王白鶴 孫建方

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)使上皮細胞失去極性獲得間充質(zhì)表型，從而具有侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，它是胚胎發(fā)育所必需的過程[1]，并且與癌癥進展相關(guān)[2]。除了受相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)外，EMT還可以在轉(zhuǎn)錄后水平被調(diào)控，上皮剪接調(diào)節(jié)蛋白1和2(ESRP1和ESRP2)已被描述為參與EMT相關(guān)的上皮特異性剪接調(diào)節(jié)劑。本篇文章主要針對ESRPs介導(dǎo)的剪接變體在EMT相關(guān)上皮表型調(diào)節(jié)中的作用和調(diào)控機制[3]，以及與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性作一綜述。

1 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)程序

許多細胞外信號通路，比如TGFβ，Notch，Wnt，F(xiàn)GF和HGF能夠通過誘導(dǎo)EMT-TF(Snail，Slug，ZEB1，ZEB2和Twist)的表達來促進EMT過程。這些信號傳導(dǎo)途徑與胚胎發(fā)育密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子的誘導(dǎo)通常導(dǎo)致E-鈣黏蛋白的喪失，這是EMT的首要表現(xiàn)之一。 E-鈣黏蛋白的抑制是通過在編碼CDH1基因的E-鈣黏蛋白的啟動子位點的E盒處形成抑制性復(fù)合物來介導(dǎo)的。E-鈣黏蛋白的喪失，以及緊密連接和黏附連接功能的喪失以及細胞頂端-基底極性都是EMT的標志，并且導(dǎo)致以間充質(zhì)標記物的高表達為特征的細胞類型，例如波形蛋白表達，細胞形狀變成紡錘形，以及獲得遷移和侵襲能力[4]。反向程序MET在胚胎發(fā)育過程中驅(qū)動先前間充質(zhì)細胞向上皮細胞轉(zhuǎn)化，可能導(dǎo)致EMT途徑的下調(diào)，但是關(guān)于抑制EMT或促進MET的特定轉(zhuǎn)錄途徑目前研究較少。

EMT程序的失調(diào)與腫瘤發(fā)病機制密切相關(guān)。絕大多數(shù)致命的人類癌癥是源自上皮組織的腫瘤，例如來源于乳腺、肺、胰腺和結(jié)腸的腫瘤。雖然早期腫瘤保留了許多正常上皮細胞的特征，但高度侵襲性的腫瘤獲得間充質(zhì)特征，從而可以侵入周圍的基質(zhì)[5]。實際上，在宮頸癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌和乳腺癌的腫瘤侵襲過程中可以發(fā)現(xiàn)EMT的表達，包括E-鈣黏蛋白表達的喪失，波形蛋白表達的增加和遷移能力的明顯增強。盡管有大量的體內(nèi)研究與異種移植或遺傳小鼠模型支持EMT在腫瘤進展中的因果作用，但是EMT對人類癌癥和轉(zhuǎn)移的準確影響仍然存在爭議，原因是原發(fā)腫瘤樣本的證據(jù)不足[6]。有研究在癌旁組織發(fā)現(xiàn)了E-鈣黏蛋白的低表達，其他轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞未顯示EMT的跡象。最近發(fā)現(xiàn)，EMT還與干細胞特性和耐藥性的獲得有關(guān)[2]，這表明EMT在腫瘤發(fā)生中具有重要的選擇性作用。由于胚胎發(fā)育的重要性以及尚未完全闡明的致癌作用，EMT過程有待進一步研究。

2 ESRPs在細胞上皮表型調(diào)節(jié)中的作用

使用各種生物信息學工具和功能性交互網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)ESRPs與EMT過程密切相關(guān)。多種研究顯示在敲除或過表達ESRPs細胞中，受影響的功能途徑存在大的重疊。具體而言，眾多研究的途徑分析一致證明，主要涉及細胞黏附，細胞遷移運動和細胞骨架調(diào)節(jié)三方面，這些都是特征性地區(qū)分上皮細胞和間充質(zhì)細胞的途徑[6]。ESRP靶向的大多數(shù)轉(zhuǎn)錄編碼蛋白具有上皮細胞功能，但是還不清楚ESRP誘導(dǎo)的上皮剪接變體是如何調(diào)節(jié)上皮表型的。最近相關(guān)研究進展表明，這些上皮剪接變體類似于FGFR2，是通過各種機制對上皮細胞功能發(fā)揮著重要影響。

