吳海清 ，肖 萍 ，何新益 ，王 娜

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384）

“食品微生物學(xué)實驗”作為食品專業(yè)的基礎(chǔ)實驗課，其實用性、技術(shù)性、應(yīng)用性極強[1]。對于食品科學(xué)類學(xué)生和食品領(lǐng)域的從業(yè)人員來說，食品微生物學(xué)實驗是必備的實驗技能[2]，課程內(nèi)容一般分為驗證性實驗、綜合性實驗、設(shè)計性實驗3種類型[3]，其中綜合性實驗是多個基礎(chǔ)的驗證性實驗的連續(xù)開展，可提升學(xué)生實驗的綜合處理能力[4]。為了提高學(xué)生的綜合實驗技能，提高學(xué)生設(shè)計、分析及解決實驗中出現(xiàn)問題的能力，課題組設(shè)計了“傳統(tǒng)發(fā)酵食品中乳酸菌的分離、純化及分子生物學(xué)鑒定”綜合性實驗的案例。通過2年的改革與實施，取得了良好的實驗教學(xué)效果，為進一步深化教學(xué)改革具有重要的參考價值。

1 實驗設(shè)計理念

參考國家標(biāo)準(zhǔn)，在“食品微生物學(xué)實驗”細(xì)菌學(xué)分離鑒定這部分實驗環(huán)節(jié)，課題小組設(shè)立了“傳統(tǒng)發(fā)酵食品中乳酸菌的分離、純化及分子生物學(xué)鑒定綜合性實驗”，此實驗包含材料采集、培養(yǎng)基的配置與滅菌、微生物的純種分離和培養(yǎng)、光學(xué)顯微鏡的操作和純培養(yǎng)菌種的形態(tài)觀察、微生物的染色、微生物的種類鑒定、菌種的保藏等環(huán)節(jié)。該實驗具有很強的科研屬性，學(xué)生不僅要參與實驗的準(zhǔn)備，而且更需要用科研的思維來完成實驗任務(wù)，包括深入理解實驗的目的和意義、查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資料、設(shè)計實驗方案、確定實驗方法和步驟、準(zhǔn)備實驗材料、學(xué)習(xí)儀器的使用方法、配制實驗所需試劑、撰寫預(yù)習(xí)報告和實驗報告等。通過這一系列實驗環(huán)節(jié)，訓(xùn)練學(xué)生從混雜的環(huán)境中分離、鑒定出單一菌株，并學(xué)會保藏菌種，鍛煉學(xué)生用理論知識指導(dǎo)實踐的能力，融合基礎(chǔ)實驗所學(xué)的操作技術(shù)，綜合運用到實驗項目中，進一步鍛煉學(xué)生的團隊協(xié)作能力。為今后的大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練和畢業(yè)論文等教學(xué)實踐環(huán)節(jié)打下了堅實的基礎(chǔ)[5-6]。

2 實驗?zāi)康暮鸵?/h2>

了解乳酸菌的菌體形態(tài)和菌落特征形態(tài)，學(xué)習(xí)乳酸菌的分離原理，掌握乳酸菌的分離方法與操作技術(shù)，PCR擴增基因的基本方法，掌握細(xì)菌傳統(tǒng)鑒定及16SrRNA分子鑒定的方法，并能熟練操作該項技術(shù)。該實驗共9學(xué)時，每小組6～7人。

3 實驗內(nèi)容和方法

（1）樣品。未成熟的醬醪、泡菜或酸乳等。

（2）實驗設(shè)備。鼓風(fēng)干燥箱、高壓蒸汽滅菌鍋、PCR儀、顯微鏡，電泳槽，電泳儀，PCR擴增儀，高速冷凍離心機，凝膠成像儀、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱等。

（3） 試劑。溴甲酚綠（BCG） 牛乳營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、M17肉湯培養(yǎng)基；基因組DNA提取試劑盒、2×Mixture、瓊脂糖、50×TAE、通用引物（27F和1492R）、革蘭氏染色試劑盒等；Gelred核酸染料、DNA Ladder（核酸Marker） 等。

