焦曉博，紀(jì)薇*（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷 030801）

葡萄（Vitis viniferaspp.）因其果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特，富含大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，已成為當(dāng)今世界最受歡迎的果品之一[1-2]。世界糧農(nóng)組織的統(tǒng)計(jì)（http://faostat.fao.org）2018年我國(guó)葡萄種植面積為87.5萬(wàn) hm2，產(chǎn)量約為1500萬(wàn) t，歐亞種和歐美雜交種為主栽品種。葡萄主要分布于北緯25～45°的干旱或半干旱地區(qū)[3]，對(duì)主栽區(qū)的低溫干旱氣候適應(yīng)性較差，極易引發(fā)冷害和凍害[4]。因此，由低溫引起的冷害和凍害問(wèn)題是我國(guó)尤其是北方地區(qū)葡萄生產(chǎn)面臨的主要風(fēng)險(xiǎn)[5]。

北方季節(jié)更替引發(fā)的低溫冷害通過(guò)降低植物的光合作用、細(xì)胞膜流動(dòng)性及基礎(chǔ)代謝等，從而影響葡萄枝干及芽的生長(zhǎng)發(fā)育，造成減產(chǎn)，也可能造成葡萄新梢、花芽及葉片的凍害，嚴(yán)重影響該年樹(shù)體的成長(zhǎng)以及果實(shí)產(chǎn)量，嚴(yán)重凍害則直接導(dǎo)致葡萄芽、枝干以及根等器官的損傷，甚至死亡[6]。近年來(lái)，由低溫引起的凍害問(wèn)題發(fā)生頻繁。2008年賀蘭山東麓葡萄冬季凍土層可達(dá)85 cm，造成大面積減產(chǎn)，幼齡葡萄樹(shù)大量死亡，有些葡萄園的死亡率甚至高達(dá)60%[7]。2010年，賀蘭山東麓地區(qū)由于春季土壤溫度過(guò)低，葡萄發(fā)芽比歷年推遲15 d左右，幼樹(shù)枝蔓抽干嚴(yán)重，導(dǎo)致大量幼樹(shù)死亡[8]。2012年，受降雪低溫影響，甘肅威龍釀酒葡萄基地遭受晚霜凍害的面積近53.33 hm2[9]。2017年，山西省迎來(lái)強(qiáng)降溫天氣，多地區(qū)遭受?chē)?yán)重低溫災(zāi)害，課題組對(duì)此展開(kāi)調(diào)查，受災(zāi)地區(qū)葡萄的花器官受害最為嚴(yán)重，導(dǎo)致產(chǎn)量嚴(yán)重下降。面對(duì)此類(lèi)問(wèn)題，生產(chǎn)中多采用下架埋土的防寒辦法，但其繁重的工作量往往需要投入大量的人力物力，極大增加了葡萄的生產(chǎn)成本，對(duì)我國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展十分不利[10]。

低溫傷害已對(duì)我國(guó)葡萄主產(chǎn)區(qū)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，極大地限制了我國(guó)北方地區(qū)葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，且其發(fā)生頻率和破壞程度日益嚴(yán)重，使整個(gè)產(chǎn)業(yè)面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[11]。隨著科技的進(jìn)步和分析手段的迭代更新，植物對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制在各個(gè)層面都得到了廣泛而深入的研究。本文對(duì)近年來(lái)葡萄抗寒種質(zhì)資源、生理機(jī)制、分子機(jī)制及防寒措施等方面進(jìn)行總結(jié)概述，并提出了對(duì)未來(lái)葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的展望。

1 葡萄抗寒種質(zhì)資源

葡萄屬于喜溫果樹(shù)，其生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)熱量需求較高，但不同品種株系對(duì)熱量要求還存在著差異[12]。在北方冬季休眠期，美洲種或歐美雜交種的枝條較歐亞種的枝條更加耐受低溫[3]。樊秀彩等[13]為探究不同葡萄品種的抗寒性，于2010年春季對(duì)鄭州果樹(shù)所資源圃中1000份種質(zhì)的萌芽狀況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明歐亞種的抗寒性最差，而美洲種群、美洲雜種種群及山歐雜種種群的抗寒性最好。

