苗 慧，張新橋，王 紅

0引言

葡萄膜炎是一類常見的眼病，治療棘手，易于反復(fù)發(fā)作，治療不及時(shí)或處理不當(dāng)易致盲，其主要影響青壯年人群的身心健康，受到全球眼科學(xué)界的重視[1]。多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，葡萄膜炎是由自身免疫紊亂所致，自身免疫性葡萄膜炎主要是由Th1細(xì)胞群(主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫)、Th17細(xì)胞群(主要介導(dǎo)炎癥反應(yīng))和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群(regulatory cells，Tregs；主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用)及其分泌的相關(guān)細(xì)胞因子失去平衡引起[2]。白塞氏病(BD)是我國非常常見的一種非肉芽腫性自身免疫性葡萄膜炎，主要病理改變是閉塞性血管炎，臨床上以葡萄膜炎、口腔潰瘍、皮膚損害及陰部潰瘍?yōu)樘卣?。BD的發(fā)病與外周血CD4+淋巴細(xì)胞亞群存在明顯的關(guān)聯(lián)，研究發(fā)現(xiàn)BD患者外周血中Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比明顯升高，Tregs細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比明顯下降[3-4]。

近年來，隨著對(duì)微小核糖核酸(microRNA，miRNA)研究的深入，發(fā)現(xiàn)miRNA在與CD4+T細(xì)胞的產(chǎn)生與分化相關(guān)的信號(hào)通路中起著非常重要的作用。miRNA表達(dá)關(guān)鍵酶Dicer酶的缺失明顯影響T細(xì)胞的分化與功能，這可能意味著miRNA的異常表達(dá)與自身免疫性葡萄膜炎的發(fā)病有著不可忽視的關(guān)系[3-4]。miRNA可調(diào)控免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育和生理功能，其結(jié)構(gòu)和功能的異常影響免疫細(xì)胞的分化、發(fā)育及功能，并參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展[5-6]。隨著二者相互作用機(jī)制的闡明及miRNA檢測技術(shù)的發(fā)展，其在自身免疫性疾病中的研究已成為miRNA研究中的前沿領(lǐng)域之一。上述研究結(jié)果提示，異常表達(dá)的miRNA可能在BD的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，但目前關(guān)于miRNA在BD中的研究較少，很多機(jī)制尚未明確。本研究以miRNA在BD中的異常表達(dá)及探索其可能的調(diào)控路徑作為切入點(diǎn)，研究BD的發(fā)病機(jī)制，以期對(duì)其有更深入的認(rèn)識(shí)，并為其防治提供新的治療靶點(diǎn)及策略。

表1Realtime-PCR引物序列

基因名稱雙向引物序列退火溫度(℃)產(chǎn)物長度(bp)hsa-miR-425-5pGSP:5GGGGAATGACACGATCACTC3R:5GTGCGTGTCGTGGAGTCG36065hsa-miR-34a-5pGSP:5GGGGTGGCAGTGTCTTAGC3R:5CAGTGCGTGTCGTGGAGT36064hsa-miR-34c-5pGSP:5GGGAGGCAGTGTAGTTAGC3R:5CAGTGCGTGTCGTGGAGT36066hsa-miR-129-5pGSP:5GCTTTTTGCGGTCTGG3R:5TGCGTGTCGTGGAGTC36059hsa-miR-144-3pGSP:5GGGGGGTACAGTATAGATGA3R:5CAGTGCGTGTCGTGGA36066hsa-miR-483-3pGSP:5GGGGTCACTCCTCTCCTCC3R:5GTGCGTGTCGTGGAGTCG36063hsa-miR-301a-3pGSP:5GGCGGTGCAATAGTATTGT3R:5CAGTGCGTGTCGTGGAG36065hsa-miR-454-3pGSP:5GGGGGTAGTGCAATATTGCTTA3R:5GTGCGTGTCGTGGAGTCG36066hsa-miR-224-5pGSP:5GGGGGCAAGTCACTAGTGGT3R:5GTGCGTGTCGTGGAGTCG36064hsa-miR-17-5pGSP:5GGGGCAAAGTGCTTACAGTG3R:5GTGCGTGTCGTGGAGTCG36065hsa-miR-199a-5pGSP:5GGTGCCCAGTGTTCAGAC3R:5CAGTGCGTGTCGTGGAGT36067

