陳天翔 楊運(yùn)海

肺癌是我國(guó)乃至世界發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤之一[1]。大約85%的肺癌是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），早期NSCLC經(jīng)手術(shù)治療5年生存率可達(dá)70%-90%[2]，但是約75%的患者在初診時(shí)已是進(jìn)展期或晚期[3]。小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）在肺癌中僅占15%左右，但是SCLC更具侵襲性，超過(guò)90%的患者在診斷時(shí)已是晚期[3]，5年生存率僅為5%。晚期肺癌是肺癌治療的主要挑戰(zhàn)，近年來(lái)以表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）、ROS1等為靶點(diǎn)的藥物均臨床上展現(xiàn)了卓越療效，已成為僅次于化療的主要治療方式。例如，三代EGFR抑制劑奧西替尼（AZD9291）的中位無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival, PFS）可達(dá)19.3個(gè)月[4]，二代ALK抑制劑色瑞替尼在無(wú)腦轉(zhuǎn)移患者中的PFS可超過(guò)2年[5]。但是這些抑制劑僅適用于具備該靶點(diǎn)的患者，而其他患者則無(wú)法從中獲益，只能選擇收效甚微的化療。因此深入研究肺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找新的靶點(diǎn)刻不容緩。環(huán)狀RNA（circular RNA, circRNA）是一類(lèi)缺少5'與3'端，由共價(jià)鍵形成閉合環(huán)狀的特殊RNA。這種特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使得circRNA對(duì)核酸外切酶RNase R耐受，在胞內(nèi)的半衰期超過(guò)48 h，呈現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性[6]。此外circRNA在真核生物內(nèi)含量豐富，表達(dá)具有組織特異性與疾病特異性，同時(shí)參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移，有望成為腫瘤的生物標(biāo)記物與治療靶點(diǎn)。

1 CircRNA在肺癌中的表達(dá)及意義

1.1 CircRNA的診斷價(jià)值 提高早期診斷率是改善肺癌生存率的關(guān)鍵。目前關(guān)于肺癌分子標(biāo)記物的研究主要集中在腫瘤循環(huán)細(xì)胞、循環(huán)DNA、循環(huán)miRNA、血清腫瘤標(biāo)志物、肺癌自身抗體等，前三種標(biāo)記物在早期肺癌的血液含量極為有限，敏感性不足，后兩種標(biāo)記物的敏感性與特異性均不理想[7]，而circRNA的出現(xiàn)則為肺癌的早期診斷帶來(lái)了新的希望。Zhu等[8]利用circRNA芯片技術(shù)在肺腺癌患者腫瘤組織中鑒定出39個(gè)異常表達(dá)的circRNA，經(jīng)驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0013958在細(xì)胞株、組織及血漿中均高表達(dá)。且發(fā)現(xiàn)組織hsa_circ_0013958的表達(dá)與原發(fā)灶-淋巴結(jié)-遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis, TNM）分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。以健康人群為對(duì)照，血漿與組織hsa_circ_0013958的受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve,ROC）曲線下面積（area under the curve, AUC）分別為0.794與0.815。隨后研究人員對(duì)hsa_circ_0013958在不同分期肺腺癌的AUC分別進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)組織hsa_circ_0013958在早期肺腺癌的診斷中依舊表現(xiàn)優(yōu)良，其在I期與II期的AUC依次為0.75、0.766。Hang等[9]利用RNA-seq結(jié)合qRTPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)circFARSA在NSCLC患者血漿中表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤組織中circFARSA的表達(dá)呈線性相關(guān)，而FARSA的mRNA在血漿中無(wú)法檢測(cè)出。以健康人群為對(duì)照，血漿circFARSA具有一定的診斷價(jià)值，AUC為0.71。CircRNA_102231與hsa_circ_0000729在肺腺癌組織中均異常高表達(dá)，并與TNM分期、轉(zhuǎn)移相關(guān)，circRNA_102231的AUC為0.897，敏感性與特異性分別為0.812、0.887，hsa_circ_0000729的AUC為0.815[10,11]。此外，Tan等[12]發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合可表達(dá)融合circRNA（F-circEA），而F-circEA僅特異性地表達(dá)于EML4-ALK陽(yáng)性患者的血漿內(nèi)，提示F-circEA有望開(kāi)發(fā)為EML4-ALK陽(yáng)性的診斷標(biāo)記物。

