王正源，徐秀林，王燕

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093

前言

癌癥作為重大疾病之一，正嚴(yán)重威脅人類的生命健康，因癌癥而導(dǎo)致死亡的人數(shù)在2030年預(yù)計(jì)將達(dá)到1 300萬［1］。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，90%的癌癥患者死亡與癌癥的轉(zhuǎn)移相關(guān)，如果患者在癌癥轉(zhuǎn)移發(fā)生之前得到診斷和治療，至少有30%的死亡是可以預(yù)防的［2］。研究癌癥的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，探索腫瘤早期診斷治療的新途徑已經(jīng)成為當(dāng)代社會(huì)急需解決的重大問題。在腫瘤組織中脫落，侵襲并進(jìn)入血液循環(huán)的細(xì)胞通常稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cells,CTCs）。近年醫(yī)學(xué)上研究表明，富集及檢測(cè)在血液中出現(xiàn)的CTCs，不僅有助于腫瘤早期篩查、診斷、療效評(píng)價(jià)及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)控，還可以為腫瘤治療提供新的策略。

早在1869年，Ashworth首次在癌癥死亡患者的血液中發(fā)現(xiàn)CTCs，但有關(guān)外周血中CTCs的研究近些年才受到廣泛關(guān)注［3］。由于在外周血中CTCs含量極少，使得傳統(tǒng)細(xì)胞分析檢測(cè)技術(shù)無法有效識(shí)別［4］。在過去的10年中，使用CTCs作為實(shí)時(shí)液體活檢已經(jīng)受到了廣泛關(guān)注，對(duì)這些細(xì)胞的進(jìn)一步分析將會(huì)提高對(duì)轉(zhuǎn)移性級(jí)聯(lián)、腫瘤演變、異質(zhì)性和治療耐藥性的認(rèn)識(shí)［5］，強(qiáng)大的細(xì)胞分離技術(shù)可以快速有效地分離出CTCs并用于下游單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組分析。對(duì)血液樣品進(jìn)行前處理，通過細(xì)胞篩選富集手段初步提高腫瘤細(xì)胞的濃度，是增強(qiáng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)精度和靈敏度的必要環(huán)節(jié)。

近年來，圍繞CTCs的分選富集與檢測(cè)研究中，國(guó)內(nèi)外取得了顯著成果。美國(guó)強(qiáng)生公司的產(chǎn)品CellSearch System于2004年被美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)商業(yè)化，該產(chǎn)品采用免疫納米磁顆粒富集上皮來源的腫瘤細(xì)胞，能實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效富集檢測(cè)［6］。磁泳分離技術(shù)的核心優(yōu)勢(shì)是其操作可連續(xù)和工作效率高。流式細(xì)胞儀和熒光掃描顯微鏡也可應(yīng)用于CTCs分離，這些技術(shù)操作簡(jiǎn)單且需要的工具容易獲得，但有資料表明他們會(huì)丟失稀少的CTCs使得檢出率低并影響細(xì)胞活性［7］。隨著微流體技術(shù)的進(jìn)步，促使各種高精度、小型化的裝置快速發(fā)展，大大提高了CTCs分離過程的效率和回收率。這些小型化系統(tǒng)具有更高的靈敏度、精度，更低的成本以及與下游檢測(cè)或總體分析系統(tǒng)的兼容性好等優(yōu)勢(shì)［8］。Fluxion Biosciences新開發(fā)的微流體平臺(tái)IsoFlux使用微流體通道確保將磁性顆粒標(biāo)記的CTCs充分可靠地暴露于密集且強(qiáng)度均勻的磁場(chǎng)中，以實(shí)現(xiàn)高效的細(xì)胞富集回收［9］；有報(bào)道幾何增強(qiáng)型免疫捕獲芯片，采用幾何增強(qiáng)微結(jié)構(gòu)，通過增加靶細(xì)胞與抗體包被底物之間的碰撞頻率來提高CTCs捕獲效率［10］。根據(jù)目前對(duì)CTCs的檢測(cè)分選廣泛使用的分離富集方法的原理，其可分為無標(biāo)記分選和有標(biāo)記分選兩類。

