盧 燕，李秋艷，李茹芳，藍(lán) 海，2*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)公共基礎(chǔ)教學(xué)部，云南大理 671006）

齲齒又稱“蛀牙”，是一種常見的牙組織被慢性破壞的感染性疾病〔1〕。齲病由細(xì)菌、食物、個體等多種因素引起，影響牙齒的美觀、發(fā)音，更嚴(yán)重地影響了牙齒的功能〔2〕，齲病可直接損害牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)，若不及時治療，一個很小的齲洞會不斷發(fā)展并最終損害整個牙體，造成嚴(yán)重后果。前期體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紫地榆不同提取物有一定的防齲作用〔3-4〕。本實(shí)驗(yàn)將研究紫地榆不同提取物在動物體內(nèi)是否也有防齲作用。

1 材料

1.1 主要儀器Y135型中藥材粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；COOL SAFE95-15冷凍干燥機(jī)（Genen Company Limited）；XTL-3B體視顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）。

1.2 藥液配制將紫地榆根粉碎，稱取20 006.98 g，用95%工業(yè)乙醇浸泡48 h，旋蒸得到浸膏，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到乙酸乙酯和正丁醇部分（以下分別稱為乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物），冷凍干燥成粉末，均用蒸餾水將其配置成2 mg∕mL溶液。

1.3 細(xì)菌、培養(yǎng)基、動物、飼料變形鏈球菌（Streptococcus mutans，ATC25175）；TPY液體培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；瓊脂（北京索萊寶科技有限公司）；TPY固體培養(yǎng)基：每100 mL TPY液體培養(yǎng)基中加2 g瓊脂，高壓滅菌；SD大鼠，共40只，雌雄各半，體質(zhì)量約200 g，購買于昆明楚商科技有限公司，合格證號：SYXK（滇）2011-0004；致齲飼料2000#〔5〕，購買于北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 內(nèi)源性細(xì)菌的除去SD大鼠40只，用普通飼料喂養(yǎng)1周。在大鼠飲用水中加入氨芐西林2.4 mg∕mL、鏈霉素0.5 mg∕mL，除去大鼠口腔內(nèi)的內(nèi)源性細(xì)菌，連續(xù)3 d。第3天用棉簽取大鼠口腔唾液，接種在TPY固體培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，觀察口腔內(nèi)細(xì)菌生長情況。實(shí)驗(yàn)大鼠從第3天開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束都喂養(yǎng)致齲飼料2000#。

2.2 變形鏈球菌的培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)選用變形鏈球菌作為口腔致齲菌〔6〕。用接種環(huán)將凍存的變形鏈球菌接種在TPY固體培養(yǎng)基上，放在厭氧培養(yǎng)袋中，加入產(chǎn)氣袋，放入恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)48 h。將復(fù)蘇的變形鏈球菌轉(zhuǎn)種至TPY液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，離心，取下面的細(xì)菌。

2.3 接種細(xì)菌用生理鹽水將菌液配成5×107CFU∕mL，用移液槍量取0.8 mL于1 mL離心管中，用棉簽蘸取接種于大鼠口腔內(nèi)，剩余的用灌胃針注入大鼠口腔，連續(xù)3 d。第3天蘸取大鼠口腔唾液，接種在TPY固體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，觀察變形鏈球菌生長情況。

2.4 給藥第5天將大鼠分成4組，每組10只，雌雄各半。分別用蒸餾水配制的2 mg∕mL紫地榆乙酸乙酯提取溶液、2 mg∕mL正丁醇提取溶液、0.1%NaF溶液、蒸餾水處理大鼠口腔。具體方法為左手抓住大鼠頸部成仰臥位，右手用棉簽分別蘸取上述溶液涂在大鼠口腔各個部位，包括前切牙、后磨牙、舌面、舌背，1 mL∕只，剩余的溶液用灌胃針注入大鼠口腔中，處理后3 h內(nèi)禁食禁水，每天處理2次（上午9：00，下午8：00），連續(xù)5周，整個操作由同一人完成。每周稱量1次大鼠體質(zhì)量。在最后1周用10%水合氯醛腹腔注射處死大鼠，取上下頜骨，去除肉組織，用4 mg∕mL紫脲酸銨染色液染色36 h，洗凈，用超薄金剛磨砂片沿牙遠(yuǎn)近中心向矢狀半切，清洗干凈，干燥。

2.5 Keyes法評價齲損目前體內(nèi)牙齒評分均用Keyes評分法〔5〕，在體視顯微鏡下對大鼠磨牙光滑面齲、窩溝面齲進(jìn)行分類計(jì)分，齲損程度分為E、Ds、Dm、Dx四級，依次代表釉質(zhì)齲，牙本質(zhì)淺層齲、中層齲、深層齲。