1.2 CircRNA的預(yù)后價(jià)值 預(yù)后評(píng)價(jià)是制定臨床方案的重要參考項(xiàng)，對(duì)于延長(zhǎng)患者生存期意義重大。Zou等[13]發(fā)現(xiàn)circ-0067934在NSCLC腫瘤組織及細(xì)胞株內(nèi)均顯著高表達(dá)。Kaplan-Meier生存與對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)分析表明circ-0067934高表達(dá)與總體生存期負(fù)相關(guān)，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析指出circ-0067934可作為NSCLC患者不良預(yù)后判斷的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子。CiRS-7作為超級(jí)海綿，在肺癌中的預(yù)后價(jià)值也有一定的研究。Su等[14]分別檢測(cè)了128例NSCLC患者腫瘤組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn)ciRS-7異常上調(diào)，miR-7異常下調(diào)。而高表達(dá)ciRS-7、低表達(dá)miR-7的NSCLC患者往往較為晚期，一般瘤體較大，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，生存期較短，作者認(rèn)為高表達(dá)ciRS-7與低表達(dá)miR-7均是患者不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。Liu等[15]發(fā)現(xiàn)circ_0001649在NSCLC腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后相關(guān)。Hsa_circRNA_000122在肺鱗癌中表達(dá)下調(diào)，低表達(dá)hsa_circRNA_000122的患者總體生存期顯著縮短，有望開(kāi)發(fā)為肺鱗癌的預(yù)后標(biāo)記物[16]。

2 CircRNA在肺癌進(jìn)展中的作用及機(jī)制

與大多數(shù)腫瘤一樣，肺癌在發(fā)生發(fā)展中亦表現(xiàn)出惡性增殖、凋亡抵制、侵襲增強(qiáng)以及無(wú)法避免的耐藥性。CircRNA雖然在肺癌中異常表達(dá)，并與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，但是circRNA是否參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展呢？

2.1 促進(jìn)肺癌增殖 Hsa_circ_0013958在肺腺癌中異常高表達(dá)，敲除hsa_circ_0013958可以抑制細(xì)胞的增殖[8]。Zhu等[17]首先利用原位雜交對(duì)hsa_circ_0013958進(jìn)行定位分析，發(fā)現(xiàn)其主要分布在胞漿，作者推測(cè)其可能作為miRNA海綿進(jìn)而促進(jìn)增殖。隨后利用CIRCBASE以及STARBASE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)hsa_circ_0013958可能結(jié)合的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)一步驗(yàn)證，鑒定出了miR-134-5p。此外，過(guò)表達(dá)hsa_circ_0013958可以增加細(xì)胞周期D1的表達(dá)，而同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-134可抑制其表達(dá)，提示hsa_circ_0013958可作為miR-134的海綿，上調(diào)細(xì)胞周期D1的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。CircPVT1在NSCLC患者的組織及血清中均過(guò)度表達(dá)，敲除circPVT1可以抑制細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期于G0期/G1期。通路報(bào)告芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)敲除circPVT1后，E2F通路發(fā)生了最顯著的抑制，同時(shí)過(guò)表達(dá)E2F2可以逆轉(zhuǎn)circPVT1沉默后的細(xì)胞生存抑制。E2F2是E2F轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，可以通過(guò)啟動(dòng)子區(qū)的E2識(shí)別位點(diǎn)與DPDP1多肽共結(jié)合于DNA，推進(jìn)包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的細(xì)胞周期、促進(jìn)其惡性增殖。數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)及熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證明miR-125b與circPVT1、E2F2發(fā)生靶向結(jié)合，沉默circPVT1將促進(jìn)miR-125b與E2F2的結(jié)合，抑制NSCLC細(xì)胞增殖。在體內(nèi)敲除circPVT1抑制了瘤體的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，以上均提示circPVT1有望開(kāi)發(fā)為NSCLC治療的靶點(diǎn)。此外，Chen等[18]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_100395通過(guò)miR-1228/TCF21信號(hào)軸推進(jìn)細(xì)胞周期、促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖。Circ-PUM1可作為miR-326的海綿，增加細(xì)胞周期D1的表達(dá)，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖[19]。

