張 超，張 沖，劉雪琪，孟曉明，潘發(fā)明

(安徽醫(yī)科大學(xué)1. 第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科、2. 第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科、3. 藥學(xué)院、4. 公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，安徽 合肥 230022)

肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是肝臟對(duì)慢性肝損傷因素(如酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性肝炎等)創(chuàng)傷修復(fù)應(yīng)答的結(jié)果，以胞外基質(zhì)合成與分解平衡紊亂為特征。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSCs)在HF進(jìn)展中起到重要作用。當(dāng)肝臟受到急性或慢性損傷時(shí)，靜止的HSC變成活化狀態(tài)，轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞，活化的HSC是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源[1]。

自噬是在胞內(nèi)將受損的細(xì)胞器降解，為細(xì)胞生存提供可重復(fù)利用物質(zhì)和能量的過(guò)程，在維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起到重要作用。有研究報(bào)道[2]，在HSC活化過(guò)程中，自噬潮增加，通過(guò)自噬抑制因子干預(yù)自噬可抑制HSC的活化。奧曲肽(octreotide，OCT)是一種生長(zhǎng)抑素類(lèi)似物，前期研究表明，OCT可緩解大鼠HF程度[3]，但OCT是否通過(guò)調(diào)節(jié)自噬發(fā)揮抗纖維化作用仍未明了。因此，本研究建立CCl4肝纖維化模型，探討自噬在HF中的作用以及OCT對(duì)其的影響。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)♂SD大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，常溫下自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2試劑用橄欖油將CCl4配成40%混合溶液；OCT(0.1 mg·mL-1)購(gòu)于瑞士諾華公司；ECL發(fā)光試劑購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司；抗Collagen I和α-SMA單克隆抗體，購(gòu)于Proteintech公司；抗LC3和Beclin-1單抗購(gòu)于Abcam公司；抗β-actin單抗、二抗，購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

2 方法

2.1動(dòng)物分組及造模大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和OCT組，每組10只。除對(duì)照組外，均采用皮下注射40% CCl4(3 mL·kg-1)，每周2次。OCT組采用皮下注射OCT 10 μg·kg-1，每日2次。同時(shí)對(duì)照組和OCT組均皮下注射等體積生理鹽水。造模8周后處死大鼠，收集待測(cè)標(biāo)本。

2.2血清學(xué)檢測(cè)全自動(dòng)生化分析儀(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科)檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)和白蛋白(ALB)的含量。

2.3HE和Masson染色觀察肝組織病理學(xué)變化取肝組織置于10%甲醛溶液中固定，脫水，包埋后切片，行HE和Masson染色，拍照并分析。

2.4Westernblot法檢測(cè)大鼠肝組織CollagenⅠ、α-SMA、LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)提取蛋白，并用BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4 ℃孵育過(guò)夜。次日TBST洗膜3次后，置于相應(yīng)二抗中，常溫孵育1 h。ECL發(fā)光試劑盒顯影，并用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1大鼠血清學(xué)指標(biāo)變化Tab 1結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組中大鼠ALT、AST和TBIL水平上升，ALB水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，OCT組ALT、AST和TBIL均降低，ALB水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.2大鼠肝組織病理學(xué)改變HE染色顯示，對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞大小、形態(tài)正常，呈以中央靜脈為中心的輻射狀，肝索排列整齊，無(wú)膠原纖維增生；模型組出現(xiàn)大量脂肪變性，肝實(shí)質(zhì)、肝小葉和肝索結(jié)構(gòu)被破壞，匯管區(qū)及周邊組織有大量膠原結(jié)締組織增生；OCT組肝脂肪變性，結(jié)締組織增生程度減輕。Masson染色顯示，對(duì)照組僅見(jiàn)匯管區(qū)有少量藍(lán)色膠原纖維，未見(jiàn)纖維增生；模型組見(jiàn)匯管區(qū)及周?chē)写罅克{(lán)色膠原纖維增生，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞形成假小葉；OCT組見(jiàn)增生的膠原纖維明顯減少，假小葉數(shù)量減少。

Tab 1 Levels of TBIL, AST, ALT and ALB in serum of

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Tab 2 Effects of OCT on protein expression of Collagen Ⅰ,α-SMA, LC3 and Beclin-1 in

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.3大鼠肝組織CollagenⅠ、α-SMA、LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)變化Tab 2的Western blot半定量結(jié)果顯示，Collagen Ⅰ、α-SMA、LC3和Beclin-1蛋白在模型組中的表達(dá)水平較對(duì)照組升高(P<0.05)；相比于模型組，OCT組中Collagen Ⅰ、α-SMA、LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)。

4 討論

自噬在HF的發(fā)生中起兩面性作用。一方面，自噬具有促肝纖維化作用。當(dāng)HSC發(fā)生自噬時(shí)，消化胞內(nèi)脂滴為HSC活化提供能量，誘導(dǎo)I型膠原合成，加速HF進(jìn)程[4]。另一方面，自噬又具有抗肝纖維化作用。通過(guò)去除過(guò)度沉積的脂滴、異常折疊的蛋白和受損的線(xiàn)粒體，減少氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化的損傷，從而維持受損肝細(xì)胞胞內(nèi)的能量平衡。自噬又可促使單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞自噬能夠防止過(guò)多的炎癥介質(zhì)釋放，而抑制巨噬細(xì)胞自噬可促使炎癥介質(zhì)的分泌，炎癥介質(zhì)又可促進(jìn)單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在肝組織中集聚，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，從而通過(guò)抗炎作用發(fā)揮抗纖維化作用[5]。

有研究表明[6]，OCT可通過(guò)抑制自噬減輕腎損傷的發(fā)生，為此我們建立CCl4肝纖維化大鼠模型，并用OCT干預(yù)。結(jié)果表明，模型組大鼠肝功能異常，HE和Masson染色均顯示肝組織有不同程度纖維化，說(shuō)明HF模型成功建立。模型組中大鼠肝組織LC3和Beclin-1含量高于對(duì)照組，表明在CCl4誘導(dǎo)的HF大鼠肝組織中，自噬標(biāo)志性蛋白LC3和Beclin-1的表達(dá)水平上升，證明自噬促進(jìn)HF的發(fā)生。在OCT組中，大鼠HF程度相比于模型組明顯減輕，Collagen Ⅰ、α-SMA、LC3和Beclin-1蛋白含量均下降，表明OCT抑制HF可能與其通過(guò)下調(diào)自噬標(biāo)志性蛋白LC3和Beclin-1的表達(dá)，進(jìn)而抑制自噬的發(fā)生，減少HSC的活化有關(guān)。

綜上，OCT可通過(guò)減輕肝臟病理?yè)p傷，下調(diào)Collagen I和α-SMA的表達(dá)而抑制HF，同時(shí)下調(diào)LC3和Beclin-1的表達(dá)而抑制過(guò)度自噬，緩解HF。我們將會(huì)在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探索自噬及其相關(guān)蛋白在HF進(jìn)展中的變化及作用。