1 無標(biāo)記分選

無標(biāo)記分選是一種基于細(xì)胞的生物物理特性，如尺寸、密度、變形能力或介電性能等信息，在不需要特異性標(biāo)記的情況下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和分類的微流控CTCs分選技術(shù)［11］。該類方法因操作簡(jiǎn)單、成本低及白細(xì)胞高消耗的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于CTCs的分選富集研究。目前用做循環(huán)腫瘤細(xì)胞無標(biāo)記分選的常用方法主要有以下幾種。

1.1 基于CTCs的大小與變形性差異分選

該分選方法通常情況下也稱為微結(jié)構(gòu)過濾技術(shù)，利用在大小及變形性等性質(zhì)上CTCs與其它血細(xì)胞存在差異進(jìn)行分離。主要結(jié)構(gòu)大致有圍堰式、交錯(cuò)流動(dòng)式、薄膜式及微柱式等類型。通常CTCs和白細(xì)胞的粒徑分別為15～25 μm和8～20 μm，兩者粒徑不同，通過在芯片微流道中設(shè)計(jì)微孔、微柱及濾膜結(jié)構(gòu)，當(dāng)含有CTCs的細(xì)胞溶液流過芯片微流道時(shí)，大顆粒的CTCs粘附在結(jié)構(gòu)中，血細(xì)胞隨著緩沖液流出，由于在粒徑上CTCs和白細(xì)胞粒徑有交叉部分，因此一些白細(xì)胞在結(jié)構(gòu)中也可能被捕獲，但增加緩沖液的流速，依據(jù)CTCs與白細(xì)胞變形能力的不同可實(shí)現(xiàn)二者分離。

Hosokawa等［12］設(shè)計(jì)由100×100個(gè)8～9 μm直徑的圓孔陣列組成的微流控芯片捕獲CTCs。在血液樣本中摻入NCI-H358細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用蠕動(dòng)泵負(fù)壓進(jìn)樣，最終腫瘤細(xì)胞固定在圓孔上，血細(xì)胞則隨緩沖液流出，從而成功分離CTCs。結(jié)果表明，混在1 mL血液中的10個(gè)CTCs可被該系統(tǒng)在15 min內(nèi)完全捕獲，且能很好保持細(xì)胞活性。經(jīng)染色鑒定其分選效率達(dá)97%，遠(yuǎn)高于采用CellSearch系統(tǒng)的分選效率。ClearCell?CX System是Abnova公司基于此原理研發(fā)的分離CTCs的產(chǎn)品［13］。通過在芯片內(nèi)部設(shè)計(jì)“爪形”結(jié)構(gòu)的圓柱形微柱陣列捕獲CTCs，其捕獲過程能動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，捕獲的CTCs可以進(jìn)行染色鑒別和計(jì)數(shù)。Lü等［14］設(shè)計(jì)了一種包含過濾和捕獲功能的間距漸變式芯片捕獲CTCs。為減少芯片堵塞，先經(jīng)過濾結(jié)構(gòu)濾掉樣本中的雜質(zhì)；循CTCs不能通過間距不同的捕獲結(jié)構(gòu)而被捕獲，在磷酸鹽緩沖液（PBS）中摻入CTCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其捕獲效率高于90%。Jin等［15］設(shè)計(jì)一種不同間距的“棘齒”型微柱陣列芯片捕獲CTCs，在健康人血液樣本中混入膀胱癌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其分離效率高于70%。

基于CTCs與其它血細(xì)胞在大小和變形性上的差異分選CTCs操作簡(jiǎn)單、捕獲效率高、無表面標(biāo)志物依賴，因此其應(yīng)用研究較為廣泛成熟。但在應(yīng)用中也存在一些局限，如該類結(jié)構(gòu)普遍會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞堆積導(dǎo)致微流道堵塞問題；尤其是圍堰式結(jié)構(gòu)加工精度要求高、通量低、分選純度低，腫瘤細(xì)胞極易發(fā)生堆積和堵塞；薄膜結(jié)構(gòu)的芯片要嵌入薄膜，導(dǎo)致鍵合要求高，工藝復(fù)雜；另外，在較大的機(jī)械力作用下，CTCs容易破裂，對(duì)分離精度和細(xì)胞活性造成一定影響。

