周新娟，鄧 巍，滕 曼，劉碩然，肖 文，楊曉燕*

（1.大理大學公共衛(wèi)生學院，云南大理 671000；2.大理大學東喜瑪拉雅研究院，云南大理 671003；3.大理大學農(nóng)學與生物科學學院，云南大理 671003）

捕食線蟲真菌是指以營養(yǎng)菌絲特化形成的黏性菌絲、黏性分枝、黏性球、黏性網(wǎng)、非收縮環(huán)、收縮環(huán)及冠囊體等捕食器官來捕捉線蟲的一類真菌，是自然界中線蟲種群自然控制的重要因子〔1〕。由于在生防運用上表現(xiàn)出巨大的潛力，這類真菌已受到研究者的廣泛關(guān)注。捕食線蟲真菌作為一種兼性菌，既可營腐生生活，又可主動捕捉線蟲來獲取營養(yǎng)。在某些干擾因素的影響下，捕食線蟲真菌獲取營養(yǎng)的方式可能會發(fā)生改變。

火是大多數(shù)生態(tài)系統(tǒng)中獨特且重要的環(huán)境因子，也是自然界中普遍存在的干擾因素之一?；馃蓴_會導致植物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化〔2〕，增加植物群落的物種豐富度和多樣性指數(shù)〔3〕，火燒發(fā)生時燃燒大量的植物凋落物，改變土壤溫度、濕度等進而影響土壤的物理和化學性質(zhì)〔4〕，提高植物根系的生物量〔5〕，而植物根系與土壤微生物共生又能增加植物對土壤養(yǎng)分的吸收，從而影響土壤微生物的種類和數(shù)量〔6〕。由于全球變暖及計劃燒除等原因使得未來火干擾在生態(tài)系統(tǒng)中的作用可能會進一步增強，捕食線蟲真菌作為自然界中線蟲種群數(shù)量的重要平衡因子，必然會受到這一干擾因素直接或間接的影響，但是目前還未見相關(guān)的研究報道。故本研究對蒼山火燒跡地、近火燒地和非火燒地的捕食線蟲真菌資源進行了調(diào)查，對比分析不同樣地中捕食線蟲真菌的種群差異，以初步了解火燒對該類型真菌群落結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品采集采集蒼山北部魚山（25°45′49.80″N，100°07′44.64″E）、中部感通寺（25°39′21.84″N，100°10′57.52″E）和南部江風寺（25°34′48.10″N，100°12′7.56″E）火燒跡地、近火燒地以及蒼山中部蘭峰（25°40′21.92″N，100°05′19.77″E）非火燒地土壤樣品共208份。采集方法：采集時去除表層土壤，取0～20 cm深度的土壤300 g左右，裝入自封袋中，詳細記錄樣品信息，所有采集的樣品帶回實驗室后4℃冰箱保存，1周內(nèi)處理完所有樣品。

1.2 培養(yǎng)基采用的培養(yǎng)基主要為玉米瓊脂培養(yǎng)基（CMA）和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）〔1〕。

1.3 誘餌線蟲的制備線蟲的制備分離采用貝爾曼漏斗法〔1〕。

1.4 捕食線蟲真菌的分離與鑒定

1.4.1 捕食線蟲真菌的分離 采用誘餌平板法，每份土樣取 2～3 g〔1〕，均勻成點狀撒在直徑為 90 mm CMA平板上，土樣間留有一定的空隙，并保證樣品距培養(yǎng)皿邊緣空1 cm左右，這樣可以使捕食線蟲真菌長至空白處，便于觀察且在單孢分離時，可減少污染。每個樣品3個重復。在上述的CMA平板中各加入5 000條左右的線蟲懸液來誘導捕食線蟲真菌孢子的萌發(fā)，常溫避光培養(yǎng)4～5周。

1.4.2 捕食線蟲真菌的捕器誘導 在體視顯微鏡10～100倍下，利用無菌牙簽以無菌操作技術(shù)轉(zhuǎn)接捕食線蟲真菌單個分生孢子到留有約1 cm×1 cm觀察室的直徑60 mm CMA平板上，密封后置于26.5℃恒溫箱中培養(yǎng)直至菌絲鋪滿觀察室，然后在觀察室中加入制備好的線蟲懸液200條左右，放置于恒溫箱中培養(yǎng)2～4 d，其間需用體視顯微鏡觀察是否產(chǎn)生捕器及捕器類型，并及時記錄結(jié)果。

1.4.3 捕食線蟲真菌的形態(tài)學鑒定 采用粘片法，在體視顯微鏡下黏取分生孢子以及分生孢子梗進行形態(tài)觀察及大小測定，用透明的膠帶粘取捕食線蟲真菌的分生孢子及分生孢子梗，置于滴有適量呂氏美蘭染液的載玻片上，并蓋上蓋玻片，制成臨時裝片，顯微鏡鏡檢（40×），確定分生孢子和分生孢子梗的類型，測量分生孢子的大小及分隔數(shù)，最后結(jié)合捕食器官類型，參照文獻〔1〕進行形態(tài)鑒定和分類。

