張 震 許彥明 陳永忠 李志鋼 王湘南 陳隆升 彭邵鋒 馬 力 王 瑞 李美群 唐 煒 彭映赫

(湖南省林業(yè)科學院，國家油茶工程技術研究中心，湖南 長沙 410004)

油茶 (Camelliaoleifera) 是我國特有的木本油料樹種，主要分布在長江以南各省份，因為其獨特的食用價值和保健價值，備受人們青睞。它與油棕 (Elaeisguineensis)、油橄欖 (Oleaeuropaea) 和椰子 (Cocosnucifera) 并稱為世界四大木本油料樹種，被譽為 “東方橄欖油”。我國油茶育種工作始于20世紀60年代中后期，陸續(xù)選育出眾多的農家良種、優(yōu)良家系和優(yōu)良無性系，為提高油茶產量，促進油茶產業(yè)發(fā)展奠定了堅實的基礎[1]。目前我國茶油年產量僅有50萬t，難以滿足國內市場的需求。因此，基于現代生物技術開展油茶分子育種、種質資源多樣性、遺傳性研究，對培育高產、高含油率的品種具有重要意義[1]。簡單重復序列標記 (Simple Sequence Repeat,SSR) 具有共顯性、效率高、成本低、靈活性強等優(yōu)點，被廣泛應用于分子育種、遺傳多樣性、種質資源進化及親緣關系等多項研究。

傳統(tǒng)的SSR分子標記開發(fā)技術主要有AFLP、RAPD、SRAP、ISSR等，基于這些技術，油茶科技工作者已經開展了相關的研究工作，包括引物篩選、擴增，油茶親緣關系、遺傳多樣性研究等內容，并取得了一定的成果[2-9]。然而，利用傳統(tǒng)方法開發(fā)SSR分子標記往往存在效率低，周期長，且成本高等問題。轉錄組測序技術不僅能夠獲得豐富的轉錄組數據，而且具有低成本、時間短等優(yōu)勢，能夠很好的解決這些難題[10]。目前一些物種已經利用轉錄組測序技術進行SSR分子標記的開發(fā)[11-14]，油茶方面也開展了相應的研究。Jia等利用高通量測序技術開發(fā)出15對多態(tài)性較好的SSR引物，用于分析不同油茶品種間的遺傳聚類、親緣關系[15]；李海波等利用Illumina測序技術篩選出20對擴增效率高、穩(wěn)定性好的多態(tài)性SSR引物對56個 “長林”、“龍林” 系列的油茶品種進行聚類分析[16]；史潔利用Roche 454測序技術對浙江紅花油茶進行測序，共獲得11 344個SSR，并對SSR的基本特征、多態(tài)性、可用性進行研究[17]；溫強等利用Roche 454測序技術篩選出18對SSR引物對浙江紅花油茶進行遺傳多樣性研究[18-19]。目前基于轉錄組測序技術開發(fā)的普通油茶SSR引物數量還十分有限，難以滿足油茶遺傳多樣性、分子育種等研究的需求。因此，本研究對普通油茶轉錄組Unigene中的SSR位點的數量、頻率、基序類型，基序長度等特征進行分析，以期能夠為油茶分子標記開發(fā)、分子輔助育種、遺傳多樣性、遺傳資源鑒定、保護等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 轉錄組數據來源

實驗材料來自湖南省長沙市天際嶺試驗林場，選擇生長健壯、無病蟲害的優(yōu)良單株進行采樣，將采集好的油茶葉片用清水洗凈后迅速投入-80 ℃液氮速凍。樣品送至昆明云初生物科技有限公司，mRNA分離、純化后進行cDNA文庫構建，利用Illumina HiSeqTM 2000雙端測序儀進行上機測序。雙端測序將每個cDNA片段分別從5′ 端和3′ 端進行測序，從而在測序后得到兩端的reads序列，每個read序列長約為150 bp，共獲得5 877 182 226個raw reads。利用perl script去除raw reads中含有接頭的、無法確定堿基比例大于5%及一些質量值Q ≤ 20的堿基數占整個序列的50%以上的低質量序列，共獲得575 534 790個干凈序列 (clean reads)。通過Trinity軟件對Clean reads進行De Novo組裝[20]:1) 利用Trinity軟件對包含overlap的序列片段進行處理，將其連接成比自身更長的序列片段，然后通過組裝，獲得不含未知核酸序列的片段，即Contig。2) 將reads再次比對回Contig，通過paired-end reads確定來自同一轉錄本的不同Contig及這些Contig之間的距離，利用Trinity軟件將這些Contig連在一起，得到兩端不能再延長的序列，即Unigene。3) 通過TGICL序列聚類軟件對這些Unigene進行進一步序列拼接和去冗余處理，得到不含N的序列，共獲得311 283條非冗余Unigene序列。