北美東部是最早進(jìn)行葡萄抗寒育種的地區(qū)，其育種方式主要為野生種馴化或種間雜交。經(jīng)不懈努力育出了如‘伊莎貝拉（Isabella）’‘卡托巴（Catawba）’‘康可（Concord）’‘Ontario’‘金玫瑰（Golden Muscat）’‘Buffalo’‘Alden’‘Bath’‘喜樂(lè)無(wú)核（Himrod）’‘Romulus’‘布朗無(wú)核（Bronx Seedless）’‘Suffolk Red’‘康能無(wú)核（Canadice）’‘加拿大玫瑰（Canada Muscat）’‘紐約玫瑰（New York Muscat）’‘Cayuga White’‘Horizon’‘Traminette’等抗寒葡萄品種[14]。俄羅斯、加拿大和日本等國(guó)家也在抗寒葡萄品種的培育方面做出了巨大貢獻(xiàn)。俄羅斯和前蘇聯(lián)的育種家們經(jīng)不懈努力先后培育出‘北方葡萄’‘北方曙光’‘北極’‘布圖爾’‘米丘林科林斯’‘農(nóng)莊’‘金屬’及‘俄羅斯康克’等抗寒性強(qiáng)的品種[15]。加拿大育種家也成功育成了釀酒品種‘L'Acadie’和鮮食品種‘Vanessa’，可分別耐受-31 ℃和-26 ℃的低溫[16]。日本的抗寒品種培育主要集中于巨峰系，如‘紅富士’‘先鋒’‘巨峰’‘蜜汁’等，其中‘蜜汁’具有良好抗寒性，在我國(guó)東北地區(qū)廣泛種植[14]。

國(guó)內(nèi)的抗寒葡萄研究主要集中于山葡萄（V. amurensisRupr.）和‘貝達(dá)’等抗寒砧木[12,17]。在我們已知的葡萄種群里山葡萄抗寒性最強(qiáng)，最低能夠耐受-50～-40 ℃的超低溫，被廣泛用作雜交親本[18]與栽培品種雜交，并選育出了一批抗寒能力強(qiáng)的品種。例如，中國(guó)科學(xué)院植物研究所以‘玫瑰香’葡萄作母本，山葡萄作父本培育出抗寒優(yōu)質(zhì)的釀酒葡萄品種‘北紅’和‘北玫’，在我國(guó)北方地區(qū)可直接露地越冬[19]。因此，合理利用并推廣優(yōu)質(zhì)抗寒種質(zhì)資源，對(duì)我國(guó)葡萄栽培與果品改良具有廣闊的應(yīng)用前景[20]。

2 葡萄抗寒生理機(jī)制

植物組織在受低溫脅迫時(shí)，可通過(guò)改變其組織結(jié)構(gòu)、生理和生化指標(biāo)來(lái)抵御逆境環(huán)境。為了揭示葡萄在低溫脅迫下的抗寒生理機(jī)制，國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)葡萄的組織結(jié)構(gòu)和生理生化指標(biāo)進(jìn)行了大量研究分析。

低溫導(dǎo)致胞內(nèi)結(jié)冰，使得細(xì)胞膜由液相向固相轉(zhuǎn)變，降低膜結(jié)構(gòu)的流動(dòng)性，并進(jìn)一步激活和引起胞內(nèi)低溫信號(hào)的傳遞，細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度的升高是植物響應(yīng)低溫脅迫的初級(jí)反應(yīng)[21-22]。低溫刺激質(zhì)膜上Ca2+通道，通過(guò)影響其活性導(dǎo)致細(xì)胞膜僵化，使得細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度提高，從而激活下游相關(guān)信號(hào)[23]。對(duì)苜蓿和擬南芥進(jìn)行低溫脅迫后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度與冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的累積呈正相關(guān)[24-25]。