（4）實驗原理。采用分離鑒定培養(yǎng)基將檢樣中乳酸菌分離出來，得到純菌株，再進行16SrRNA序列進行分子生物學(xué)鑒定。

（5）實驗操作步驟。①培養(yǎng)基的配制：溴甲酚綠（BCG）牛乳營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、M17肉湯培養(yǎng)基分別滅菌，無菌檢查合格后備用。②乳酸菌的分離：按照國標(biāo)的方法進行無菌操作，接種于BCG培養(yǎng)基，于37℃下培養(yǎng)24～48 h，挑取典型菌落進行革蘭氏染色，鏡檢。③乳酸菌的純化：將革蘭氏染色為陽性的乳桿菌分別接種于MRS、M17瓊脂培養(yǎng)基中連續(xù)傳代3次，鏡檢、菌落特征進行純種鑒別。④乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定：模板DNA提取、16SrRNA基因擴增、PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測均由學(xué)生獨立完成，PCR產(chǎn)物純化及測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。將測得的16S rDNA序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫，進行BLAST同源性比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。⑤實驗結(jié)果：分離出的乳酸菌菌落形態(tài)圖并加以描述，建立典型乳酸菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹，乳酸菌的RAPD分型電泳圖。

4 實驗考核方法

以前的微生物學(xué)實驗考核更多的是注重實驗報告上的實驗結(jié)果，往往忽略了整個實驗操作過程。這種做法致使部分學(xué)生產(chǎn)生惰性心理，依賴同組的其他人，甚至?xí)霈F(xiàn)抄襲實驗結(jié)果的現(xiàn)象。對實驗考核標(biāo)準(zhǔn)進行了完善和改革，考核內(nèi)容涵蓋了從實驗方案設(shè)計、實驗方案實施、平時表現(xiàn)、實驗報告到實驗考試整個過程。實驗成績主要由實驗方案設(shè)計（10%）、方案實施（20%）、平時表現(xiàn)（20%）、解決問題的創(chuàng)新能力（10%）、實驗報告（20%）、實驗考試（20%）6個部分組成。

5 存在的問題

因為綜合性實驗比傳統(tǒng)的實驗要復(fù)雜得多，不少學(xué)生曾流露出畏難情緒。為此，在實驗過程中指導(dǎo)教師花費了大量心血，幫助學(xué)生順利完成從文獻(xiàn)查閱、實驗方案制定到實驗技能培養(yǎng)、實驗結(jié)果總結(jié)和實驗論文撰寫的各個實驗教學(xué)環(huán)節(jié)。以前的食品微生物學(xué)實驗一般安排為每位學(xué)生每周完成1次獨立實驗，實驗室每周僅開放1次，極大地限制了學(xué)生實驗的自主性。教學(xué)內(nèi)容改革后，要求學(xué)生應(yīng)根據(jù)本組實驗的進程和需要，隨時進入實驗室完成實驗。指導(dǎo)教師除了每周進行集中講解和指導(dǎo)外，每天還抽出一定時間在實驗室進行針對性的指導(dǎo)和答疑。

6 學(xué)生對實驗的評價與反饋

根據(jù)實驗設(shè)計和要求，研究在2016和2017級食品科學(xué)與工程專業(yè)2個班級學(xué)生中進行了實驗和評價，達(dá)到了較好的效果，獲得了很多寶貴的經(jīng)驗。學(xué)生在實驗報告總結(jié)中寫到：“通過此次實驗，對食品微生物學(xué)實驗產(chǎn)生了濃厚的興趣，鞏固了微生物實驗操作技能。”“通過實驗課的學(xué)習(xí)，加深了對微生物學(xué)理論知識的理解，并且經(jīng)過綜合性大實驗的訓(xùn)練，學(xué)會了怎樣設(shè)計研究課題，熟悉了各個研究環(huán)節(jié)，學(xué)會了如何開展研究，為今后的畢業(yè)課題和走向工作崗位打下了堅實的基礎(chǔ)?！睂W(xué)生一致反映自己的食品微生物學(xué)實驗操作能力得到了有效的鍛煉，食品微生物學(xué)知識得到了進一步升華，指導(dǎo)教師對實驗結(jié)果也非常滿意，獲得了學(xué)院領(lǐng)導(dǎo)和教師的認(rèn)可與好評。

7 結(jié)語

該綜合性大實驗，采用了以學(xué)生為主導(dǎo)、學(xué)生為中心的互動實驗教學(xué)模式[7]，激發(fā)了學(xué)生的好奇心和學(xué)習(xí)興趣，極大地提高了學(xué)生的參與度，明顯提高了學(xué)生的綜合素質(zhì)和實驗教學(xué)的質(zhì)量，提升了教學(xué)團隊的整體實力，使得學(xué)生不僅能夠掌握實驗的基礎(chǔ)知識、儀器操作方法，更重要的是在實踐中形成分析問題、解決問題的習(xí)慣性思維能力。今后如何適應(yīng)社會發(fā)展的需求，培養(yǎng)高素質(zhì)創(chuàng)新型人才，仍需要不斷的思考、實踐和探索。