蔡建月，邵云俠，王 坤，吳永貴

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，安徽 合肥 230022)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最常見(jiàn)且最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，相關(guān)證據(jù)表明，炎癥是DN病理學(xué)的重要特征[1]。巨噬細(xì)胞介導(dǎo)免疫炎性反應(yīng)，通過(guò)增加促炎因子和趨化因子，加速DN的進(jìn)展，抑制這些因子可以減少腎臟損傷[2]。JAK2/STAT3信號(hào)途徑是一個(gè)高度進(jìn)化保守的途徑，參與生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞間的通信，與Ras、MAPK等信號(hào)通路存在交互作用，可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、 單核細(xì)胞趨化因子1(monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1)和促炎細(xì)胞因子誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)基因轉(zhuǎn)錄水平。Brosius等[3]報(bào)道了在DN患者中，JAK2/STAT3基因表達(dá)相比于正常組明顯升高。芍藥苷(paeoniflorin,PF)是白芍總苷(total glucosides of paeony,TGP)主要活性成分。課題組前期研究表明，TGP在糖尿病動(dòng)物模型中可抑制腎臟JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活，以及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)[4]。本研究在體外探討PF是否通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路，抑制高糖(high glucose，HG)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞激活，為DN防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 RAW264.7巨噬細(xì)胞系，購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(加拿大WISENT)；D-葡萄糖、甘露醇(美國(guó)Sigma公司)；CCK-8試劑盒(南京諾唯贊生物科技)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(美國(guó)Bio-Rad公司)；實(shí)時(shí)熒光PCR引物(上海生工、美國(guó)GeneCopoeia)；兔抗p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3抗體(美國(guó)CST公司)；小鼠抗β-actin單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗小鼠IgG(武漢三鷹)；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific公司)；小鼠TNF-α、小鼠IL-1β ELISA試劑盒(美國(guó)R&D公司)；小鼠MCP-1 ELISA試劑盒(北京瑞博奧科技)。

1.1.3儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱 (美國(guó)Thermo公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州市蘇信凈化設(shè)備廠)，冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)Backman公司)，酶標(biāo)儀、梯度PCR儀、熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1PF細(xì)胞毒性檢測(cè) 將RAW264.7細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，不同濃度PF(10-8～10-3mol·L-1)孵育細(xì)胞24 h，10 μL CCK-8試劑混合到每個(gè)孔中，再培養(yǎng)4 h。酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm處的吸光度，對(duì)照組細(xì)胞中的平均光密度值設(shè)定為100%生存力，處理結(jié)果表示為對(duì)照的百分比。

1.2.2siRNA轉(zhuǎn)染 JAK2、STAT3 6條siRNA由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，序列見(jiàn)Tab 1。參考Invitrogen公司LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)操作：用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋siRNA至濃度50 nmol·L-1，取1 μL LipofectamineTM2000稀釋于50 μL培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min，將上述混合，室溫靜置20 min。將細(xì)胞接種至24孔板培養(yǎng)孔中，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)30%～50%，在每孔細(xì)胞中加入100 μL轉(zhuǎn)染液，37 ℃培養(yǎng)48 h后，Western blot分別檢測(cè)細(xì)胞JAK2和STAT3表達(dá)量，篩選出干擾效率最高的siRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Tab 1 JAK2/STAT3 siRNA sequence report

1.2.3PF和JAK2/STAT3 siRNA干預(yù) RAW264.7細(xì)胞用低糖(low glucose，LG)DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、 5% CO2和完全飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，生長(zhǎng)達(dá)80%融合的細(xì)胞，按照1×106個(gè)/孔細(xì)胞接種于6孔板,同步化培養(yǎng)(糖濃度為5 mmol·L-1)24 h后，分9組進(jìn)行處理：LG(5 mmol·L-1)、HG(25 mmol·L-1)、HG+PF、LG+JAK2 siRNA、JAK2 siRNA+HG、 JAK2 siRNA+HG+PF、LG+STAT3 siRNA、STAT3 siRNA+HG、STAT3 siRNA +HG+PF。其中，siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，加HG刺激24 h，PF(10-5mol·L-1)預(yù)先干預(yù)細(xì)胞30 min，再加HG(25 mmol·L-1)刺激24 h。

1.2.4Western blot檢測(cè) 收集細(xì)胞，冰上裂解后提取總蛋白，測(cè)定各組蛋白濃度。每個(gè)蛋白樣品取40 μg上樣，經(jīng)8%～12% SDS-PAGE電泳，恒流轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h，加一抗JAK2(1 ∶1 000)、p-JAK2(1 ∶1 000)、STAT3(1 ∶1 000)、p-STAT3(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶35 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBST洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(1 ∶8 000)，37 ℃孵育45 min， PBST洗膜后，ECL顯影、曝光。用Western blot條帶光密度進(jìn)行比較分析。