2.2 抑制肺癌凋亡 Yu等[20]發(fā)現(xiàn)circHIPK3在肺癌細(xì)胞中表達(dá)增加，沉默circHIPK3顯著抑制細(xì)胞的生存，并誘導(dǎo)其凋亡。為找到circHIPK3在肺癌中可能結(jié)合的miRNA，Yu等[20]在沉默了circHIPK3的細(xì)胞中分別干擾三個(gè)備選miRNA，發(fā)現(xiàn)僅有轉(zhuǎn)染了miR-124抑制劑的細(xì)胞發(fā)生了表型的逆轉(zhuǎn)。此外，沉默circHIPK3可抑制miR-124靶基因SphK1、STAT3及CDK4的表達(dá)，抑制miR-124可增加這些靶基因的表達(dá)，提示circHIPK3通過(guò)miR-124-SphK1/STAT3/CDK4信號(hào)軸傳遞凋亡抵制信號(hào)，從而促進(jìn)肺癌的惡性進(jìn)展，為NSCLC的治療提供了新的策略。CircUBAP2與hsa_circ_0000064在肺癌組織中均表達(dá)增加，分別沉默這兩種circRNA后均可以抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡[21,22]。沉默circUBAP2可以抑制Bcl-2、Survivin的表達(dá)，并上調(diào)Bax的表達(dá)，同時(shí)JNK、ERK1/2的活性也被抑制，提示circUBAP2可能通過(guò)干預(yù)JNK與ERK1/2通路促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。熒光素酶報(bào)告基因分析miR-339-5p、miR-96-3p與miR-135b-3p均可以與circUBAP2結(jié)合，但這些miRNA是否可以調(diào)控circUBAP2抑制凋亡的作用并不清楚。沉默hsa_circ_0000064后，Caspase-3、Caspase-9、Bax表達(dá)增加，bcl-2表達(dá)減少，關(guān)于hsa_circ_0000064與凋亡抑制之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)需要更多的研究。

2.3 促進(jìn)肺癌的轉(zhuǎn)移 腫瘤轉(zhuǎn)移是造成癌癥患者死亡的最主要原因之一。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)NSCLC高表達(dá)TGF-β可以刺激NSCLC細(xì)胞自身的EMT。TIF1γ在NSCLC中低表達(dá)，敲除或下調(diào)TIF1γ可以增強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo)的EMT作用。Wang等[23]首先在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TGF-β誘導(dǎo)EMT發(fā)生，然后進(jìn)行circRNA芯片分析，并檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TIF1γ表達(dá)減少。于是假設(shè)某些circRNA的異常表達(dá)抑制了TIF1γ表達(dá)，進(jìn)而激活了TGF-β誘導(dǎo)的EMT。根據(jù)算法對(duì)TargetScan/miRBase以及miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)分析后發(fā)現(xiàn)，circPTK2與TIF1γ均存在miR-429/miR-200b-3p的結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證明circPTK2與TIF1γ均可與miR-429/miR-200b-3p的直接結(jié)合。該研究發(fā)現(xiàn)circPTK2可以通過(guò)海綿miR-429/miR-200b-3p抑制TIF1γ的表達(dá)來(lái)調(diào)控NSCLC的轉(zhuǎn)移，豐富了TGF-β誘導(dǎo)的EMT機(jī)理。Qu等[24]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0020123在NSCLC中表達(dá)增加，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)，敲除hsa_circ_0020123可以抑制腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移，過(guò)表達(dá)hsa_circ_0020123則表現(xiàn)出相反的表型。數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)及熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證明發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0020123可以通過(guò)miR-144-ZEB1/EZH2軸促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。ZEB1是激活EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子，EZH2是Zeste同源增強(qiáng)子，可激活Notch1促進(jìn)腫瘤的EMT[25]。雖然該研究并沒(méi)有檢測(cè)EMT的標(biāo)志物，但是推測(cè)hsa_circ_0020123可能通過(guò)miR-144-ZEB1/EZH2軸啟動(dòng)NSCLC的EMT、促進(jìn)其轉(zhuǎn)移。此外，circ-0067934、hsa_circ_0079530及hsa_circ_0007534在NSCLC患者中均表達(dá)增加，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。分別沉默這些circRNA均可削弱細(xì)胞的遷移與侵襲能力、逆轉(zhuǎn)EMT表型，表明這三種circRNA均可通過(guò)調(diào)控EMT促進(jìn)NSCLC的轉(zhuǎn)移[13,26,27]。