1.4.4 捕食線蟲真菌的分子生物學鑒定 難以通過形態(tài)學鑒定的種，結(jié)合分子生物學方法進行鑒定和分類。

通過ITS（internal transcribed spacer region of the ribosomal RNA gene，核糖體RNA上的非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）和TUB（β-tubulin gene，微管蛋白編碼基因）基因序列同源性分析進行分子生物學鑒定〔7〕。具體方法如下：①采用改良過的CTAB裂解法提取真菌總DNA。②引物合成：ITS基因（預擴增560 bp），引物序列為ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。TUB基因（預擴增570 bp），引物序列為Btla：5′-TTC CCC CGT CTC CAC TTC TTC TTC ATG-3′，Btlb：5′-GAC GAG ATC GTT CAT GTT GAA CTC-3′，引物由上海生物工程有限公司合成。③PCR擴增及檢測：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)，72℃10 min，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。④測序及同源性比較：PCR產(chǎn)物直接委托上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進行純化和序列測定。所測得的DNA序列與GenBank中捕食線蟲真菌相應(yīng)的DNA序列進行同源性比較，同源性達到98%以上的菌株，結(jié)合形態(tài)學鑒定結(jié)果確定種屬。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理 物種檢出率：OF=（某個種出現(xiàn)的土樣數(shù)／總的土樣數(shù)）×100%。

某屬出現(xiàn)頻率=（某屬出現(xiàn)的個體數(shù)／所有種的個體數(shù)）×100%。

其中，，N為第 種的數(shù)量，N為所有種的數(shù)ii量，Pi為第i個種占總物種數(shù)的比例，S為采樣點的物種總數(shù)〔8〕。

2 捕食線蟲真菌檢測結(jié)果

從208份土樣中共分離出150株捕食線蟲真菌，初步鑒定為3屬18種（其中待定種1種）。火燒跡地、近火燒地及非火燒地中，Dactylellina屬、Drechslerella屬和Arthrobotrys屬真菌的出現(xiàn)頻率依 次為 67.39%、20.65%、11.96%，52.94%、8.82%、38.24%，29.16%、0.00%、70.84%；優(yōu)勢種分別為Dactylellina ellipspspora（OF=36.59%），Dactylellina ellipspspora（OF=16.36%）和Dactylellina drechsleri（OF=16.36%），Arthrobotrys oligospora（OF=30.00%）；多樣性指數(shù)H′分別為2.05、2.35、1.82。見表1。

表1 各樣地捕食線蟲真菌的多樣性

3 分析與討論

3.1 火燒對捕食線蟲真菌群落結(jié)構(gòu)的影響目前普遍認為捕食線蟲真菌廣布于全球各種類型的生境中，Arthrobotrys屬真菌也因生長快、所需營養(yǎng)少、腐生能力強的特點被認為是不同生境土壤中的優(yōu)勢種群，之后，不同學者對不同生境中捕食線蟲真菌資源的調(diào)查研究也都證實了以黏性菌網(wǎng)捕捉線蟲的Arthrobotrys屬真菌的優(yōu)勢地位〔9〕。本研究結(jié)果也顯示產(chǎn)生黏性菌網(wǎng)的Arthrobotrys屬真菌是非火燒地中的優(yōu)勢種群（70.84%），但在近火燒地中Arthrobotrys屬的檢出率明顯下降，產(chǎn)生黏性球、黏性分枝和非收縮環(huán)等捕食器官的Dactylellina屬以及產(chǎn)生收縮環(huán)的Drechslerella屬真菌的檢出率上升，Dactylellina屬（52.94%）取代Arthrobotrys屬（38.24%）成為近火燒地的優(yōu)勢屬；火燒跡地中Dactylellina屬真菌出現(xiàn)頻率上升為67.39%，種群優(yōu)勢明顯，表明火燒影響了土壤中捕食線蟲真菌的群落結(jié)構(gòu)，從非火燒地到近火燒地再到火燒跡地，土壤中的捕食線蟲真菌從以Arthrobotrys屬真菌為優(yōu)勢的群落向以Dactylellina屬真菌為優(yōu)勢的群落演替。

Gray和Bailey〔10〕對林地落葉土壤中捕食線蟲真菌的研究發(fā)現(xiàn)，林地上層落物和腐殖質(zhì)層會限制產(chǎn)收縮環(huán)、黏性分枝以及黏性球的捕食線蟲真菌種群的活動，而產(chǎn)黏性菌網(wǎng)的真菌不受該限制。因此產(chǎn)生黏性菌網(wǎng)的捕食線蟲真菌在未受到火燒影響的土壤中成為優(yōu)勢種群?；馃绊懥肆值厣蠈勇湮锖透迟|(zhì)的厚度，限制收縮環(huán)、黏性分枝以及黏性球生成的因素被削弱，為火燒跡地中Dactylellina屬和Drechslerella屬真菌的生長創(chuàng)造了條件。林火在燒去上層落物和腐殖質(zhì)層的同時，改變了土壤各項理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)〔11〕，影響了線蟲等土壤動物的數(shù)量和多樣性〔12〕，此時，火燒跡地中腐生能力和捕食能力不同的捕食線蟲真菌會受到土壤理化性質(zhì)的影響，被迫發(fā)生演替。近火燒地沒有受到地表火燒的直接影響，但火燒產(chǎn)生的高溫和煙塵可能會對近火燒地造成影響，近火燒地中捕食線蟲真菌向著以Dactylellina屬真菌為優(yōu)勢的群落演替。