1.2.5MCP-1趨化實(shí)驗(yàn) 用無(wú)血清培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)細(xì)胞24 h。將收集細(xì)胞接種于Transwell小室中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基50 μL，按照實(shí)驗(yàn)分組，在各組的Transwell下室中分別加入重組小鼠MCP-1，終濃度為20 μg·L-1，培養(yǎng)24 h。吸棄上清，Transwell上室放入預(yù)冷乙醇中固定20 min，切去上室底部薄膜，結(jié)晶紫染色，輕鋪于載玻片上，顯微鏡下拍照，然后用PBS溶液漂洗2次，薄膜置于33%的冰醋酸中，回收結(jié)晶紫染色液，酶標(biāo)儀570 nm測(cè)定各組OD值。

1.2.6實(shí)時(shí)定量PCR 使用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR采用SYBR Green法。GAPDH引物序列上游引物：5′-ACCCCAGCAAGGACACTGAGCAAG-3′，下游引物：5′-GGCCCCTCCTG-TTATTATGGGGGT -3′；TNF-α引物序列上游引物：5′-CCCTCCTGGCC-AACGGCATG -3′，下游引物：5′-TCGGGGCAGCCTTGTCCCTT -3′。下列引物由Gene-Copoeia公司合成：MCP-1：貨號(hào)MQPO27672; IL-1β：貨號(hào)MQPO27422; iNOS:貨號(hào)MQPO29793。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，進(jìn)入循環(huán)；95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，采用2-△△Ct法分析相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子含量 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，吸取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，5 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，吸取上清液，-80 ℃保存。ELISA試劑盒測(cè)定培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量。

2 結(jié)果

2.1PF對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響為了研究PF對(duì)HG刺激下巨噬細(xì)胞活性的影響，將RAW264.7細(xì)胞用不同濃度PF干預(yù)24 h后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性。如Fig 1所示，與沒(méi)加PF的對(duì)照組相比，10-8～10-4mol·L-1PF未表現(xiàn)出對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性(P>0.05)。PF(10-8～10-4mol·L-1)干預(yù)24 h對(duì)巨噬細(xì)胞活性無(wú)影響，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

2.2siRNA的篩選將細(xì)胞通過(guò)不同的處理分組：沒(méi)有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(control組)；加入Lipo 2000(control+lipo組)；轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA載體(control+siRNA control組)；轉(zhuǎn)染Lipo2000+靶基因siRNA(control+siRNA組)。Fig 2的Western blot結(jié)果顯示，JAK2 siRNA轉(zhuǎn)染中，siRNA3片段干擾后的JAK2蛋白表達(dá)量減少最明顯；STAT3 siRNA轉(zhuǎn)染中，siRNA3片段干擾后的STAT3蛋白表達(dá)量減少最明顯(P<0.01)，即沉默效果最好。

Fig 1 Viability analysis of RAW264. 7 cells after

*P<0.05vsLG group

Fig 2 Expression of JAK2,STAT3 protein determined by Western blot in RAW264.7 macrophages transfected

1：Control；2：Control+lipo；3：Control+siRNA control；4：Control+siRNA1；5：Control+siRNA2；6：Control+siRNA3.**P<0.01vscontrol group.

2.3HG刺激對(duì)JAK2、STAT3磷酸化水平的影響Fig 3、4的Western blot結(jié)果顯示，RAW264.7細(xì)胞p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平呈葡萄糖濃度(5、20、25、30、35 mmol·L-1)和時(shí)間(0 min、5 min、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h)依賴性。隨葡萄糖濃度增加，JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平增加，均在25 mmol·L-1達(dá)高峰；蛋白磷酸化程度隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高，p-JAK2/JAK2在15 min達(dá)到高峰，p-STAT3/STAT3在24 h達(dá)到高峰(P<0.01)。甘露醇作為高糖的滲透壓對(duì)照，對(duì)JAK2、STAT3的磷酸化無(wú)影響。

Fig 3 Effects of HG with different concentrations

*P<0.05,**P<0.01vslow glucose group(5 mmol·L-1)

2.4PF對(duì)HG刺激下JAK2、STAT3磷酸化水平的影響PF干預(yù)細(xì)胞30 min后，用HG刺激細(xì)胞，F(xiàn)ig 5的Western blot結(jié)果表明，與HG組相比，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平呈PF濃度(10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol·L-1)依賴性，當(dāng)PF的濃度為10-5mol·L-1時(shí)，可明顯降低上述磷酸化水平(P<0.05，P<0.01)。