2.4 誘導(dǎo)肺癌耐藥 雖然現(xiàn)有靶向藥物在肺癌的治療中表現(xiàn)良好，但是每一種藥物均會(huì)迎來(lái)耐藥，使得晚期肺癌患者陷入了無(wú)藥可用的絕境，因此深入理解耐藥機(jī)制、尋找新的靶點(diǎn)異常重要。Xu等[28]利用高通量circRNA芯片檢測(cè)了A549敏感株及其紫杉醇耐藥株A549/Taxol。與敏感株相比，A549/Taxol中2,909個(gè)circRNA表達(dá)顯著上調(diào)，8372個(gè)circRNA顯著下調(diào)，提示circRNA的異?？赡軈⑴c調(diào)控了紫杉醇耐藥的發(fā)生。Zhou等[29]利用circRNA芯片在HCC827敏感株及其埃克替尼耐藥株HCC827I/R中篩選出了hsa_circ_0004015。臨床樣本分析表明hsa_circ_0004015在NSCLC患者組織中表達(dá)增加，與不良生存率相關(guān)。在HCC827中過(guò)表達(dá)hsa_circ_0004015可誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐受，在HCC827I/R中敲除hsa_circ_0004015后可增加HCC827I/R對(duì)吉非替尼的敏感性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0004015可以通過(guò)miR-1183/PDPK1軸調(diào)控細(xì)胞的耐受性。

3 討論與展望

部分circRNA在肺癌中穩(wěn)定異常表達(dá)，具有良好的靈敏度與特異性，并被證實(shí)與不良預(yù)后相關(guān)，為肺癌的早期診斷與預(yù)后標(biāo)記物的開(kāi)發(fā)提供了新的選擇。隨著時(shí)間的推移，將會(huì)有更多具有臨床價(jià)值的circRNA被發(fā)現(xiàn)，但是現(xiàn)有研究存在一些局限性：①研究局限于NSCLC，而circRNA在SCLC患者中的診斷/預(yù)后價(jià)值研究尚屬空白。臨床研究發(fā)現(xiàn)，I期SCLC患者經(jīng)手術(shù)切除輔助化療后5年生存率可達(dá)52%[30]，約是晚期患者5年生存率的10倍，因此通過(guò)探索SCLC中潛在circRNA標(biāo)志物是提升早期診斷率的重要途徑。②主要評(píng)估了肺癌組織circRNA的表達(dá)，而血液circRNA的表達(dá)與診斷價(jià)值尚不清楚。③多數(shù)研究是基于單中心、小樣本的單個(gè)circRNA研究。肺癌是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，現(xiàn)有的研究結(jié)果都是建立在單中心、小樣本數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，因此這些發(fā)現(xiàn)的circRNA恐怕未必能夠在多中心、大樣本數(shù)據(jù)中得到理想驗(yàn)證，故針對(duì)多個(gè)circRNA構(gòu)建肺癌相關(guān)的circRNA組（circRNA panel）進(jìn)行研究才有機(jī)會(huì)推動(dòng)circRNA真正走向臨床。

胞漿circRNA通過(guò)海綿miRNA調(diào)控肺癌的發(fā)生發(fā)展是目前機(jī)制研究的主流，而核內(nèi)circRNA在肺癌中的機(jī)制研究尚不清楚。然而大多數(shù)circRNA并不具備豐富的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)大量circRNA作為miRNA海綿提出了質(zhì)疑，同時(shí)提醒我們circRNA在肺癌中的作用機(jī)制可能不僅局限于miRNA的海綿[31]。翻譯蛋白質(zhì)，尤其是具有活性的蛋白質(zhì)，均是circRNA的重要功能，而肺癌中異常表達(dá)的circRNA或許可以通過(guò)翻譯出活性蛋白質(zhì)調(diào)控其惡性進(jìn)展，這些活性蛋白是否可以成為新的靶點(diǎn)是未來(lái)研究一個(gè)重要方向。此外，在circRNA調(diào)控肺癌進(jìn)展的機(jī)制研究中，均以單一的腫瘤細(xì)胞為對(duì)象，而腫瘤微環(huán)境中的circRNA是否異常表達(dá)，微環(huán)境中不同細(xì)胞中的circRNA是否異常表達(dá)，以及這些circRNA是否可以在不同細(xì)胞中傳遞進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展均不清楚。腫瘤微環(huán)境是腫瘤發(fā)生發(fā)展的土壤，深入理解circRNA在腫瘤微環(huán)境中的作用機(jī)制，在腫瘤早期未成熟前進(jìn)行干預(yù)是重要的研究方向。

現(xiàn)有研究提示未來(lái)circRNA在肺癌的臨床診斷，治療及預(yù)后預(yù)測(cè)中的潛在作用，而circRNA在肺癌發(fā)生發(fā)展中的已知作用機(jī)制將是研究肺癌新治療方法的潛在靶點(diǎn)。