錢革 郭武 尹興平 季江 劉濤 吳劍波 鐘連生河南省兒童醫(yī)院皮膚科，鄭州 0000；無錫市第三人民醫(yī)院皮膚科 000；蘇州大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科 000；空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院皮膚科，西安 700；武漢大學(xué)中南醫(yī)院皮膚科 0000；徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科 000

銀屑病是由Th1/Th17紊亂介導(dǎo)的以表皮角質(zhì)形成細胞過度增殖和分化異常為特點的慢性炎癥性疾病，皮損部位伴中性粒細胞聚集。中性粒細胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）是一種主要在中性粒細胞中表達的糖蛋白，最先在中性粒細胞的特殊顆粒中發(fā)現(xiàn)［1］。目前已經(jīng)明確，NGAL在炎癥性、損傷性及腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。兒童銀屑病與感染、炎癥關(guān)系緊密［2］。本研究中我們觀察NGAL在兒童銀屑病中的表達情況，同時利用人永生化角質(zhì)形成細胞株HaCaT，研究NGAL對表皮細胞分泌細胞因子的影響。

對象與方法

一、對象

2017年1月1日至2018年12月31日在河南省兒童醫(yī)院皮膚科、徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科、武漢大學(xué)中南醫(yī)院皮膚科、蘇州大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科、空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院皮膚科和無錫市第三人民醫(yī)院皮膚科確診為新發(fā)的尋常型銀屑病患兒98例。其中男51例，女47例，年齡3～14（7.00±2.99）歲，病程 3～28（7.4± 5.85）d；其中 34例（34.7%）伴發(fā)熱，65例（66.3%）有咽部紅腫或者扁桃體腫大；43例為急性點滴狀銀屑病。98例患兒均無其他嚴(yán)重內(nèi)臟疾病，無過敏性疾病史，就診前1周內(nèi)未用任何藥物治療銀屑病。本研究通過河南省兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（2016-K-031），患兒家長均簽署知情同意書。所有患兒家長同意接受正規(guī)外用和/或系統(tǒng)治療銀屑病方案，外用中弱效糖皮質(zhì)激素軟膏、0.03%他克莫司軟膏、卡泊三醇軟膏或者維A酸類軟膏；伴發(fā)熱、咽部紅腫、扁桃體腫大、外周血白細胞或者中性粒細胞計數(shù)升高者給予系統(tǒng)抗生素治療。

二、細胞與試劑

HaCaT細胞產(chǎn)自上海復(fù)祥生物科技有限公司。NGAL酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（徐州微科曼得生物工程有限公司），NGAL蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（北京義翹神州科技有限公司），兔抗人白細胞介素22（IL-22）多克隆抗體（美國Abcam公司），兔抗人腫瘤壞死因子α（TNF-α）多克隆抗體（美國Bioworld Technology公司），鼠抗人β肌動蛋白單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。

三、方法

1.患兒病情評分與外周血采集：分別在治療前和接受治療2周后對患兒銀屑病嚴(yán)重程度進行評分并采集靜脈血標(biāo)本?；純翰∏閲?yán)重程度按照銀屑病皮損面積及嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評分［3］。每例患兒抽取3 ml外周靜脈血，進行血常規(guī)、生化指標(biāo)等常規(guī)檢查，剩余血液標(biāo)本離心15 min（1 728×g）后，取上清液于-80℃凍存。

2.血清NGAL檢測：按照NGAL酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書操作，根據(jù)梯度濃度的NGAL標(biāo)準(zhǔn)品在450 nm處吸光度（A值）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將血清標(biāo)本稀釋1倍，檢測各個樣品的A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算NGAL的實際濃度。

3.細胞培養(yǎng)及實驗分組：將HaCaT細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長滿瓶底后，以0.25%胰蛋白酶消化細胞，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h貼壁后，分別加入含0（對照組）、0.125、0.25、0.5、1 mg/L的NGAL［4］，培養(yǎng)12 h后收集細胞用于以下實驗。