注：GSP表示miRNA的特異引物，R表示與GSP相匹配的引物。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象選取2016-03/2017-11于我院就診的發(fā)病期BD患者15例作為BD組，均為男性，年齡23～45歲，均符合國際公認(rèn)的BD診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，排除其它免疫性疾病及全身其他系統(tǒng)疾病。選取同期于我院體檢中心體檢的健康人15例作為對(duì)照組，均為男性，年齡25～41歲，排除免疫性疾病及眼部疾病。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批通過，所有受檢者均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1主要試劑與設(shè)備主要試劑：Trizol LS Reagent、無RNA酶糖原(Invitrogen Life Technologies)，氯仿、異丙醇、100% 乙醇(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)、75%乙醇(DEPC水配制)。主要設(shè)備：Axon GenePix 4000B微陣列掃描儀(Axon Instruments，USA)、GenePix Pro 6.0軟件(Axon)、潔凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、Gene Amp PCR System 9700(Applied Biosystems)。

1.2.2提取血漿清晨采取空腹肘靜脈血4mL置于含有EDTA的紫色抗凝真空管，震蕩混勻，室溫靜置1h。將血液分裝至1.5mL無RNA酶EP管中，每管1000μL。3000r/min、20℃離心5min后觀察無溶血，提取上清液至1.5mL無RNA酶EP管中。移液過程中注意不能吸取細(xì)胞層，保持血漿不被污染，將血漿分裝后于-80℃保存。

1.2.3提取RNA分別取BD組和對(duì)照組各10例受檢者的抗凝靜脈血血漿樣品解凍后4℃ 12000r/min離心10min，取250μL血漿轉(zhuǎn)至1.5mL的離心管中，加入750μL的Trizol LS Reagent試劑混勻。勻漿后于15℃～30℃孵育5min。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，5℃～30℃孵育3min。4℃ 12000r/min離心15min，可見混合液體分為下層的紅色酚氯仿相，中間層和上層的無色水相，RNA全部于水相中。將水相轉(zhuǎn)移至新離心管，并加入500μL異丙醇，混勻后15℃～30℃孵育10min，4℃ 12000r/min離心10min，可見管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊即RNA沉淀。移去上清液，加入1mL 75%乙醇，清洗RNA沉淀。振蕩后，4℃ 7500r/min離心5min。去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀5～10min，保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4miRNA標(biāo)記和miRNA陣列雜交將提取的血漿RNA樣本交由Kang Chen-Biotech(中國上海)進(jìn)行miRNA標(biāo)記和miRNA陣列雜交。通過Axon GenePix 4000B微陣列掃描儀掃描，GenePix Pro 6.0軟件讀取圖像的原始強(qiáng)度。歸一化后，將每個(gè)miRNA點(diǎn)獲得的平均值用于統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算綠色信號(hào)與紅色信號(hào)的比率。本研究篩選上調(diào)和下調(diào)的miRNA的閾值分別是倍數(shù)變化>2.00和倍數(shù)變化<0.50。通過miRTarBase數(shù)據(jù)庫檢索顯著差異性表達(dá)的miRNA已經(jīng)過驗(yàn)證的靶基因，并選取與免疫學(xué)相關(guān)的差異性表達(dá)的miRNA進(jìn)行Real time-PCR驗(yàn)證。