1.2 實驗方法

1.2.1轉錄組SSR位點搜索

使用MISA (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/Misa.html) 對轉錄組Unigene序列進行搜索。搜索條件為：單核苷酸 (mononucleotide)、二核苷酸 (dinucleotide)、三核苷酸 (trinucleotide)、四核苷酸 (tetranucleotide)、五核苷酸 (pentanucleotide)、六核苷酸 (hexanucleotide) 的最小重復次數分別設置為10、6、5、5、5、5。

1.2.2統(tǒng)計方法

利用Excel軟件進行數據統(tǒng)計與分析。發(fā)生頻率計算方式為含SSR的Unigene數量/總Unigene數量，出現頻率計算方式為SSR數量/總Unigene數量，平均距離是指每個SSR位點之間相隔的距離，計算方式為總序列長度/SSR數量。

2 結果與分析

2.1 油茶轉錄組中SSR位點的頻率和分布密度

油茶轉錄組測序共獲得575 534 790條干凈序列，利用TGICL聚類軟件進行De Novo組裝，經過序列拼接和去冗余處理，共獲得311 283條Unigene序列，總長度約為1.5 × 108bp，GC含量為39.17%，平均長度為497.67 bp，具體組裝信息詳見表1。

基于MISA搜索標準，在311 283條Unigene序列中共發(fā)現包含1～6重復基元的SSR位點104 515個，分布在80 724條Unigene中，發(fā)生頻率 (含SSR的Unigene數量與總Unigene數量的比值) 為25.93%。其中，其中，61 807條Unigene含有單個SSR位點，18 917條Unigene含有2個以及2個以上SSR位點，8 008條Unigene含有復合型SSR位點。油茶轉錄組中SSR位點的出現頻率 (SSR數量與總Unigene的數量的比值) 為33.58% (表2)。油茶轉錄組SSR位點平均距離為1.48 kb。

基于Weber的分類標準，SSR主要包括精密型 (perfect repeat sequences)、非精密型 (imperfect repeat sequences) 和復合型 (compound repeat sequences) 3種類型[21]。104 515個SSR位點中有96 507個 (92.34%) 精密型SSRs，700個 (0.67%) 非精密型SSRs和7 308個 (6.99%) 復合型SSRs。在精密型SSRs中，單核苷酸和二核苷酸是主要的重復類型，共占SSR總數的80.41%，其中，單核苷酸重復所占的比例最大，為48.48%，二核苷酸重復次之，為31.93%，四、五、六核苷酸重復的數量較少，總計2.60%。從長度看，核苷酸重復類型平均長度為18.66 bp。單核、二核、三核、四核、五核、六核苷酸重復平均長度分別為14.16、19.33、19.16、21.72、26.16、36.51 bp，具有一定的差異性。從SSR分布密度看，不同核苷酸重復類型的平均分布距離具有顯著差異，總體上呈現出隨出現頻率的增加而縮短的趨勢 (表3)。

表2 油茶轉錄組中SSR搜索結果Table 2 Searching results of SSR in transcriptome of C.oleifera

表3 油茶轉錄組中SSR的數量、頻率和平均距離Table 3 The number,frequency and average distance of SSR in transcriptome of C.oleifera