2.1 影響細胞黏附的上皮剪接蛋白變體 p120-Catenin：成熟的基于E-鈣黏蛋白的黏附連接點是上皮細胞的主要標志，作為鈣黏蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合物的一部分，p120-連環(huán)蛋白與鈣黏蛋白的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且通過內(nèi)吞作用和蛋白酶體降解來阻止其下調(diào)，從而作為鈣黏蛋白穩(wěn)定性和功能的主要調(diào)節(jié)劑[7-9]。p120-連環(huán)蛋白的其他功能包括調(diào)節(jié)Rho-GTP酶信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，特別是充當了Wnt信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)劑[10，11]。編碼p120-連環(huán)蛋白的人CTNND1基因具有四個不同的翻譯起始位點和四個可變剪接的外顯子。目前區(qū)分的最相關(guān)的剪接變體是含有替代外顯子2和3的相對長的間充質(zhì)特異性剪接變體。間充質(zhì)p120變體的異常表達與癌癥進展有關(guān)，可能是通過核信號傳導(dǎo)或通過影響Rho-GTP酶信號傳導(dǎo)的機制[10，11]。有研究發(fā)現(xiàn)p120-連環(huán)蛋白的長間充質(zhì)異構(gòu)體可以促進MDA-MB-231細胞的侵襲性，這依賴于它們抑制RhoA活化的能力[12]。

CD44：CD44蛋白是普遍表達在跨膜細胞的表面蛋白。CD44的細胞外結(jié)構(gòu)域主要作為細胞外基質(zhì)分子透明質(zhì)酸的受體起作用，并且具有其他ECM組分和細胞表面受體的其他結(jié)合位點。CD44的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與肌動蛋白細胞骨架間接相關(guān)，并介導(dǎo)其信號功能，從而控制細胞-細胞和細胞-基質(zhì)黏附，細胞遷移、運動和信號傳導(dǎo)[13]。AS可以產(chǎn)生多種CD44 mRNA轉(zhuǎn)錄物。外顯子1-5和外顯子16-20通常拼接在一起，并編碼標準CD44s蛋白異構(gòu)體。另外包含10個可變中間體外顯子產(chǎn)生多個較長的可變剪接CD44蛋白異構(gòu)體，命名為CD44v1-10[13]。較長變體形式的CD44具有延伸的細胞外莖結(jié)構(gòu)域，它具有高度糖基化并提供額外的配體結(jié)合位點[13，14]。包含外顯子變體與癌癥進展相關(guān)。雖然包含一些變體外顯子，特別是CD44v4-5和CD44v6增加了轉(zhuǎn)移能力，但是v8-10的包含對于正常上皮細胞是典型的并且與E-鈣黏蛋白表達相關(guān)[14]。CD44v8-10和CD44v1-2取決于ESRP1活性[15]。由于ESRP1的喪失和切換回CD44s表達而排除這些外顯子對于EMT發(fā)生是至關(guān)重要的[15]，這表明ESRP部分地通過抑制CD44抑制EMT過程。

