劉 科，王 雯

陜西省商洛市中心醫(yī)院病理科(商洛726000 )

近年來，腫瘤的發(fā)生率一直居高不下，特別是惡性腫瘤的發(fā)生，在就診的腫瘤患者中，大多數(shù)都是中晚期患者[1]，就是因?yàn)槠湓缙诓灰装l(fā)現(xiàn)而導(dǎo)致病死率高。漿膜腔是惡性腫瘤比較常見的轉(zhuǎn)移部位，漿膜腔積液，作為天然液態(tài)培養(yǎng)基，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，多見胸腔積液，腹腔積液，心包積液。常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片簡單快捷，應(yīng)用廣泛，通過細(xì)胞的大小、形態(tài)，即可進(jìn)行定性診斷，但涂片中的細(xì)胞數(shù)目有時太少，且細(xì)胞重疊、堆積等厚薄不同，細(xì)胞的觀察背景模糊，對于增生的間皮細(xì)胞和腺癌細(xì)胞等難以鑒別[2]，致使出現(xiàn)漏診，不確定率較高。所以，本研究采用細(xì)胞塊技術(shù)，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行研究，觀察其在漿膜腔積液檢查中的臨床病理意義，為臨床發(fā)展以及患者個體化治療提供了幫助，現(xiàn)做出以下介紹。

資料與方法

1 一般資料 采用隨機(jī)抽簽法，收集2017年1月至2018年2月我院86例胸腔、腹腔及心包積液患者，每例標(biāo)本分別做常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片、細(xì)胞塊HE染色 及免疫細(xì)胞化學(xué)染色。其中，男65例，女33例，年齡39～77歲，平均(40±8)歲，胸水54例、腹水41例、心包液3例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均經(jīng)過我院影像學(xué)診斷，穿刺確診，均符合WHO組織規(guī)定的漿膜腔積液診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；②所有患者自愿簽署《知情同意書》，且積極配合，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會批準(zhǔn)。

2 研究方法

2.1 細(xì)胞學(xué)涂片：取患者漿膜腔積液標(biāo)本20～40 ml，立即送至病理檢驗(yàn)室，分別放置4個離心管內(nèi)，轉(zhuǎn)速為2500 r/min的高速離心機(jī)離心，離心5 min，使用吸管吸去上清液，棄之，將20 ml含10%的中性福爾馬林加至離心管內(nèi)，放入震蕩儀中震蕩10 min，震蕩結(jié)束后用上述同樣的轉(zhuǎn)速離心10 min，棄去上清液，用鑷子取出4只離心管內(nèi)沉淀物，并用擦鏡紙將其包好，放入非婦科液基細(xì)胞保存液中，按照非婦科液基細(xì)胞學(xué)制片方法準(zhǔn)備，將其自然風(fēng)干后，巴氏染色。若標(biāo)本血液混濁，成分多，則可加入5 ml冰醋酸與95 ml，20%的乙醇25 ml的混合液，混勻之后再行離心，離心之后需做好相應(yīng)核細(xì)胞層的制片，癌細(xì)胞需縮短染色時間。

2.2 細(xì)胞塊制作：將采集的患者的20 ml漿膜腔積液在室溫下固定10～20 min，使用尖底離心管，取離心管底層標(biāo)本10 ml，放至轉(zhuǎn)速為5000 r/min的高速離心機(jī)中離心5 min，將上清物棄去，留下下層沉淀物，加入5 ml10%的中性甲醛，且充分混合，在室溫下靜置1 h后繼續(xù)以上述同樣的方法離心，并棄去上清液，將沉淀物用濾紙包好，對于沉淀物較少的漿膜腔積液，加入75%的乙醇5～10 ml固定半小時，待沉淀物凝固硬化，用吸管將細(xì)胞塊吸至顯微鏡擦鏡紙上，將其包好放入自動脫水機(jī)中進(jìn)行脫水處理，則制成細(xì)胞塊，切成厚3 μm的切片，在60℃環(huán)境下烘1 h左右。行HE染色：①將切片放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘；②分別在酸水中和氨水中分色數(shù)秒鐘；③用流水沖洗1 h后放入蒸餾水片刻；④分別在70%～90%的酒精中脫水10min；⑤入酒精伊紅染色液染色2 min。將染色后的切片用純酒精脫水，再經(jīng)二甲苯透明切片，滴上樹膠，蓋上蓋玻片封固。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色：在上述涂片或細(xì)胞塊切片中發(fā)現(xiàn)的可疑惡性腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色法。用已知的陽性標(biāo)本作為對照，采用EnVision兩步法。操作流程為：①石臘快切片經(jīng)烤片后，用常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水，用PBS洗3次，每次3 min；②預(yù)處理組織切片(依一抗質(zhì)量而定)；③PBS洗3 minX3次；④使用0.3%的過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS洗3 min×3次。

2.4 適當(dāng)稀釋特異性一抗，37℃孵育60min，PBS洗3 minX3次。

2.5 EnVision復(fù)合物(即用型)孵育30min，PBS洗3minx3次。

2.6 水洗，復(fù)染，常規(guī)樹膠封片，結(jié)果觀察。本研究中所用的甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(Thyroid transcription factor-1，TTF-1)，人絨毛蛋白(villin)，癌胚抗原(CEA)，鈣視網(wǎng)膜蛋白(Calretinin)，NapsinA、CDX-2、Pax-8、PBS等均來自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。閱片和臨床資料的獲得均由作者與高級資質(zhì)的病理醫(yī)師進(jìn)行。