1.2 基于細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)差異分選

1.2.1 基于慣性原理分選 在慣性效應(yīng)下，直圓柱Poiseuille流動(dòng)中，顆粒（如血液中的CTCs、白細(xì)胞等）遷移主要受垂直于流動(dòng)方向的兩個(gè)慣性升力影響，顆粒的平衡位置也由這兩個(gè)力決定。分別是指向微通道壁的拋物線速度梯度引起剪切誘導(dǎo)的升力（FS）和作用于顆粒的導(dǎo)致顆粒向微通道中心遷移的壁升力（FW）［16］。在這兩個(gè)力的共同作用下，遷移的顆粒最終在距離壁約0.2D處平衡，其中D為圓柱形管的直徑［17］。彎曲微通道結(jié)構(gòu)中，迪安流動(dòng)在微通道內(nèi)形成兩個(gè)反向旋轉(zhuǎn)的漩渦。最終粒子所受到的慣性升力（FL=FS+FW）和迪恩曳力（FD）共同作用，決定了粒子在流體中流動(dòng)過程中的平衡位置。彎流道中不同粒徑的細(xì)胞由入口處的隨機(jī)分散狀態(tài)會(huì)逐漸發(fā)生慣性聚集，遷移至各自特定的平衡位置，再結(jié)合芯片內(nèi)部結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，便實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs的捕獲。中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程研究所Chen［18］依據(jù)慣性分選原理，設(shè)計(jì)了一種混合芯片。該芯片是一個(gè)三重并行的螺旋慣性微流控芯片，與若干個(gè)可數(shù)的傾斜狹縫（螺旋裂縫芯片）相互連接，用于連續(xù)分選循環(huán)腫瘤細(xì)胞。其中，傾斜的狹縫與流體方向約成60°夾角。在慣性升力和迪恩曳力相互作用下，不同尺寸的顆粒（CTCs、白細(xì)胞及紅細(xì)胞等）在螺旋微通道的不同流線處實(shí)現(xiàn)各自的平衡。沿流動(dòng)方向設(shè)計(jì)的傾斜狹縫將分離的流線型顆粒分離到平行的較小的微通道中，連續(xù)作用導(dǎo)致原始微通道中某些尺寸的顆粒數(shù)量顯著減少，可以實(shí)現(xiàn)不同尺寸顆粒的慣性分離。同時(shí)通過設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)合光學(xué)吸收檢測(cè)，證明了這種三重平行化螺旋慣性微流體的整體布置反映了第一主微通道中穩(wěn)定的流線分布。另外，基于慣性原理分選CTCs技術(shù)，Kim等［19］設(shè)計(jì)了一種級(jí)聯(lián)的螺旋流道用于CTCs分選，Sun等［20］設(shè)計(jì)了一種雙螺旋結(jié)構(gòu)用于CTCs分選，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，其分選效率和重新捕獲率均較高。

1.2.2 基于確定性側(cè)向位移分選 該分選技術(shù)是通過在微流控芯片流道內(nèi)設(shè)置若干排與液體流動(dòng)方向成一定角度的交錯(cuò)排列的微柱陣列，當(dāng)有細(xì)胞溶液在芯片流道內(nèi)流動(dòng)時(shí)，不同粒徑大小細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡也不相同。尺寸大的細(xì)胞（如CTCs）因側(cè)向位移向一側(cè)匯聚，尺寸小的細(xì)胞（如紅細(xì)胞、白細(xì)胞等）會(huì)沿原軌跡運(yùn)動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)分離，收集到相應(yīng)的細(xì)胞。Loutherback等［21］首次證明使用此方法能分離CTCs。當(dāng)細(xì)胞混合液流經(jīng)芯片微流通道后，大粒徑的CTCs會(huì)向芯片壁面發(fā)生側(cè)向移動(dòng)而富集，而小粒徑的其它血細(xì)胞繼續(xù)保持原來的流動(dòng)方向流動(dòng)，在側(cè)壁通過收集即實(shí)現(xiàn)了CTCs分離。通過在PBS緩沖液中放入MCF-7實(shí)驗(yàn)，其分離效率高于85%。Liu等［22］通過設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)比較對(duì)病人外周血中多種稀有癌細(xì)胞采用圓柱與三角形陣列的分選效果，指出流速在小于50 μL/min下兩者捕獲率均較高，隨流速增大，圓柱陣列的重新捕獲率顯著降低，而三角陣列仍能保持較高的捕獲率。同時(shí)研究人員還探究細(xì)胞尺寸與流速對(duì)分選效果的影響，得出細(xì)胞尺寸越大、流速越低，則分選效果越明顯［16］。