Integrin-α6：整聯(lián)蛋白是參與細胞基質(zhì)附著的異二聚體跨膜糖蛋白。目前，已經(jīng)鑒定了18個α亞基和8個β亞基，其可以形成異二聚體[16]。層黏連蛋白結(jié)合α6整聯(lián)蛋白亞基與β1整聯(lián)蛋白結(jié)合形成α6β1整合素，它和β4整聯(lián)蛋白在許多細胞類型中被發(fā)現(xiàn)，常見于上皮細胞，其中α6β4整聯(lián)蛋白是半橋粒的一部分。α6整聯(lián)蛋白基因ITGA6的外顯子25的AS產(chǎn)生兩種剪接變體α6A和α6B。最近，它顯示包含外顯子25，導(dǎo)致α6B的較長細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，由ESRP1介導(dǎo)α6A和α6B剪接變體在胚胎發(fā)育過程中具有不同的功能和表達譜[17]。成人結(jié)腸上皮也顯示差異表達，因為α6B由靜止分化細胞表達，而α6A在增殖細胞中被發(fā)現(xiàn)[18]。結(jié)腸癌與表達α6A的細胞增加相關(guān)，其通過涉及α6A激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑的機制導(dǎo)致腫瘤增殖增加[18]。尚不清楚它是否促進α6整合素向β1轉(zhuǎn)化，比如在乳腺癌干細胞中，ESRP1介導(dǎo)的α6整合素剪接的喪失可能促進α6Aβ1異二聚化并導(dǎo)致腫瘤形成[17]。

2.2 影響轉(zhuǎn)移和侵襲的上皮剪接蛋白變體 MENA：MENA是肌動蛋白調(diào)節(jié)劑Ena/VASP蛋白家族的成員。它是一種細胞內(nèi)支架蛋白，調(diào)節(jié)片狀偽足，絲狀偽足,細胞-細胞連接和黏著斑中肌動蛋白絲的聚合，并參與調(diào)節(jié)細胞形態(tài)，細胞骨架排列和細胞運動。與相關(guān)家族成員ENA和VASP相反，目前已經(jīng)在人類中發(fā)現(xiàn)了幾種甲型谷胱甘肽的AS異構(gòu)體[19]。除了普遍表達的人MENA(hMENA)之外，人腫瘤細胞通常表達在正常組織中未發(fā)現(xiàn)的一種或多種剪接變體。其中，以跳過的外顯子6命名的hMENAΔv6與包含外顯子11a變體命名的hMENA11a互斥，hMENA11a的表達受ESRP1調(diào)節(jié)[20，21]，并與E-鈣黏蛋白表達和減少的侵襲相關(guān)，與其在上皮細胞中的特異性表達一致，與間充質(zhì)細胞相反。有趣的是，兩種剪接變體在同一腫瘤中表達不同，在乳腺癌研究中，發(fā)現(xiàn)表達hMENA11a的細胞構(gòu)成原發(fā)腫瘤的大部分，而侵襲性腫瘤細胞表達hMENAΔv6[22]，這些發(fā)現(xiàn)表明，hMENA AS中的ESRP1依賴性轉(zhuǎn)換控制著腫瘤細胞的侵襲。實際上，最近的研究強調(diào)了hMENAΔv6可能用作非小細胞肺癌和乳腺癌的預(yù)后生物標志物[19，23]。

Exo70：Exo70是一種八聚體蛋白復(fù)合物，與調(diào)節(jié)上皮細胞的胞吐作用和頂端 - 基底極化有關(guān)。Exo70至少有五種可變剪接的異構(gòu)體[24，25]。在這些異構(gòu)體中，Exo70-E表達受ESRP1控制并且是上皮特異性的，而Exo70-M存在于缺乏ESRP1的間充質(zhì)細胞中。這些異構(gòu)體具有不同的功能，僅有Exo80-M結(jié)合Arp2/3復(fù)合物，從而促進腫瘤細胞的侵襲。有趣的是，在間充質(zhì)細胞中引入Exo70-E不僅可以抑制細胞侵襲，還可以通過一種可能依賴于抑制EMT-TF Snail的機制來獲得上皮表型[25]。據(jù)報道，Exo70還可通過結(jié)合剪接體直接調(diào)節(jié)其自身的剪接，盡管這涉及Exo70-E和Exo-70M之間共有的結(jié)合區(qū)域[24]。然而，這些研究表明由ESRP誘導(dǎo)的Exo70變體可能作為上游潛在的反饋調(diào)節(jié)劑起作用。