4.Western印跡法檢測HaCaT細胞IL-22、TNF-α蛋白水平：取上述收集的細胞提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，取80 μg總蛋白樣品電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，于4℃加入一抗（分別為IL-22抗體1∶1 000稀釋，TNF-α抗體1∶500，β肌動蛋白抗體1∶1 000）孵育過夜，加入二抗（山羊抗兔IgG抗體1∶500，馬抗小鼠IgG抗體1∶500）孵育2 h，加入顯色液，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，以IL-22、TNF-α條帶與β肌動蛋白的灰度值比值表示蛋白相對表達水平。

5.RT-PCR 檢測 HaCaT細胞 IL-22、TNF-α mRNA的表達：取上述收集的細胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。IL-22基因正向引物5′-TATCACCA ACCGCACCTTC-3′，反向引物5′-CAGATTGAGGG AACAGCACTT -3′，擴增片段長度173 bp；TNF-α基因正向引物 5′-TCTGGGCAGGTCTACTTTGG -3′，反向引物5′-GGTTGAGGGTGTCTGAAGGA -3′，擴增片段長度116 bp；β肌動蛋白（內(nèi)參）正向引物5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，反向引物 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG -3′，擴增片段長度205 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μl，擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)，72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，以IL-22、TNF-α條帶與β肌動蛋白的灰度值比值作為目的mRNA的相對表達水平。

6.統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 16.0軟件，計量資料以±s表示。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患兒治療前后PASI積分、中性粒細胞計數(shù)和NGAL的變化

治療2周后，銀屑病患兒PASI積分、中性粒細胞數(shù)（×109/L）和NGAL（μg/L）水平（1.80± 1.19、6.16±0.76、90.86±0.75）與治療前（10.38±3.42、11.01±2.85、113.48±21.26）相比均顯著下降（t=31.42、18.34、16.37，均P＜ 0.001）。相關(guān)性分析顯示，治療前患兒血清中NGAL水平與PASI積分、外周血中性細胞數(shù)呈正相關(guān)（rs=0.918、0.799，P＜0.05）。

二、NGAL對HaCaT細胞TNF-α、IL-22 mRNA及蛋白表達水平的影響

各濃度NGAL組HaCaT細胞間TNF-α、IL-22 mRNA水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001），蛋白表達水平差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001），0.125、0.25、0.5、1 mg/L NGAL組mRNA、蛋白表達水平均顯著高于對照組（均P＜0.05）。見表1，圖1、2。

表1 不同濃度中性粒細胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（NGAL）對HaCaT細胞腫瘤壞死因子α、白細胞介素22 mRNA及其蛋白表達的影響（±s）

注：n=5。a與對照組相比，P＜0.05

組別1 mg/L NGAL組0.5 mg/L NGAL組0.25 mg/L NGAL組0.125 mg/L NGAL組0（對照組）F值P值腫瘤壞死因子α mRNA 1.044±0.015a 0.729±0.096a 0.471±0.037a 0.385±0.017a 0.213±0.051 193.28＜0.001蛋白1.373±0.058a 0.982±0.051a 0.844±0.049a 0.687±0.030a 0.391±0.031 318.80＜0.001白細胞介素22 mRNA 1.151±0.103a 0.822±0.096a 0.386±0.071a 0.269±0.045a 0.088±0.007 176.31＜0.001蛋白1.185±0.028a 1.194±0.050a 1.020±0.046a 0.745±0.048a 0.434±0.034 296.96＜0.001

相關(guān)性分析顯示，TNF-α mRNA及蛋白表達水平與NGAL濃度呈正相關(guān)（rs=0.981、0.981，均P＜0.05）；IL-22 mRNA及蛋白的表達與NGAL濃度呈正相關(guān)（rs=0.973、0.934，均P＜ 0.05）。