2.2 油茶轉錄組中精密型SSR基元類型和比例

油茶轉錄組精密型SSRs中 (合計96 507個)共發(fā)現812種基元類型，單核、二核、三核、四核、五核、六核苷酸重復分別有4、12、60、135、207、394種 (表4)。單核甘酸中A重復數量最多，為25 014個 (25.92%)，其次是T重復，24 394個 (25.28%)。二核苷酸中主要的重復基元是AG (6 379個，占6.61%)、GA (5 741個，占5.95%)。三、四、五、六核苷酸中最多的重復基元分別是AAT (615個，占0.64%)、AAAT (319個，占0.33%)、TTTTC (25個，占0.03%)、TTTTTG (8個，占0.01%)。

表4 油茶轉錄組SSR重復基元序列特征Table 4 Sequence features of SSR motifs in transcriptome of C.oleifera

從核苷酸重復基序類型來看，單核甘酸中的A/T重復基序為主要的類型 (49 408個，占51.20%)。二核苷酸中AG/CT為主要類型，共11 112個，占總SSR的11.51%，其次是AT/TA重復基序 (8 613個，占8.92%) 和AC/GT重復基序 (1 204個，占1.25%)。三核苷酸中AAT/ATT (989個，占1.02%) 出現頻率最高，其次是ACC/GGT (505個，0.52%) 和ATC/ATG (260個，0.27%)。四核甘酸中AAAT/ATTT占絕對優(yōu)勢，其次是AAAG/CTTT。五核甘酸中以AAAAT/ATTTT為主 (圖1)。

2.3 油茶轉錄組中SSR重復次數和基序長度

作為評價其可用性的重要依據，SSR多態(tài)性通常受到基元重復次數和基序長度的影響[22]。從單次重復次數來看，油茶轉錄組中精密型SSRs (合計96 507個) 重復單元的重復次數主要集中在10次以上。其中，比例最高的是10次重復 (共15 751個SSR，占16.32%)，其次是11次重復 (共10 901個，占11.30%) 和6次重復 (共10 811個SSR，占11.20%)?？傮w上，除單核甘酸外，其他核苷酸重復次數主要集中5～10低次重復。從核苷酸類型看，單核甘酸中出現頻率最高的重復次數為10次，為13 315個。二核苷酸中6次重復的SSR數目最多，為8 070個。三核、四核、五核和六核苷酸中，不同重復次數出現頻率的趨勢基本相同，即SSR數量隨著重復次數的增加而逐漸減少 (表5)。

圖1油茶轉錄組中SSR基元類型
Fig.1 Type of SSR inC.oleiferatranscriptome

表5 油茶轉錄組中不同重復次數的SSR數量Table 5 The number of SSR with different repeats in transcriptome of C.oleifera

SSR基序長度對于其多態(tài)性的高低具有直接的影響，通常認為長度在20 bp以上的SSR的多態(tài)性較高；長度在12～20 bp的SSR的多態(tài)性中等；低于12 bp的SSR多態(tài)性極低[22]?；谟筒柁D錄組測序獲取的104 515個SSR位點的長度分布在10～175 bp之間，平均長度18.66 bp，不同長度的SSR基序分布情況如圖2所示。大部分基序長度集中在12～20 bp，共有54 044個，占總數的51.71%；其次是21～30 bp，共有18 309個，占總數的17.52%。超過20 bp的SSR數量占總數的28.15%，低于12 bp的SSR數量占總數的20.14%。結果表明油茶轉錄組SSR理論上具有中等以上的多態(tài)性，預期能夠進行相關目的引物的設計與開發(fā)，用于油茶遺傳多樣性、遺傳圖譜繪制、分子輔助育種等方面的研究。

圖2油茶轉錄組中SSR基序長度
Fig.2 Length of SSR inC.oleiferatranscriptome

3 結論與討論

基于油茶轉錄組測序共獲得311 283條Unigene，利用MISA進行搜索，共發(fā)現104 515個SSR位點，出現頻率為33.58%，高于油棕22.60%、四球茶 (Camelliatetracocca) 23.79%、茶樹 (Camelliasinensis) 9.63%等物種[23-25]。油茶轉錄組SSR平均分布距離為1.48 kb，也高于油棕7.19 kb、四球茶2.07 kb、茶樹3.68 kb等物種[23-25]。無論是發(fā)生頻率還是平均分布距離，油茶轉錄組SSR都相對較高，表明油茶轉錄組中的SSR種類和數量都比較豐富。此外，和其他物種相比，油茶轉錄組SSR的平均分布距離和出現頻率也存在一定的差異。一方面可能是因為物種的特異性，另一方面可能是不同的搜索參數，搜索工具以及測序技術引起的。