3 ESRP剪接變體調(diào)節(jié)EMT過程

雖然有充足的證據(jù)表明ESRP通過EMT相關(guān)信號通路調(diào)控上皮細胞的剪接事件，但是ESRP的表達是EMT過程的繼發(fā)結(jié)果，還是與EMT相反，是一種相對獨立的選擇性轉(zhuǎn)錄后程序，目前尚不清楚。可以明確的是，下調(diào)ESRP1和ESRP2是EMT作用的結(jié)果，該過程由EMT-TFs誘導(dǎo)產(chǎn)生[15，20，26]。

在人乳腺上皮(HMLE)細胞系中，通過他莫昔芬誘導(dǎo)Twist ER的表達，14天內(nèi)完成Twist誘導(dǎo)的EMT過程，包括E-cadherin的缺失，N-cadherin的獲得，以及成纖維樣細胞的形成。RNA序列分析發(fā)現(xiàn)Twist-ER誘導(dǎo)HMLE細胞系中EMT顯著降低ESRP的表達，并導(dǎo)致大約1500個AS的改變[15，26]。其中，約8%與外顯子跳躍事件重疊，這些事件在先前研究中歸因于ESRPs[26]。雖然這些結(jié)果可能表明ESRP和EMT控制不同的程序，但是EMT和ESRP調(diào)控AS之間的相互作用還需進一步探索。

有實驗證據(jù)表明，敲除上皮PNT2細胞系中ESRP1和ESRP2基因，可以誘導(dǎo)間充質(zhì)標志物的形成如波形蛋白，纖連蛋白，MMP-2和N-鈣黏蛋白，并降低E-鈣黏蛋白在質(zhì)膜的定位[21]。有趣的是，MDA-MB-231細胞中ESRP1和ESRP2的表達可引起E-鈣黏蛋白升高，而不影響N-cadherin或纖維連接蛋白[27]，表明ESRP可能通過不同的機制影響E-鈣黏蛋白的表達，不同于ESRP誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體對EMT的上游調(diào)節(jié)。最近有頭頸部鱗狀細胞癌細胞(HNSCCs)的研究表明，ESRPs可以在EMT中扮演互補角色。ESRP1控制促進運動的Rac1剪接變體Rac1b的AS[28，29]，ESRP2則通過另外一種不同的機制下調(diào)E-鈣黏蛋白的表達。ESRP2降低E-鈣黏蛋白的機制涉及EMT-TF SIP1，該過程可下調(diào)E-鈣黏蛋白轉(zhuǎn)錄[29]。目前對ESRP2如何調(diào)控SIP1及其轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機制尚不清楚[29]。

改變細胞標記物如E-鈣黏蛋白的表達可以誘導(dǎo)EMT程序，導(dǎo)致細胞形態(tài)和細胞遷移能力的改變[6]。因此，細胞功能實驗檢測ESRP1/ESRP2敲除或過表達對細胞形態(tài)和細胞遷移的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同時敲除ESRP1和ESRP2，或只敲除ESRP1，HMEC細胞形態(tài)發(fā)生改變，即紡錘形細胞增加，鵝卵石樣細胞以及細胞-細胞黏附減少。此外，劃痕實驗中，同時敲除ESRP1和ESRP2，或只敲除ESRP1可以促進細胞遷移[21]，Ishii等[29]在HNSCCs(SAS和HSC-4)研究中同樣證明了這一點。在HMLE-Twist細胞中過表達ESRP1后，遷移特征改變?yōu)樵趩螌由掀ぜ毎械某Ｒ婎愋蚚26]。在調(diào)查對肌動蛋白細胞骨架的影響時，觀察到敲除ESRP1可促進絲狀偽足的形成，而ESRP2并沒有。這表明ESRP1和ESRP2是以不同方式抑制細胞運動：ESRP1通過細胞骨架作用，而ESRP2是通過細胞-細胞黏附方式。