表2miRTarBase數(shù)據(jù)庫篩選出的與免疫學(xué)相關(guān)的差異性表達(dá)miRNA及其靶基因

靶基因miRNACDKN1Ahsa-miR-520b、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-654-3p、hsa-miR-17-5pMCL1hsa-miR-193-3pNotch1hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-144-3pMAP4K4hsa-miR-520eBMI1hsa-miR-300、hsa-miR-487b-3pDR1hsa-miR-513b-5pSMAD4hsa-miR-483-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-199a-5pRUNX3hsa-miR-301a-3pHLA-Ghsa-miR-152-3pDNMT1hsa-miR-152-3pJAK1hsa-miR-17-5pPTENhsa-miR-17-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-141-3pATMhsa-miR-374a-5p

表3差異性表達(dá)的miRNA的Realtime-PCR檢測結(jié)果

miRNABD組(n=5)對(duì)照組(n=5)tPhsa-miR-34c-5p1.47±0.310.78±0.243.510.0079hsa-miR-129-5p0.78±0.240.92±0.28-0.770.4654hsa-miR-34a-5p1.09±0.310.83±0.251.320.2243hsa-miR-144-3p1.09±0.170.76±0.222.400.0429hsa-miR-483-3p1.62±0.280.98±0.223.580.0072hsa-miR-301a-3p0.57±0.141.03±0.19-3.930.0044hsa-miR-224-5p0.40±0.060.73±0.18-3.580.0071hsa-miR-454-3p0.58±0.111.01±0.20-3.770.0055hsa-miR-17-5p0.63±0.121.20±0.37-6.900.0203hsa-miR-199a-5p0.34±0.110.87±0.10-5.110.0001

2結(jié)果

2.1差異性表達(dá)的miRNA本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，BD組共檢出具有差異性表達(dá)的miRNA 358個(gè)，其中上調(diào)miRNA 223個(gè)，下調(diào)miRNA 135個(gè)，見圖1。

2.2差異性表達(dá)的miRNA靶基因生物信息學(xué)分析通過miRTarBase數(shù)據(jù)庫可檢索到的本研究發(fā)現(xiàn)的與免疫學(xué)相關(guān)的差異性表達(dá)的miRNA靶基因見表2。本研究發(fā)現(xiàn)的顯著異常表達(dá)的miRNA靶基因主要集中在CDKN1A、Notch1、SMAD4，其中Notch1和SMAD4信號(hào)通路與免疫系統(tǒng)疾病的相關(guān)性較高，故選擇相應(yīng)的miRNA進(jìn)行Real time-PCR驗(yàn)證。

圖1差異性表達(dá)的miRNA火山圖紅色表示符合篩選要求的miRNA。

3討論

BD是我國常見的致盲率較高的葡萄膜炎類型之一，患病人數(shù)約占全國葡萄膜炎患者總數(shù)的16.5%[8]，具有較高的代表性。BD的發(fā)病與外周血CD4+淋巴細(xì)胞亞群具有不可忽視的關(guān)系，BD患者外周血中Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比明顯升高，Tregs細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比明顯下降。隨著對(duì)miRNA的深入研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)miRNA表達(dá)關(guān)鍵酶Dicer酶缺失時(shí)，Th細(xì)胞的分化與功能會(huì)受到明顯的影響，提示自身免疫性葡萄膜炎的發(fā)生可能與miRNA的異常表達(dá)有著密不可分的關(guān)系[3-4]。

