)鍵的作用。將抗CD163 的單克隆抗體與PAM 細胞系一起在37℃下孵育，發(fā)現(xiàn)PAM 細胞中的PRRSV 感染水平被顯著性抑制，但在4℃條件下用同樣的抗體和細胞進行孵育，發(fā)現(xiàn)PAM 細胞中PRRSV的感染水平無顯著變化，上述試驗結(jié)果說明CD163 在調(diào)控PRRSV 的感染過程中，主要參與的是病毒內(nèi)吞和脫殼，而非吸附或內(nèi)化過程。

3 小結(jié)

綜上所述，CD163 在單核細胞/巨噬細胞表面特異性表達，是PRRSV 入侵細胞時的必需受體，該分子既可以結(jié)合PRRSV 顆粒，還密切參與調(diào)控病毒RNA 在宿主細胞內(nèi)復制的過程[15]。有學者發(fā)現(xiàn)，在PRRSV 感染宿主細胞及豬發(fā)病的過程中，CD163 不僅能促進病毒的內(nèi)吞及外殼的脫落，還在基因組RNA 釋放到宿主細胞胞質(zhì)的過程中起著重要的調(diào)控作用，因此，進一步了解PRRSV 與CD163 的特征及關(guān)系有助于有效防治豬的PRRS。