3 判斷標(biāo)準(zhǔn) ①細(xì)胞病理學(xué)診斷：常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片，細(xì)胞塊HE染色，確定有惡性特征的細(xì)胞為陽性，無異型細(xì)胞為陰性；有異型細(xì)胞但不滿足診斷為惡性細(xì)胞的為不確定。②免疫細(xì)胞化學(xué)染色：陽性為靶細(xì)胞可見明顯的棕褐/黃色顆粒，陰性為完全無色，不確定為介于兩者之間。③綜合診斷：病理活檢以及細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色均符合惡性為陽性，均符合良性為陰性，其它情況視為不確定。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各種方法陽性、陰性、不確定病例比較 98例漿膜腔積液標(biāo)本中，常規(guī)細(xì)胞涂片陽性病例25例 ，不確定10 例；細(xì)胞塊HE染色陽性，不確定病例分別為26例，11例 ，與常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性病例38例，陰性病例55例，不確定5例 ，與常規(guī)細(xì)胞涂片和細(xì)胞塊HE染色陽性病例，不確定病例相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 常規(guī)細(xì)胞涂片，細(xì)胞塊HE染色細(xì)胞塊 免疫細(xì)胞化學(xué)染色的結(jié)果比較[例(%)]

2 綜合診斷結(jié)果 綜合診斷陽性病例38例，陰性病例56例，不確定病例4例，陽性率明顯高于常規(guī)細(xì)胞涂片和細(xì)胞塊HE染色(P<0.05)，不確定率低于常規(guī)細(xì)胞涂片和細(xì)胞塊HE染色(P<0.05)。細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性病例38例，包含常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片25例陽性病例和細(xì)胞塊HE染色26例陽性病例，且與綜合診斷結(jié)果比較，特異性和敏感性均為100%。

3 細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果分析 根據(jù)本研究及臨床資料，對于不同的病例選擇不同的抗體，由此每類抗體所染的病例數(shù)目也不相同。其中肺癌 14 例，胃腸癌12 例，卵巢癌 8例，其他癌中乳腺癌 2 例，胰腺癌 2 例(CEA 陽性表達(dá))，前列腺癌、彌漫性大 B 細(xì)胞淋巴瘤各 1 例。見表2。

表2 抗體檢測例數(shù)及細(xì)胞表達(dá)情況(例)

討 論

肺癌，胃腸癌，卵巢癌等腫瘤的出現(xiàn)往往伴隨著漿膜腔積液的發(fā)生，由于受到癌細(xì)胞的刺激，淋巴管和血管阻塞而致使血流不暢引起漿膜腔積液，有時候漿膜腔積液也可能是腫瘤的唯一的癥狀[4]，因此，對癌細(xì)胞種類和來源準(zhǔn)確判斷至關(guān)重要。

常規(guī)的細(xì)胞學(xué)涂片實(shí)用，微創(chuàng)，但由于癌細(xì)胞多排列成團(tuán)，呈三維立體結(jié)構(gòu)[5]，給診斷帶來較大的困難。目前細(xì)胞蠟塊制作出的切片作為理想的診斷漿膜腔積液的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：①在制備細(xì)胞蠟塊的過程中，經(jīng)過多次離心得到的細(xì)胞數(shù)量較多，使抗體的敏感性和特異性大大提高；②由細(xì)胞蠟塊制成的切片背景清晰，且厚薄均勻；③更具有突破點(diǎn)的是細(xì)胞聚集，可進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色法，通過常見的診斷標(biāo)志物，既可幫助鑒別少見的間皮細(xì)胞和癌細(xì)胞，同時還可準(zhǔn)確的判斷細(xì)胞來源及病例分型。為患者的治療提供了準(zhǔn)確而有效的信息。本研究中細(xì)胞塊免疫細(xì)胞學(xué)的診斷陽性率與細(xì)胞涂片和細(xì)胞塊HE陽性率比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且明顯降低了不確定病例數(shù)。細(xì)胞蠟塊的制作簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，而且可以長期保存，反復(fù)制片，彌補(bǔ)了細(xì)胞涂片不可復(fù)制的不足[6]，可廣泛應(yīng)用。

免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)是通過標(biāo)記生物素的特異性抗體測定特異性抗原，積液中出現(xiàn)的異型細(xì)胞且特異性染色抗體呈陽性，提示惡行腫瘤以及組織來源。本研究中使用的抗體組均為常用的抗體組，鈣視網(wǎng)膜蛋白(Calretinin)屬于鈣結(jié)合蛋白中的一種，相對分子質(zhì)量29Kda，是理想的間皮性腫瘤細(xì)胞的特異性抗體，陽性表現(xiàn)：細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核均著色，胞膜著色為煎蛋樣改變[7]。CEA是標(biāo)記上皮性腫瘤，相對分子質(zhì)量為180Kda的糖蛋白，是公認(rèn)的癌細(xì)胞鑒別診斷必不可缺的，陽性表現(xiàn)為細(xì)胞膜，細(xì)胞膜均著色[8]。TTF-1，NapsinA多出現(xiàn)在肺癌中[9]，胃腸道來源腺癌中，常使用Villin，CDX-2，卵巢漿液性腺癌中通常表達(dá)Pax-8[10]，Pax-8是轉(zhuǎn)錄因子配對盒基因家族，敏感性和特異性均很高。但是抗體的特異性并非都是絕對的，往往需要多種抗體聯(lián)合應(yīng)用檢測，更有助于明確判斷結(jié)果，提高準(zhǔn)確性。

本研究中應(yīng)用細(xì)胞塊和免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)，利用了漿膜腔這個特殊的部位，提供了清晰的組織結(jié)構(gòu)和較多的細(xì)胞數(shù)量，同時使用一組抗體，克服了傳統(tǒng)抗體使用中的單一種類及重復(fù)性差的缺陷，提高診斷的特異性和敏感性，具有很高的臨床價值。