葡萄在面臨低溫環(huán)節(jié)的威脅時(shí)，其細(xì)胞質(zhì)膜滲透性提高，導(dǎo)致電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率增大，在一定程度上與其抗寒性呈負(fù)相關(guān)[26]。任群紅等[27]、馬小河[28]等利用梯度低溫處理對(duì)不同葡萄品種的一年生枝條進(jìn)行電導(dǎo)率測(cè)定，發(fā)現(xiàn)隨處理溫度的降低，各葡萄品種相對(duì)電導(dǎo)率均呈現(xiàn)出較顯著的遞增趨勢(shì)，電解質(zhì)滲出率變化基本呈“S”型曲線分布，并結(jié)合Logistic方程擬合計(jì)算其半致死溫度，得到其抗寒性的強(qiáng)弱排序。在低溫脅迫下，葡萄植株通過(guò)增多或形成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)提高細(xì)胞質(zhì)濃度，降低水勢(shì)，促進(jìn)吸水，使植株能夠正常生長(zhǎng)[29-30]。調(diào)節(jié)滲透性的主要物質(zhì)有脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等[31]。施明等[32]研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低，葡萄體內(nèi)的脯氨酸積累量呈增加的趨勢(shì)。處于低溫環(huán)境中的葡萄植株，其體內(nèi)可溶性蛋白含量也會(huì)隨著溫度的變化而有所變化[33]。李桂榮等[34]對(duì)4個(gè)無(wú)核葡萄品種的抗寒性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白的含量隨著低溫逐步上升。在冷脅迫下，葡萄植株體內(nèi)的多糖被水解為可溶性糖，不僅提高了細(xì)胞質(zhì)的滲透勢(shì)而且降低了冷凍溫度[35]；葡萄植株的抗寒能力隨著可溶性糖含量的增加而增強(qiáng)，因此，植物還可通過(guò)提高體內(nèi)的可溶性糖含量降低低溫對(duì)植物體的傷害，從而適應(yīng)低溫環(huán)境[36]。因?yàn)楸∕DA）是膜脂過(guò)氧化反應(yīng)后的主要產(chǎn)物，因此其含量高低能作為評(píng)價(jià)膜系統(tǒng)受損程度的重要指標(biāo)。魯金星等[37]通過(guò)對(duì)多個(gè)葡萄品種進(jìn)行抗寒性鑒定分析發(fā)現(xiàn)，植株抗寒性與MDA含量呈負(fù)相關(guān)。

葡萄植株體內(nèi)的活性氧化酶系統(tǒng)（CAT、SOD、POD）通過(guò)調(diào)控來(lái)保護(hù)植株，減輕低溫對(duì)植株的損害。王淑杰等[38]發(fā)現(xiàn)，葡萄植株內(nèi)的酶活性強(qiáng)弱與其抗寒性呈正相關(guān)，且在低溫脅迫下，抗寒性弱的品種比抗寒性強(qiáng)的品種的酶活性下降速率快。但魯金星等[37]通過(guò)對(duì)不同砧木和釀酒品種進(jìn)行抗寒性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在一定溫度限度內(nèi)枝條POD活性與其抗寒性呈正比，而隨處理溫度降低，SOD和CAT活性表現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì)?；钚匝趸缸鳛橹参矬w的保護(hù)酶，通過(guò)清除活體氧和自由基，減少或避免活性氧和自由基對(duì)細(xì)胞膜的損害，從而使植物體具備一定的抗寒性。

3 葡萄抗寒分子機(jī)制

隨著葡萄抗寒生理生化特征的深入研究，分子生物學(xué)方法也逐漸成為葡萄抗寒性研究的重要手段，利用該技術(shù)進(jìn)一步挖掘葡萄在低溫脅迫下信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)代謝通路中關(guān)鍵的調(diào)控和參與基因，且對(duì)其抗寒性進(jìn)行良性改良，該技術(shù)在葡萄抗寒性鑒定與育種方面的應(yīng)用前景十分廣闊[39-40]。目前，植物響應(yīng)低溫脅迫信號(hào)機(jī)理的研究在擬南芥中較為集中，而葡萄耐寒分子機(jī)制的研究基本上處于發(fā)展階段，對(duì)于具有優(yōu)秀抗寒能力的山葡萄品種，已經(jīng)完成了對(duì)其抗寒相關(guān)基因CBFs和ICE1的克隆和功能驗(yàn)證[41-45]。