綜上所述，基于細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)差異的分離方法同樣是一種依據(jù)細(xì)胞粒徑、形態(tài)差異的被動(dòng)式分選技術(shù)。具有在尺寸上對(duì)細(xì)胞的敏感度高、分選高通量的優(yōu)勢(shì)。但是，基于確定性側(cè)向位移的細(xì)胞分選技術(shù)也難以避免堵塞問題，且分選效率易受細(xì)胞族的尺寸不一、細(xì)胞變形性、微柱尺寸及制造加工的表面質(zhì)量等因素影響。

1.3 基于細(xì)胞電學(xué)性能差異分選

介電泳技術(shù)分選細(xì)胞的原理是基于腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞在電學(xué)性質(zhì)方面的差異，因介電力大小和方向不同，細(xì)胞在不同介電力作用方向上移動(dòng)，從而在電場(chǎng)中實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的分選。Holmes等［23］通過將一種帶狀電極鍵合安置在微流控芯片上，利用兩組電極分別產(chǎn)生正負(fù)介電泳力，在電極的不同區(qū)段收集不同細(xì)胞，成功分離白血病細(xì)胞THP-1。Wu等［24］采用該方法設(shè)計(jì)了一種類似結(jié)構(gòu)，帶狀電極的放置方向與流道的主流方向垂直，采用人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，成功實(shí)現(xiàn)了將其從人體血液中分離。Alshareef等［25］也設(shè)計(jì)了一種嵌入有電極的用于CTCs分選的微流控芯片，依據(jù)不同細(xì)胞的交流頻率存在差異的原理分離細(xì)胞混合液中的MCF-7細(xì)胞，其分選效率高于93%。介電泳分選技術(shù)雖然操作較簡(jiǎn)單，但要求細(xì)胞溶液通過非均勻電場(chǎng)的時(shí)間較長(zhǎng)，所以會(huì)極大限制微流控芯片流道中微流體流速，大大降低細(xì)胞分選效率，難以在臨床上廣泛應(yīng)用。由于電場(chǎng)的作用，其對(duì)細(xì)胞活性、電生理學(xué)特性及物理特性也有一定影響。

2 標(biāo)記分選

在微流體技術(shù)中，除了可依據(jù)細(xì)胞在尺寸、可變形性等物理特性的差異實(shí)現(xiàn)分選，還可以通過生物標(biāo)記，依據(jù)細(xì)胞在生物學(xué)上的特性差異來實(shí)現(xiàn)分離。同時(shí)隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，納米結(jié)構(gòu)，如納米珠，已廣泛應(yīng)用于CTCs分離富集及檢測(cè)［26］。因此，通過結(jié)合細(xì)胞與納米結(jié)構(gòu)表面的粘附因子以及基于常規(guī)抗體的親和相互作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs的分選富集。目前標(biāo)記分選常用方法主要有：基于抗原抗體親和性分選、基于納米顆粒的免疫磁珠分選等。