3.2 火燒對捕食線蟲真菌多樣性的影響火燒會對森林土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生重要影響，微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要類群，火燒對其多樣性影響很大〔13〕。本研究結(jié)果顯示蒼山近火燒地捕食線蟲真菌多樣性最高，火燒跡地次之，非火燒地最低，表明火燒增加了土壤中捕食線蟲真菌的多樣性。Hart等〔13〕發(fā)現(xiàn)林火發(fā)生后土壤中真菌的多樣性增加，這與本研究結(jié)果相符。林火發(fā)生后，土壤在較小空間內(nèi)會產(chǎn)生較高的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性，這種異質(zhì)性為微生物提供了多個異質(zhì)的微生境，從而增加了土壤的物種容納量〔14〕，這可能是近火燒地和火燒跡地捕食線蟲真菌多樣性增加的原因之一。此外，非火燒地中腐生能力較強的Arthrobotrys屬真菌占據(jù)較多的生態(tài)位，從而抑制了腐生能力相對較弱的Dactylellina屬和Drechslerella屬真菌，而火燒對土壤生境的急劇改變使前者的生長繁殖受到了影響，種群數(shù)量下降，減少了Dactylellina和Drechslerella屬真菌生長繁殖的競爭壓力，同時，火燒還快速減少了環(huán)境中的抑制因子〔10〕，使Dactylellina和Drechslerella屬真菌種群數(shù)量增加，多樣性隨之發(fā)生改變。近火燒地多樣性高于另外兩個樣地的土壤，可能是火燒釋放的熱量、煙塵等間接地影響了近火燒地的生境，從而影響了捕食線蟲真菌的多樣性，具體原因仍有待開展進一步的研究。

3.3 捕食線蟲真菌捕食器官類型的進化捕食器官的形成和分化被認為是捕食線蟲真菌適應(yīng)生存環(huán)境的結(jié)果，但在各捕食器官的進化地位上，尚存在較大分歧，甚至同一捕食器官的進化地位完全相反〔1，15-18〕。各捕食器官的捕食效率高低常被作為判斷其進化地位的依據(jù)之一，產(chǎn)生黏性菌網(wǎng)的捕食線蟲真菌，因其是目前已經(jīng)調(diào)查過的絕大多數(shù)生境的優(yōu)勢種群，黏性菌網(wǎng)通常也被認為是捕食效率較高的捕食器官〔15-16，19〕。但林慧彪等〔9〕定量測定了產(chǎn)生不同捕食器官的捕食線蟲真菌的捕食效率后發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生黏性菌網(wǎng)的種捕食效率普遍不高，且同種不同株的菌株間捕食效率也存在較大差異，因此認為將捕食器官作為判斷捕食線蟲真菌進化地位的依據(jù)還有待更系統(tǒng)的研究。本研究結(jié)果顯示，非火燒地中產(chǎn)生黏性菌網(wǎng)的Arthrobotrys屬真菌具有明顯的種群優(yōu)勢，而在火燒跡地和近火燒地中這種種群優(yōu)勢被產(chǎn)生黏性球、黏性分枝和非收縮環(huán)等捕食器官的Dactylellina屬真菌代替。而來自火燒跡地的產(chǎn)生黏性球的捕食線蟲真菌菌株，其捕食率和自發(fā)生成黏性球的數(shù)量都顯著高于來自其他生境的同一種菌〔20〕，顯示在火燒這種急劇變化的生境壓力下，Dactylellina屬真菌表達捕食器官的基因會更活躍，使其適應(yīng)火燒環(huán)境的能力增強。相對Arthrobotrys屬真菌種群數(shù)量的快速減少，火燒跡地和近火燒地產(chǎn)收縮環(huán)的Drechslerella屬真菌檢出率增加，說明Drechslerella屬真菌應(yīng)對急劇環(huán)境變化的能力也較Arthrobotrys屬真菌強。產(chǎn)不同捕食器官的捕食線蟲真菌的群落演替規(guī)律及不同生境中優(yōu)勢種群的檢測結(jié)果〔15-19〕說明對捕食線蟲真菌這個類群的真菌來說，不同生境下的種群優(yōu)勢度與捕食線蟲真菌的進化地位高低并無直接的對應(yīng)關(guān)系。因此，只通過分子系統(tǒng)發(fā)育分析和捕食率高低來探究捕食器官的進化地位似乎還不夠全面。探究如火燒等劇烈環(huán)境變化下捕食線蟲真菌捕食器官形成機制和群落演替規(guī)律可能是理解捕食器官進化的思路之一。