此外，Xiao等[46]分離了歐亞種葡萄與河岸葡萄的CBF/DREB1-like基因CBF1-4，發(fā)現(xiàn)低溫處理后CZBF4表達(dá)量上升且能夠維持一定的水平，據(jù)此推測(cè)其可能與葡萄抗寒相關(guān)；Li等[47-48]從‘玫瑰香’葡萄中克隆得到了ICE1和HOS1兩個(gè)基因，并通過(guò)擬南芥轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)驗(yàn)證了其在低溫脅迫響應(yīng)中的功能；Xu等[49]通過(guò)對(duì)該基因的兩個(gè)同源物VaICE1和VaICE2與其他植物ICE1基因的比對(duì)，分析表明，VaICE1和VaICE2在控制抗寒性表達(dá)的早期過(guò)程中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑的作用，并且調(diào)節(jié)影響CBF途徑的各種低溫相關(guān)基因的表達(dá)水平；通過(guò)將VaICE1克隆到含有CaMV35S啟動(dòng)子的載體pCAMBIA1300中構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體，并在煙草中進(jìn)一步得到驗(yàn)證[50]。范高韜等[17]利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)鑒定出一個(gè)名為VvCOR27的抗寒候選基因，并將VvCOR27超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系做了耐寒檢測(cè)，結(jié)果表明：VvCOR27參與了植株對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)，并對(duì)植物的耐寒性具有正調(diào)控作用。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)證明，bHLH家族參與許多物種的非生物脅迫耐受性調(diào)節(jié)，如Wang等[51]對(duì)94個(gè)葡萄bHLH基因進(jìn)行基因組鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析以評(píng)估這些基因之間的關(guān)系，并分析了94個(gè)葡萄bHLH基因在寒冷脅迫條件下的各種組織表達(dá)模式，鑒定了可能與花色素苷和黃酮醇生物合成相關(guān)的3個(gè)葡萄bHLH基因，從而確定了bHLH轉(zhuǎn)錄因子與葡萄耐寒性的潛在相關(guān)性。冷適應(yīng)蛋白（cold-regulated，COR413）在植物的耐寒性調(diào)節(jié)中扮演著重要角色，抗寒性極強(qiáng)的山葡萄中COR413蛋白家族的4個(gè)成員，相對(duì)于易受低溫傷害的歐洲葡萄相應(yīng)的COR413蛋白家族成員在進(jìn)化中的表現(xiàn)更為保守，且由于山葡萄和歐洲葡萄的種間差異，COR413蛋白家族成員在兩者中的表達(dá)模式有著明顯的差別，參與低溫脅迫的表達(dá)模式也有差異，其山葡萄VvCOR413-IM1對(duì)低溫脅迫響應(yīng)誘導(dǎo)表達(dá)顯著，因此極為可能與抗寒代謝響應(yīng)密切相關(guān)[52]。

新興分子生物技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)著葡萄抗寒分子機(jī)制研究的進(jìn)步。Deng等[53]采用基于iTRAQ的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，通過(guò)對(duì)耐寒葡萄品種‘山葡萄’（Vitis amurensis）和冷敏葡萄品種‘玫瑰香’（Vitis viniferacv. Muscat Hamburg）進(jìn)行冷應(yīng)答蛋白鑒定，發(fā)現(xiàn)參與光合作用、淀粉和蔗糖代謝的蛋白質(zhì)對(duì)刺激的響應(yīng)（如富含甘氨酸的RNA結(jié)合蛋白、鈣調(diào)蛋白、WSI18蛋白等）進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能對(duì)葡萄起到抵御寒冷的重要作用；米寶琴等[54]利用抑制性消減雜交技術(shù)（SSH），成功的把山葡萄株系‘通化-3’與歐洲葡萄‘紅地球’分別作Driver與Tester，制作了ASSH與SSSH兩個(gè)cDNA的表達(dá)文庫(kù)，經(jīng)DNAMAN和BLAST比對(duì)，篩選出了多個(gè)與山葡萄抗寒性相關(guān)的ESTs。此外，利用分子標(biāo)記輔助育種和構(gòu)建遺傳圖譜進(jìn)行的研究也非常多。張劍俠等[55]選取抗寒性不同的83份葡萄資源以及3個(gè)雜交組合進(jìn)行試驗(yàn)，獲得了2個(gè)和野生山葡萄抗寒基因連鎖的RAPD標(biāo)記S241-670與S238-800；劉鎮(zhèn)東等[56]利用SRAP和SSR技術(shù)對(duì)‘紅地球’‘雙優(yōu)’和‘北冰紅’3個(gè)葡萄品種進(jìn)行了分子遺傳圖譜的構(gòu)建和抗寒性QTL定位，為今后抗寒基因的進(jìn)一步研究和分子標(biāo)記輔助育種提供了扎實(shí)的理論基礎(chǔ)[57]。