2.1 基于抗原抗體親和性分選

基于抗原抗體親和性反應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞分選是通過在芯片內(nèi)部通道或微結(jié)構(gòu)上固定標(biāo)記特定分子，該特定分子一般為與細(xì)胞表面抗原對(duì)應(yīng)的特異性抗體或適配體，兩者之間通過抗原抗體親和性反應(yīng)而特異性結(jié)合，在細(xì)胞混合溶液通過芯片內(nèi)部微通道時(shí)，目標(biāo)細(xì)胞表面抗原與通道或微結(jié)構(gòu)上的特定分子發(fā)生結(jié)合，細(xì)胞被固定在芯片內(nèi)，從而將其捕獲富集［27］。再用合適的方法，如通入熒光染料溶液染色標(biāo)記再清洗，實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs的鑒定；更換緩沖液，沖洗并回收目標(biāo)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)與其它細(xì)胞的分離進(jìn)行下游分析。He等［28］設(shè)計(jì)了一種在玻璃基底上修飾有EpCAM抗體的芯片用于CTCs分離，在健康人血液中摻入人結(jié)腸癌組織源細(xì)胞HCT116進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中CTCs發(fā)生特異性結(jié)合而留在芯片內(nèi)，資料表明其效率約為80%。Sheng等［29］通過幾何增強(qiáng)混合型芯片捕獲CTCs，為增大細(xì)胞與抗體的接觸機(jī)會(huì)以提高捕獲效率，芯片內(nèi)部設(shè)計(jì)有V形結(jié)構(gòu)。該芯片對(duì)混合在細(xì)胞混合液中的人胰腺癌細(xì)胞的捕獲效率可達(dá)90%，CTCs經(jīng)洗脫后可繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)的單細(xì)胞測(cè)序相關(guān)的實(shí)驗(yàn)分析。使用親和性細(xì)胞富集技術(shù)的主要難點(diǎn)是CTCs生物標(biāo)志物表達(dá)的異質(zhì)性，包括在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT）過程中常見捕獲靶標(biāo)EpCAM的表面表達(dá)較低。來自相同腫瘤類型的癌細(xì)胞系（如MCF-7和MDA-MB-231）也可能具有不同的EpCAM結(jié)合的表面密度。一些白細(xì)胞可能與CTCs具有相似的性質(zhì)，它們常常能在富集的樣品中持久存在，從而影響分離CTCs的純度。為解決這個(gè)問題，研究人員采用消耗血細(xì)胞的陰性分選技術(shù)分離富集CTCs。盡管如此，任何富集CTCs或消耗其它血細(xì)胞的生物化學(xué)手段都可能由于不均勻的生物標(biāo)記物表達(dá)而失去CTCs，或由于靈敏度和特異性受損而導(dǎo)致假陽(yáng)性細(xì)胞的無效去除；同時(shí)抗體結(jié)合也可能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，這將不利于CTCs的下游測(cè)序。鑒于癌癥的異質(zhì)性和單細(xì)胞分析的重要性，且由于與抗體包被的磁珠非特異性結(jié)合導(dǎo)致CTCs丟失而可能導(dǎo)致CTCs分離的不完全，從而制約人們對(duì)CTCs的生物學(xué)信息全面掌握。另外，親和性分選法要在通量和效率綜合考慮，流速越大，CTCs與抗體反應(yīng)的時(shí)間越少，雖能提高分選速度，但會(huì)導(dǎo)致分選效率降低。

2.2 基于納米顆粒的免疫磁珠分選

免疫磁珠分選是采用免疫磁珠與微流控芯片相結(jié)合分選富集CTCs的技術(shù)。大量研究表明利用免疫磁珠分選技術(shù)在微流控芯片上分離CTCs操作簡(jiǎn)便、捕獲效率高，并結(jié)合PCR技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)等步驟，能夠?qū)崿F(xiàn)檢測(cè)集成化和自動(dòng)化。Kang等［30］基于納米顆粒的免疫磁珠技術(shù)設(shè)計(jì)了一種分離CTCs的芯片，在主流道兩邊設(shè)計(jì)了很多與主流道相通的且預(yù)置有磁鐵的小室，當(dāng)細(xì)胞混合液在芯片流道中流動(dòng)時(shí)，CTCs因標(biāo)記有磁珠而被捕獲，白細(xì)胞則沿管道出口流出。將2～80個(gè)不同數(shù)目的乳腺癌細(xì)胞混入1 mL小鼠血液中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)顯示其捕獲效率高于90%。Hyun等［31］設(shè)計(jì)了一種融合免疫磁珠技術(shù)和親和性分選方法中的陽(yáng)性分選、陰性分選的微流控芯片用于富集CTCs。通過將表面修飾有CD45抗體的磁珠與細(xì)胞混合液中的白細(xì)胞結(jié)合，最后在一級(jí)分選流道區(qū)域利用外置磁鐵磁珠的吸附作用實(shí)現(xiàn)對(duì)白細(xì)胞的去除；在二級(jí)分選流道區(qū)域內(nèi)表面上修飾EpCAM抗體以實(shí)現(xiàn)對(duì)MCF-7（EpCAM+）的富集?；诩{米磁珠的免疫分選技術(shù)依賴磁性進(jìn)行分選，對(duì)細(xì)胞的捕獲和釋放易于控制，且無需對(duì)管道進(jìn)行修飾，靈敏度高，在研究中廣泛應(yīng)用。但使用該方法同基于抗原抗體親和性分選技術(shù)一樣，受到CTCs表面標(biāo)志物的限制，且磁珠與樣本的孵育預(yù)處理也是實(shí)驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)。