2.5PF降低HG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞趨化和遷移Fig 6趨化實(shí)驗(yàn)顯示，HG刺激可以增加MCP-1對(duì)RAW264.7細(xì)胞的趨化，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞遷移。JAK2/STAT3 siRNA組巨噬細(xì)胞趨化與LG組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,HG組細(xì)胞遷移相比LG組明顯增加(P<0.01)；與HG組相比，JAK2 siRNA+HG組、STAT3 siRNA+HG組無(wú)差異，HG+PF組細(xì)胞遷移明顯減少(P<0.01)；與JAK2/STAT3 siRNA+HG組相比，PF干預(yù)可降低MCP-1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞趨化和遷移(P<0.01)。

Fig 4 Effects of HG with different time on p-JAK2,p-STAT3 protein expression in RAW264.7

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group(0 h)

Fig 5 Effects of PF on p-JAK2/JAK2,p-STAT3/STAT3 protein in HG-induced RAW264.7 macrophages

*P<0.05vsLG group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group

Fig 6 RAW264.7 macrophages’ invasion and migration through MCP-1 determined by Transwell chamber assay(A), and OD value detection of migration cell crystal violet staining solution (B)

1:LG;2:LG+JAK2 siRNA;3:LG+STAT3 siRNA;4:HG;5:HG+PF;6:JAK2 siRNA+HG;7:JAK2 siRNA+HG+PF;8:STAT3 siRNA+HG;9:STAT3 siRNA+HG+PF;**P<0.01vsLG group;##P<0.01vsHG group;△△P<0.01vssiRNA group

2.6PF與JAK2/STAT3siRNA抑制HG刺激巨噬細(xì)胞中炎癥因子轉(zhuǎn)錄和分泌實(shí)時(shí)定量PCR和ELISA結(jié)果顯示(Fig 7、8)，HG刺激可明顯增加RAW264.7細(xì)胞中iNOS和炎癥因子(TNF-α、IL-1β、MCP-1)mRNA水平，以及細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子的分泌(P<0.01)。與HG組比較，JAK2/STAT3 siRNA和PF干預(yù)可降低iNOS及炎癥因子(TNF-α、IL-1β、 MCP-1)mRNA水平和炎癥因子的分泌(P<0.01)，即抑制HG刺激RAW264.7細(xì)胞的促炎反應(yīng)。PF可在基因沉默基礎(chǔ)上，進(jìn)一步下調(diào)炎癥因子的水平(P<0.01)。

Fig 7 Expression of iNOS,TNF-α,IL-1β and MCP-1 mRNAdetermined by real-time PCR in RAW264. 7macrophages

1:LG;2:LG+JAK2 siRNA;3:LG+STAT3 siRNA;4:HG;5:HG+PF;6:JAK2 siRNA+HG;7:JAK2 siRNA+HG+PF;8:STAT3 siRNA+HG;9:STAT3 siRNA+HG+PF;**P<0.01vsLG group;##P<0.01vsHG group;△△P<0.01vssiRNA group

Fig 8 Levels of TNF-α,IL-1β and MCP-1 measured by

1:LG;2:LG+JAK2 siRNA;3:LG+STAT3 siRNA;4:HG;5:HG+PF;6:JAK2 siRNA+HG;7:JAK2 siRNA+HG+PF;8:STAT3 siRNA+HG;9:STAT3 siRNA+HG+PF;*P<0.05,**P<0.01vsLG group;##P<0.01vsHG group;△△P<0.01vssiRNA group

2.7PF影響HG刺激巨噬細(xì)胞中JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)Fig 9的Western blot結(jié)果顯示，HG刺激增加RAW264.7細(xì)胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平。與HG組相比，HG+PF組JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平明顯降低(P<0.01)。與JAK2/STAT3 siRNA+ HG組相比，PF干預(yù)可同時(shí)降低JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平(P<0.01)。

Fig 9 Expression of p-JAK2/JAK2,p-STAT3/STAT3 protein determined by Western blot in RAW264.7

1:LG(5 mmol·L-1);2:HG(25 mmol·L-1); 3:HG+PF; 4:LG+JAK2 siRNA; 5:JAK2 siRNA+HG; 6:JAK2 siRNA+HG+PF; 7:LG+STAT3 siRNA; 8:STAT3 siRNA+HG; 9:STAT3 siRNA +HG+PF.*P<0.05,**P<0.01vsLG group;##P<0.01vsHG group;△P<0.05,△△P<0.01vssiRNA group.