miRNA是一類由基因組脫氧核糖核酸(DNA)編碼的由21～25個(gè)核苷酸序列組成的單股非編碼核糖核 酸(RNA)。miRNA雖小，但其可以直接作用于活細(xì)胞內(nèi)的特異性目的基因信使核糖核酸(mRNA)的3’端非編碼區(qū)，抑制目的基因mRNA的表達(dá)，從而抑制相應(yīng)蛋白質(zhì)的合成，參與調(diào)節(jié)多個(gè)生理過程。miRNA的產(chǎn)生主要經(jīng)過原始miRNA(primary microRNA，pri-miRNA)、前體miRNA(precursor microRNA，pre-miRNA)、雙體miRNA后成為成熟miRNA[5]。miRNA在動(dòng)植物轉(zhuǎn)錄后水平參與基因表達(dá)調(diào)控，通過與靶分子mRNA堿基配對(duì)降解mRNA或阻礙其翻譯發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[9]。miRNA在免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)，并影響免疫反應(yīng)的各個(gè)階段[5]。多種免疫過程都受到miRNA的調(diào)控，包括粒細(xì)胞發(fā)育、T細(xì)胞和B細(xì)胞的成熟與分化、抗原遞呈過程、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)的信號(hào)級(jí)聯(lián)、細(xì)胞因子的產(chǎn)生等[10]。循環(huán)miRNA可豐富而穩(wěn)定地存在于體液中。在疾病狀態(tài)下，循環(huán)miRNA的表達(dá)譜有特征性的改變，循環(huán)miRNA可作為一種無創(chuàng)傷性生物標(biāo)志物參與疾病的診療過程。

圖2hsa-miR-17-5p溶解曲線。

圖3hsa-miR-34a-5p溶解曲線。

圖4hsa-miR-34c-5p溶解曲線。

圖5hsa-miR-129-5p溶解曲線。

圖6hsa-miR-144-3p溶解曲線。

圖7hsa-miR-199a-5p溶解曲線。

圖8hsa-miR-224-5p溶解曲線。

圖9hsa-miR-301a-3p溶解曲線。

圖10hsa-miR-454-3p溶解曲線。

圖11hsa-miR-483-3p溶解曲線。

據(jù)推測，人類基因組中約1/3以上的基因可能是miRNA的靶基因。由于信號(hào)通路的顯著劑量敏感效應(yīng)，其相關(guān)基因被認(rèn)為是miRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控中極為理想的候選靶基因。Notch基因于1917年在果蠅中發(fā)現(xiàn)，因部分基因缺失可導(dǎo)致果蠅翅膀出現(xiàn)缺口(notch)而得名。哺乳動(dòng)物的Notch家族包括4種受體(Notch1～4)和5種配體(DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2)，通過這些受體和配體之間的相互作用，可以將某些特定信息在相鄰細(xì)胞之間進(jìn)行傳遞[11]。Notch信號(hào)通路在免疫調(diào)控中的重要性隨著研究的深入不斷彰顯出來，已有研究表明Notch信號(hào)通路在Th1和Th17細(xì)胞的分化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7，12-13]。Jiao等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型中，給予γ分泌酶抑制劑(可以抑制γ分泌酶底物Notch的活性，進(jìn)而影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞分化)的小鼠的脾和外周淋巴結(jié)Th17細(xì)胞及白細(xì)胞介素17(interleukin 17，IL-17)的數(shù)量較對(duì)照組明顯減少，表明Notch信號(hào)通路對(duì)Th17細(xì)胞的發(fā)育、分化均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。Zheng等[15]研究發(fā)現(xiàn)，腎移植術(shù)后不同恢復(fù)程度的患者中Notch1和DLL-4的表達(dá)量與Th17細(xì)胞水平的變化均呈明顯正相關(guān)，提示在腎移植急性排斥反應(yīng)中Th17細(xì)胞的增殖和分化與Notch1和DLL-4密切相關(guān)。Keerthivasan等[8]應(yīng)用Notch1 siRNA阻滯劑特異性阻斷Notch1信號(hào)通路，不但可以降低Th17細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子視黃酸相關(guān)孤兒核受體γt(retinoid-related orphan receptor subfamily γt，RORγt)的 mRNA的表達(dá)，亦能顯著減少極化狀態(tài)下Th17細(xì)胞分泌IL-17A、IL-17F等細(xì)胞因子，提示Notch1至少可通過RORγt和IL-17基因啟動(dòng)子這兩個(gè)位點(diǎn)調(diào)控Th17細(xì)胞分化和功能。Qi等[16]研究表明，活動(dòng)期BD患者存在Notch1通道的異常激活，阻斷Notch1信號(hào)通路能傾向性抑制Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)，而這種傾向性的抑制作用可能是通過信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)的磷酸化水平來實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果表明，活動(dòng)期BD患者血漿中hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-144-3p上調(diào)，這些miRNA的靶基因?yàn)镹otch1，提示hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-144-3p的異常上調(diào)很可能參與了Notch1信號(hào)通路的異常激活。異常激活的Notch 1信號(hào)途徑通過調(diào)節(jié)STAT3磷酸化或/和通過RORγt和IL-17基因啟動(dòng)子引起Th17細(xì)胞的增殖，促進(jìn)BD的發(fā)病。