即使相同的物種，其SSR信息特征也可能因為測序技術、轉錄組測序數據庫大小、原始序列等因素出現一定的差異。和前人所做的關于油茶SSR的分析結果相比，此次油茶轉錄組SSR位點的出現頻率、平均距離等指標均呈現出一定的差異。史潔等[17]分析得出油茶基因組中的SSR平均距離是1.85 kb。溫強等[19]利用454測序方法得出油茶SSR的發(fā)生頻率在3.10%～6.70%之間，平均距離在0.63～0.95 kb之間。李海波等[16]研究發(fā)現油茶轉錄組中SSR位點的發(fā)生頻率為26.75%，平均距離為2.33 kb。這可能是因為不同的測序技術和測序材料造成的。此次測序所用材料主要是湘林系列油茶的葉片，測序方法為Illumina測序技術，而溫強等[19]人將浙江紅山茶 (Camelliachekiangoleosa) 和短柱茶 (Camelliabrevistyla) 的花芽作為測序材料，測序方法為454測序法，李海波等[16]選擇的材料是長林18號的幼嫩葉片，史潔等[17]利用Roche 454測序儀對樹齡為100 a的浙江紅花油茶古樹的葉片和花芽進行測序。

油茶轉錄組精密型SSRs中以單核苷酸和二核苷酸重復為主，占SSR總數的80.41%。這與先前多個物種的研究結果一致，例如油棕[23]、厚樸 (Magnoliaofficinalis)[22]等物種。根據前人研究，單核甘酸中A/T重復的數量居多，植物中的二核苷酸以AG/CT居多，其次是AT/TA重復[26]。 此次研究發(fā)現，A/T、AG/CT、AT/TA分別是單核苷酸和二核苷酸的優(yōu)勢重復基元，這和前人研究結果一致。通常認為雙子葉植物中最多的三核苷酸是AAG/CTT重復[19]，然而此次研究發(fā)現油茶轉錄組中最多的三核苷酸類型是ATT/ATT，這和史潔、溫強等人關于油茶的研究結果一致，初步分析這一特征是油茶區(qū)別與其他物種的特異性表現。溫強等人的研究表明油茶中以二核苷酸為主，而此次研究發(fā)現油茶中的單核苷酸最多。造成這種差異可能有多種原因：研究中使用不同的搜索、評價標準，有的研究使用序列長度作為主要的搜索參數，有的研究把最小重復次數作為主要的評價標準；不同的測序技術、樣品、原始測序數據大小均可能會造成同一物種的SSR信息出現一定的差異。此外，在利用轉錄組測序技術獲得SSR的過程中，也存在序列突變的情況，這也可能會造成SSR搜索的過程中出現信息失真的情況。因此，迫切需要制定一個合理的、統(tǒng)一的SSR搜索檢測參數。

SSR長度變化的情況能夠直接反映SSR位點獲得 (或失去) 重復單元的活躍程度，因而經常作為評價其多態(tài)性高低的重要指標[19]。此次研究發(fā)現長度位于12～20 bp之間的SSR共有54 044個，占總數的51.71%，表明本研究中油茶轉錄組SSR 理論上具有中等以上的多態(tài)性?？梢灾攸c利用這類SSR進行油茶分子標記的開發(fā)及遺傳多樣性等方面的研究。

傳統(tǒng)SSR分子標記開發(fā)技術效率低，速度慢，且成本高，而轉錄組測序技術的出現能夠低成本、快速、高效地開發(fā)大量的SSR標記，未來其有望成為開發(fā)分子標記的重要方法。油茶轉錄組中SSR位點數量多、類型豐富，多態(tài)性較高，可用性強，對于加速開發(fā)油茶SSR分子標記，開展油茶分子輔助育種、遺傳性狀分析評價、親緣關系鑒定、特異資源保護等研究具有重要意義。