2.6 掃描電鏡觀察大鼠切牙將大鼠切牙沿牙遠(yuǎn)近中心向矢狀半切，用掃描電鏡觀察致密度。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以（xˉ±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠基本情況在實(shí)驗(yàn)過程中，觀察大鼠的毛發(fā)、呼吸、飲食基本正常，行為靈活，體質(zhì)量逐漸增加，統(tǒng)計(jì)分析紫地榆不同提取物組、NaF組、蒸餾水組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化（±s,n=10，g）

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化（±s,n=10，g）

注：組間比較P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別乙酸乙酯提取物組給藥前245.65±22.10給藥1周247.29±26.43給藥2周253.72±26.49給藥3周252.41±27.10給藥4周248.88±26.27給藥5周267.34±32.06正丁醇提取物組NaF組249.58±20.96 242.96±26.33 250.50±25.68 246.56±26.97 259.79±25.41 254.00±28.29 254.73±26.76 255.30±30.49 248.80±26.33 264.52±45.29 257.61±27.67 260.00±31.47 250.06±54.67空白組245.09±36.21257.33±39.16250.76±18.39256.91±49.64244.51±51.55

3.2 光滑面Keyes記分大鼠牙光滑面齲損只觀察到E級、Ds級，Dm、Dx級均未觀察到。E級齲損、Ds級齲損中紫地榆不同提取物組與蒸餾水組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但紫地榆不同提取物組與NaF組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；紫地榆不同提取物組間比較，差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。且NaF組未觀察到Ds級齲損。見表2。

表2 光滑面Keyes記分（xˉ±s,n=10）

3.3 窩溝面Keyes記分E級齲損中，與蒸餾水組比較，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時，紫地榆乙酸乙酯提取物組與NaF組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但正丁醇提取物組與NaF組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Ds、Dm、Dx級齲損中，各組與蒸餾水組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但與NaF組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；紫地榆不同提取物組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。NaF組中未檢測到Dm、Dx級齲損，乙酸乙酯提取物組、正丁醇提取物組未檢測到Dx級齲損，只有蒸餾水組中檢測到E、Ds、Dm、Dx級齲損。見表3。

表3 窩溝齲Keyes記分（xˉ±s,n=10）

3.4 掃描電鏡觀察紫地榆乙酸乙酯提取物組、正丁醇提取物組表面裂縫明顯比蒸餾水組、NaF組少，正丁醇組比乙酸乙酯提取物組更致密，因此有更好的再礦化作用。見圖1。

圖1 大鼠切牙掃描電鏡圖（×5 000）

4 討論

Keyes記分由P.H.Keyes在1958年提出，是目前應(yīng)用最廣泛的評分方法。E級記分反應(yīng)齲損的廣度，Ds、Dm、Dx級齲損反應(yīng)齲損的深度，Ds級齲損為牙釉質(zhì)和1∕4牙本質(zhì)，Dm級齲損為1∕4～3∕4牙本質(zhì)，Dx級齲損大于等于3∕4牙本質(zhì)，Dx級齲損最嚴(yán)重。當(dāng)相鄰的數(shù)值間有輕微重疊時，在不相鄰的數(shù)值間可以有忽略不計(jì)的重疊部分，因?yàn)樯锊町惖囊饬x遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過重疊部分。雖然都是人為評分，但實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的意義遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過人為的誤差。

在本實(shí)驗(yàn)中，與蒸餾水組相比，紫地榆不同提取物組的齲損分?jǐn)?shù)明顯更低，無論是光滑面還是窩溝各級評分都更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但與NaF組相比，除了乙酸乙酯提取物組在窩溝E級齲損中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）外，其他各級差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。且紫地榆乙酸乙酯提取物組和正丁醇提取物組無最深的牙本質(zhì)深層齲，牙本質(zhì)中層齲分較低，因此，紫地榆乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物有防齲效果，評分比蒸餾水高，比NaF組低。掃描電鏡結(jié)果顯示，紫地榆乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物組比蒸餾水、NaF組表面更致密，裂縫更少，再礦化效果更好。

目前常用防齲的物質(zhì)主要為氟化物，但存在一定的弊端，如出現(xiàn)氟斑牙等，且吞咽不利于兒童的發(fā)展〔7〕。天然藥物以其無毒副作用等優(yōu)勢越來越受到大眾青睞，而研究發(fā)現(xiàn)，天然防齲藥物的成分雖然復(fù)雜，但主要成分為鞣質(zhì)〔8-11〕。紫地榆的主要成分為鞣質(zhì)類成分，因此猜測紫地榆中有防齲作用的為鞣質(zhì)類成分，但需要進(jìn)一步研究。