4 葡萄抗寒防凍措施

低溫凍害的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，雖然出現(xiàn)頻率較低，但一旦發(fā)生不僅影響范圍大、受災(zāi)作物廣，且減產(chǎn)幅度大，損失極為嚴(yán)重。因此，在北方低溫環(huán)境下種植葡萄必須加強(qiáng)防凍措施，多舉措提高葡萄抗寒性顯得極為關(guān)鍵[58]。

經(jīng)眾多實(shí)踐探索，我國(guó)北方常采用的防凍措施主要包括冬季埋土、樹(shù)干涂白、冬灌冰層、冬季覆雪，覆蓋玉米秸稈、防凍膜、保溫被、地膜等防寒物等[10,59]。高美英等[10]在晉中地區(qū)以塑料大棚內(nèi)5年生歐亞種葡萄品種‘早黑寶’為試驗(yàn)材料，以7種防寒措施為處理和以自然越冬為對(duì)照，結(jié)果表明在北方寒區(qū)塑料大棚內(nèi)莖干裹覆黑膜的防寒效果最好，而露地栽培則需覆蓋保溫被。劉志虎等[60]在施肥方式和栽培環(huán)境對(duì)葡萄抗寒性的影響，以及理土方式與越冬能力等方面的研究得到，在保持一定濕度土壤條件下，采用瓦楞紙覆蓋可使土壤溫度保持穩(wěn)定，深施基肥可提高葡萄越冬的安全性。陳淑麗等[61]研究發(fā)現(xiàn)，采用棉被覆蓋的效果顯著高于玉米秸稈加覆膜和埋土。吳亮等[62]研究表明，玻璃棉保溫被的防寒效果顯著優(yōu)于埋土的防寒效果。李欣等[63]研究表明，在寧夏賀蘭山地區(qū)使用聚苯乙烯泡沫顆粒保溫被覆蓋防寒可以使葡萄安全越冬，且來(lái)年發(fā)芽情況良好。劉俊等[64]研究表明，棉被覆蓋和黑膜+30 cm玉米秸兩種越冬方式可使葡萄在河北地區(qū)安全越冬，其中黑膜+30 cm玉米秸較其他越冬方式便宜，可推廣于生產(chǎn)。王進(jìn)等[65]以單層草簾、雙層膜（白膜+黑膜）、單層白膜（普通地膜）和單層黑膜為試材，模擬冬季有無(wú)積雪覆蓋兩種情況，通過(guò)低溫變化得出，在新疆天山地區(qū)冬季3個(gè)月內(nèi)，4種越冬措施都可以有效穩(wěn)定地溫波動(dòng)，其中有積雪覆蓋的單層草簾處理的效果最好，最低溫度不低于-1.5 ℃。

葡萄越冬的防寒措施需根據(jù)各地區(qū)的氣候特點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，并使用不同防寒材料進(jìn)行包裹或覆蓋，減少春季晚霜和秋季早霜的傷害，提高葡萄的果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，新的防寒措施和材料的開(kāi)發(fā)利用，將為北方寒區(qū)葡萄產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展提供助力。

5 結(jié)語(yǔ)

目前，眾多科學(xué)家對(duì)葡萄抗寒性的研究方興未艾，已從簡(jiǎn)單的逆境生理試驗(yàn)發(fā)展到了生物技術(shù)領(lǐng)域的研究，為葡萄抗寒內(nèi)在機(jī)理提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。通過(guò)引種馴化以選育各地區(qū)適宜的抗寒葡萄品種，或者采用抗砧嫁接等農(nóng)業(yè)措施可以從不同方面有效提升葡萄耐寒能力。因此，今后應(yīng)著重注意抗寒種質(zhì)資源的選擇與培育，并采用更多的方法與手段對(duì)各葡萄品種進(jìn)行準(zhǔn)確的抗寒性鑒定，推進(jìn)葡萄抗寒機(jī)制的研究，為確定其環(huán)境適應(yīng)性提供理論依據(jù)。同時(shí)，還應(yīng)在大量生理研究的基礎(chǔ)上，加強(qiáng)對(duì)基因組學(xué)、代謝組學(xué)及蛋白組學(xué)等方面的廣泛研究，更深入的探索葡萄遺傳多樣性，發(fā)掘更多有效的抗寒相關(guān)基因，促進(jìn)對(duì)葡萄抗寒性的認(rèn)識(shí)以及抗寒分子育種的發(fā)展。