4 ESRPs和腫瘤形成

在腫瘤形成過程中，AS和可變蛋白異構(gòu)體一樣，可以促進腫瘤癌蛋白的形成。AS被認為腫瘤的標記物[8，30]，可以影響多個過程，包括通過表達端粒酶hTERT較短的亞型來促進復(fù)制，通過EGFR受體的可變剪接促進腫瘤的持續(xù)增殖信號的傳導(dǎo)[31]。AS介導(dǎo)的促癌過程的其他特征包括逃避生長抑制因子，減少細胞凋亡，細胞代謝失調(diào)和侵襲、轉(zhuǎn)移等[8]。

腫瘤形成與分化上皮的特征缺失有關(guān)，這與ESRPs在腫瘤形成中的作用類似，實際上，在多個腫瘤細胞系中，例如來自前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、腎癌、頭頸部鱗狀細胞癌的轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞系中，細胞和腫瘤組織的侵襲與ESRP1和2的低表達有關(guān)[27，28，32，33]，表明了ESRPs的腫瘤抑制功能。這一觀點得到了相關(guān)研究的進一步支持，有研究表明ESRP1過表達在體外減少了胰腺癌細胞的遷移和增殖，在體內(nèi)很少產(chǎn)生肝轉(zhuǎn)移[33]。此外，臨床數(shù)據(jù)顯示ESRP1表達水平與透明細胞腎細胞癌和乳腺癌中的患者存活率正相關(guān)[32]。在原發(fā)性結(jié)腸腫瘤微衛(wèi)星轉(zhuǎn)移灶中，發(fā)現(xiàn)50%的ESRP1基因突變，體外實驗敲除ESRP1可以抑制癌細胞生長，表明ESRP1是結(jié)腸癌的腫瘤抑制因子[34]。

與之相反，ESRP1高表達和由此產(chǎn)生的CD44v8-10剪切變體與4T1小鼠模型和乳腺癌患者更高肺轉(zhuǎn)移相關(guān)[35]。ESRP1誘導(dǎo)的剪接變體CD44v8-10有穩(wěn)定胱氨酸轉(zhuǎn)運蛋白xCT(SLC7A11)的能力，同時增加細胞對活性氧的抵抗力，使其具有潛在的致癌功能[35]。乳腺癌細胞缺氧也會引起ESRP1表達增加，促進向間質(zhì)表型的轉(zhuǎn)化，但具體機制有待明確。ESRP1可促進多個乳腺癌細胞系對抗癌劑苯基丁酸酯(一種組蛋白脫乙?；皋卓箘?的敏感性，因此，ESRP1降低了對化學抗性有確定作用的基因表達，例如AXL，IFI16和CAV1[36]。

關(guān)于ESRP2在腫瘤形成中的作用研究較少。在大多數(shù)透明細胞腎細胞癌患者中，ESRP1和ESRP2均有腫瘤抑制功能，但是作用機制不同。在這些腫瘤中，ESRP1 mRNA表達顯著下降，ESRP2 mRNA表達趨于穩(wěn)定，但是由于Arkadia功能喪失降低了剪接活性，其促進了ESRP2誘導(dǎo)的剪接[37]。在HNSCCs中也報道ESRP1和ESRP2的調(diào)節(jié)，其中ESRP1通過Rac1剪接調(diào)節(jié)細胞運動[29]，而ESRP2影響細胞-細胞黏附，有數(shù)據(jù)表明ESRP1 mRNA表達水平受缺氧條件影響，而ESRP2不受影響。總之，大部分研究表明ESRPs具有腫瘤抑制作用，也有研究發(fā)現(xiàn)ESRP1有腫瘤保護作用，因而ESRP1和ESRP2的調(diào)控機制及其功能并不完全一致。

5 結(jié)論

ESRPs已成為上皮細胞剪接程序的主要調(diào)節(jié)因子,它通過誘導(dǎo)上皮表型改變，從而參與細胞-細胞黏附，細胞遷移運動和細胞骨架。闡明ESRPs在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及其調(diào)控機制，將對深入了解人類胚胎發(fā)育和腫瘤的診斷治療過程具有重大指導(dǎo)意義。