3 多級(jí)分選

近些年來基于微流體技術(shù)分選腫瘤細(xì)胞取得了顯著進(jìn)展，但每種單一的分選方法都具有靈敏度低或分選效率不高或通量較小的限制。為能實(shí)現(xiàn)高通量、高純度的分選外周血中含量極低的CTCs，研究者們集成多種分選技術(shù)，設(shè)計(jì)出對(duì)CTCs多級(jí)分選的微流控芯片。Hou等［32］通過將兩個(gè)用于CTCs分選用的螺旋微流控芯片進(jìn)行串聯(lián)，以實(shí)現(xiàn)二次提純，提高分選效率。通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對(duì)MCF-7能很好的實(shí)現(xiàn)聚集，且在3 mL/h流量下其捕獲率高于85%。東南大學(xué)倪中華教授課題組基于集成慣性分選技術(shù)和介電泳細(xì)胞分選技術(shù)提出一種多級(jí)分選芯片，一級(jí)通道通過內(nèi)側(cè)低、外側(cè)高的梯形截面螺旋結(jié)構(gòu)初級(jí)慣性高通量分選血液樣本溶液，二級(jí)通道通過在高寬高比的矩形截面流道底部安裝兩組電極依靠介電泳技術(shù)實(shí)現(xiàn)次級(jí)分選CTCs。該芯片整合了兩種技術(shù)的高通量和高分選效率的優(yōu)勢(shì)，為分選CTCs的微流控芯片發(fā)展提供了一種新思路［22］。多級(jí)分選微流控芯片因其能夠很好地提高分選效果，整合各種分選技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，保證高通量分選的同時(shí)，保證對(duì)高純度的要求，使得其在臨床上具有更為實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。其次級(jí)分選流道可以是對(duì)廢液的再次富集，提高重新捕獲率，或是再次通過陰性分選技術(shù)除雜，提高實(shí)驗(yàn)后樣品的純度。

4 總結(jié)與展望

微流控芯片具有體積小、對(duì)操作人員要求低、易于滿足檢測(cè)設(shè)備對(duì)集成化、微型化發(fā)展的要求，同時(shí)大大降低了實(shí)驗(yàn)對(duì)試劑的消耗，近些年來在分選CTCs的研究中應(yīng)用越來越廣泛。本文詳細(xì)闡述了各種無標(biāo)記及有標(biāo)記技術(shù)的方法原理，并結(jié)合成功案例分析了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。微流控芯片分選細(xì)胞的技術(shù)目前仍面臨一些挑戰(zhàn)：處理大量血液樣本耗時(shí)久；基于細(xì)胞尺寸和變形性的分選技術(shù)易遇到堵塞；基于慣性聚焦的分選技術(shù)產(chǎn)生的剪切力較大會(huì)影響到細(xì)胞活性；部分CTCs會(huì)丟失表達(dá)；驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所配置的含有CTCs的溶液并不能完全真實(shí)反映臨床上病人外周血液中的情況。

盡管目前在微流控芯片推廣至臨床應(yīng)用的過程中面臨著制備工藝繁雜、可靠性較差等因素的阻礙，但不可否認(rèn)其在CTCs分選、富集及檢測(cè)上具有巨大潛力。多級(jí)分選芯片集成多種分選技術(shù)手段，兼具無標(biāo)記分選技術(shù)通量較高和標(biāo)記分選技術(shù)操控精確的優(yōu)勢(shì)，更易滿足CTCs分選的要求，其目前尚處于實(shí)驗(yàn)研究階段，但其良好的分選效果將成為未來微流控芯片發(fā)展的一個(gè)主要方向。同時(shí)，微流控芯片將向著更加集成化（集成細(xì)胞預(yù)處理、分選富集、計(jì)數(shù)診斷及檢測(cè)分析等功能單元于一體）、微型化、檢測(cè)功能多樣的方向發(fā)展，高效率、高精準(zhǔn)度以及低成本的檢測(cè)必將是未來微流控芯片在CTCs檢測(cè)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，為實(shí)現(xiàn)腫瘤相關(guān)疾病的早期診斷、預(yù)后評(píng)估及藥物治療效果判定提供可靠的臨床數(shù)據(jù)。