3 討論

PF是一種從芍藥根提取的單萜糖苷，已被普遍用于緩解炎癥、閉經(jīng)、腹痛等癥狀[5]。TGF作為抗炎免疫調(diào)節(jié)藥物可改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的病情。炎癥也是促進(jìn)DN發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素。Fu等[6]研究證實(shí)，PF可降低糖尿病大鼠尿蛋白，抑制腎小球肥大，減輕巨噬細(xì)胞腎內(nèi)浸潤(rùn)活化和炎癥因子的表達(dá)，延緩DN病程進(jìn)展，但機(jī)制不明。

在DN早期階段，巨噬細(xì)胞聚集在腎小球和間質(zhì)中，腎巨噬細(xì)胞積累量與腎小球硬化程度、肌酐血清水平、蛋白尿和間質(zhì)性纖維化程度密切相關(guān)[7]。MCP-1可以趨化巨噬細(xì)胞， DN患者腎小管上皮細(xì)胞中高表達(dá)MCP-1，可使大量巨噬細(xì)胞在皮質(zhì)小管外周聚集，導(dǎo)致DN患者腎臟炎癥和纖維化的形成[8]。我們以RAW264.7細(xì)胞為研究對(duì)象，以MCP-1作為趨化因子，發(fā)現(xiàn)HG刺激下巨噬細(xì)胞遷移明顯增加，而PF干預(yù)可抑制HG刺激的巨噬細(xì)胞遷移增加。巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)炎性反應(yīng)，產(chǎn)生大量iNOS及炎癥因子，促進(jìn)組織損傷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HG刺激RAW264.7細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量促炎因子及趨化因子(TNF-α、IL-1β、MCP-1)，而PF干預(yù)可以抑制HG刺激的RAW264.7細(xì)胞的激活。

JAK/STAT信號(hào)通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要通路之一。細(xì)胞因子與JAKs受體結(jié)合后，引起受體分子的二聚化，使得與受體偶聯(lián)的JAKs發(fā)生酪氨酸磷酸化，活化的JAKs催化受體本身的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化修飾，形成相應(yīng)的STATs停靠位點(diǎn)，使STATs通過(guò)SH2結(jié)構(gòu)域與受體結(jié)合，并在JAKs的作用下實(shí)現(xiàn)其磷酸化，然后入核，并激活相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[9]。研究顯示，在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中，可通過(guò)抑制骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞內(nèi)的JAK2/STAT3通路，下調(diào)炎癥因子的分泌，從而緩解動(dòng)脈粥樣硬化[10]。姜黃素可以抑制JAK2/STAT3激活，減少炎癥反應(yīng)，防治胰腺炎相關(guān)腎損傷[11]。已有研究證明，JAK2/STAT3途徑的調(diào)節(jié)與免疫炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，HG刺激下p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)明顯增加，PF干預(yù)可以下調(diào)HG刺激的JAK2、STAT3磷酸化水平的升高。JAK2/STAT3 siRNA基因沉默明顯下調(diào)HG刺激的TNF-α、IL-1β、MCP-1、iNOS mRNA的表達(dá)及炎癥因子的釋放，PF干預(yù)與基因沉默的結(jié)果相似，表明PF可以通過(guò)下調(diào)HG刺激的JAK2、STAT3磷酸化水平，從而抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。

最近的研究表明，PF可以通過(guò)抑制p38、ERK1/2 MAPK 和 NF-κB信號(hào)通路，拮抗血管平滑肌細(xì)胞中炎癥因子的產(chǎn)生，抑制MCP-1的表達(dá)，減輕血管炎癥[12]。在HG誘導(dǎo)的糖尿病視網(wǎng)膜病變中，PF可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，這與我們前期在DN中的研究結(jié)果相似[13-14]。本研究中，在JAK2/STAT3基因沉默基礎(chǔ)上給予PF干預(yù)，可以進(jìn)一步抑制巨噬細(xì)胞相關(guān)活性因子的產(chǎn)生。趨化實(shí)驗(yàn)中，PF干預(yù)可以抑制HG刺激下MCP-1對(duì)巨噬細(xì)胞的趨化遷移，而JAK2/STAT3基因沉默與HG組差異無(wú)顯著性，推測(cè)JAK2/STAT3信號(hào)通路可能并不影響巨噬細(xì)胞的趨化功能，PF對(duì)巨噬細(xì)胞激活的調(diào)節(jié)作用除了通過(guò)JAK2/STAT3途徑外，還與其他信號(hào)通路相關(guān)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，PF可以抑制巨噬細(xì)胞中TLR2/4通路的激活，抑制巨噬細(xì)胞向M1型促炎表型的轉(zhuǎn)化，從而抑制相關(guān)炎癥因子的表達(dá)[14]。PF是否也通過(guò)上述p38、ERK1/2 MAPK、NF-κB等信號(hào)通路影響巨噬細(xì)胞激活，需要進(jìn)一步研究論證。

綜上所述，本研究證明HG刺激了RAW264.7細(xì)胞激活，增加巨噬細(xì)胞的趨化。而PF干預(yù)可明顯下調(diào)HG刺激產(chǎn)生的效應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)，本研究為PF防治DN提供了理論依據(jù)。PF對(duì)巨噬細(xì)胞激活的影響還可能與其他炎癥通路相關(guān)，仍需進(jìn)一步探究。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室完成，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中孟曉明教授給予悉心指導(dǎo)與大力支持，在此表示衷心的感謝。)