SMAD4蛋白作為序列保守的SMAD蛋白家族的一員，其主要功能是參與轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。SMAD4在TGF-β超家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中處于中樞地位，對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有重要影響。近年有研究表明，SMAD4通過誘導(dǎo)致病性Th17細(xì)胞的分化參與多發(fā)性硬化的發(fā)病過程[17]。機(jī)體發(fā)生感染時(shí)，大量產(chǎn)生的IL-6和TGF-β通過誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)影響Th17細(xì)胞的分化過程[18]。有研究進(jìn)一步表明，需要在TGF-β和IL-6這兩個(gè)在宏觀上有著相反功能的細(xì)胞因子的共同作用下起始Th17細(xì)胞的分化[19]。Th17細(xì)胞的分化受RORγt和RORα共同誘導(dǎo)。TGF-β既能夠誘導(dǎo)RORγt表達(dá)又能夠誘導(dǎo)Foxp3的表達(dá)，在IL-6缺乏的情況下，TGF-β誘導(dǎo)產(chǎn)生的Foxp3能夠抑制細(xì)胞的進(jìn)一步分化；在IL-6和TGF-β共同存在的情況下，IL-6可以通過活化Th17細(xì)胞分化中的重要調(diào)控點(diǎn)—STAT3，抑制Foxp3的表達(dá)并阻止其與RORγt的相互作用，使RORγt表達(dá)大幅度增加，促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化[20]。本研究結(jié)果表明，活動(dòng)期BD患者血漿中hsa-miR-483-3p異常上調(diào)，hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-199a-5p異常下調(diào)，鑒于SMAD4對(duì)致病性Th17細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用，我們可以認(rèn)為這些異常表達(dá)的miRNA很可能通過SMAD4參與TGF-β超家族細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在IL-6 和 TGF-β共同存在的情況下，IL-6 活化STAT3，抑制Foxp3的表達(dá)并阻止其與 RORγt 的相互作用，使 RORγt表達(dá)大幅度增加，促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化，參與BD的發(fā)病。

綜上所述，miRNA的異常表達(dá)可通過靶基因影響機(jī)體的免疫反應(yīng)，促使疾病發(fā)生。本研究結(jié)果表明，miRNA的異常表達(dá)可能促進(jìn)BD的發(fā)生及發(fā)展，免疫微環(huán)境中異常表達(dá)的miRNA所導(dǎo)致的BD患者免疫功能的異?？赡苁峭ㄟ^靶向Notch1和SMAD4來實(shí)現(xiàn)的，這兩條作用通路都與STAT3和RORγt相關(guān)，提示Notch1和SMAD4信號(hào)通路可能具有很強(qiáng)的相關(guān)性，二者在BD的發(fā)病過程中起到協(xié)同作用。但由于本研究樣本數(shù)量偏少，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以驗(yàn)證上述結(jié)論，并進(jìn)一步探討異常表達(dá)的miRNA與Notch1和SMAD4信號(hào)通路在BD發(fā)病機(jī)制中扮演的具體角色，這也是我們未來實(shí)驗(yàn)研究的方向。