討 論

銀屑病最具特征性的病理表現(xiàn)為中性粒細胞聚集。兒童銀屑病和感染的關(guān)系更為緊密，其中以急性點滴狀銀屑病患兒居多［5］。本研究入組的新發(fā)銀屑病患兒中性粒細胞水平明顯升高，34.7%的患兒伴發(fā)熱，66.3%的患兒有咽部紅腫或者扁桃體腫大等感染癥狀，進一步提示兒童銀屑病與感染可能存在密切的聯(lián)系。近年來有研究顯示，7NGAL在銀屑病皮損中的表達明顯升高［6-7］。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)銀屑病患兒發(fā)病時，外周血中性粒細胞增多同時伴外周血NGAL升高，經(jīng)過治療后，隨著皮損的好轉(zhuǎn)，患兒外周血中性粒細胞恢復(fù)正常，同時血清中NGAL水平會明顯下降。這提示，外周血NGAL可能參與中性粒細胞在外周血的增殖和趨化過程，從而可能影響銀屑病的皮損。本研究中兒童銀屑病在發(fā)病時皮損PASI積分、外周血中性粒細胞數(shù)量也與外周血中NGAL水平正相關(guān)。結(jié)合相關(guān)文獻，我們認為NGAL可能在感染誘發(fā)兒童銀屑病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

TNF-α是一類重要的炎癥細胞因子，由活化的巨噬細胞和T細胞產(chǎn)生，可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，抵御各種微生物感染，也是銀屑病發(fā)病核心致病因子之一，可通過多種方式直接或間接誘導(dǎo)銀屑病發(fā)生。前期研究［4］顯示，NGAL能刺激HaCaT細胞增殖。本研究顯示，NGAL可促進HaCaT細胞中TNF-α的表達，提示NGAL可能通過誘導(dǎo)TNF-α的表達在銀屑病發(fā)病機制中起重要作用。銀屑病是一種主要由T細胞介導(dǎo)的免疫性疾病，分泌IL-22的Th17、Th22細胞，在銀屑病皮損及外周血均可見升高［8］。IL-22可通過與IL-22受體1（IL-22R1）和IL-10R2組成的IL-22受體復(fù)合物產(chǎn)生效應(yīng)。IL-22R1不表達于免疫細胞，只表達于特定器官的靶細胞，銀屑病中表達IL-22R1的角質(zhì)形成細胞是IL-22的主要靶細胞［9］。IL-22能直接作用于角質(zhì)形成細胞，發(fā)揮促增殖及抑制晚期分化作用，是免疫細胞和角質(zhì)形成細胞相互作用的橋梁分子。本研究提示，NGAL能刺激HaCaT細胞促進IL-22及其mRNA的表達，高劑量NGAL的刺激作用更為明顯。本研究中NGAL刺激后HaCaT細胞中TNF-α與IL-22的表達均增高，但后期是TNF-α還是TNF-α與IL-22協(xié)同促進HaCaT細胞增殖，還需進一步研究。

綜上，本研究顯示，NGAL在銀屑病患兒血清中高表達，且與患兒的皮損嚴(yán)重程度、外周血中性粒細胞計數(shù)呈正相關(guān)，NGAL能夠上調(diào)HaCaT細胞TNF-α、IL-22蛋白及mRNA的表達。提示銀屑病患兒在感染早期，中性粒細胞產(chǎn)生的NGAL能夠刺激中性粒細胞產(chǎn)生前炎癥刺激因子，誘導(dǎo)中性粒細胞遷徙，隨后加重炎癥反應(yīng)并刺激細胞增殖，導(dǎo)致銀屑病形成。但NGAL在銀屑病的發(fā)病機制中，具體通過哪些途徑促進皮膚表皮細胞TNF-α、IL-22生成，還有哪些因子參與和維持NGAL持續(xù)放大性的炎癥反應(yīng)過程，尚需進一步明確。