葛俊苗,李啟樂,代啟虎,陳建康,蔣采貝,張璐,盛潔,2,宋益善,2,3*

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草魚皮酶解工藝優(yōu)化及產(chǎn)物促嗜熱鏈球菌增殖和抗氧化性研究

葛俊苗1,李啟樂1,代啟虎1,陳建康1,蔣采貝1,張璐1,盛潔1,2,宋益善1,2,3*

1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院, 上海 201306 2. 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心, 上海 201306 3. 國家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(上海), 上海 201306

以草魚皮為原料，利用風(fēng)味中性蛋白酶酶解，并以酶解產(chǎn)物促嗜熱鏈球菌增殖效果為指標(biāo)，利用響應(yīng)面分析對酶解工藝進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，酶解產(chǎn)物促進嗜熱鏈球菌增殖的最佳酶解工藝為：酶解時間4.13 h，料水比1:10 (w/v)，風(fēng)味中性蛋白酶加酶量3.1%。另外，根據(jù)分子量大小將最佳條件下得到的膠原蛋白肽分為4段: >10000 Da；5000~10000 Da；3000~5000 Da；< 3000 Da，研究不同分子量的肽段對嗜熱鏈球菌增殖作用。結(jié)果表明，分子量< 3000 Da的肽段相比其他分子量的肽段更適合促進嗜熱鏈球菌生長。體外抗氧化性實驗為進一步了解膠原蛋白肽特性，結(jié)果表明酶解產(chǎn)物對DPPH、超氧陰離子具有較好的清除能力。GFSPH Ⅳ既可促進益生菌增殖，還具有抗氧化的生物活性，可以為多組分功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

嗜熱鏈球菌; 風(fēng)味中性蛋白酶; 多肽；響應(yīng)面分析; 抗氧化性

我國是水產(chǎn)品養(yǎng)殖大國，2016年全國水產(chǎn)品總產(chǎn)量6699.65萬t，其中淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量3290.04萬t，占全國水產(chǎn)品總量的49.11%。草魚是我國四大淡水魚之一，營養(yǎng)價值豐富，其產(chǎn)量占淡水魚總產(chǎn)量的20.9%，是我國重要的水產(chǎn)品資源[1]。在水產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物，包括魚頭、魚皮、魚鰭、魚尾、魚骨及殘留魚肉，其中魚皮占有8%以上[2]，然而我國的水產(chǎn)品加工率僅為30%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國家的80%以上[3]。研究表明，魚皮中I型膠原蛋白含量最大可超過其含量的80%，比魚體其他部位高許多[4]，然而其脂肪含量卻很低，采用酶解法從草魚皮提取膠原蛋白肽，不僅提高了草魚的綜合利用價值，對進一步促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展也具有重大的現(xiàn)實意義[5]。

近幾年來，益生菌產(chǎn)品越來越受到消費者的青睞。嗜熱鏈球菌是一種多功能益生菌，具有改善腸道微生態(tài)、調(diào)節(jié)血壓、抗癌、延緩衰老、對胃酸及膽鹽具有耐受性、縮短酸奶凝乳時間和增加酸奶黏度等特點，在乳制品工業(yè)中扮演著非常重要的角色[6-8]。嗜熱鏈球菌的益生特性主要表現(xiàn)在被人體吸收后，定植在人體的腸道中，可調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)（菌群）平衡，提高機體免疫力，促進人體健康[9,10]。但嗜熱鏈球菌蛋白代謝能力弱[11]，且大多數(shù)嗜熱鏈球菌的生長都需要蛋氨酸、組氨酸、脯氨酸以及谷氨酸[12]。有研究表明寡肽是嗜熱鏈球菌生長的最佳氮源[13,14]。

本實驗以水產(chǎn)品廢棄物草魚皮為原料，研究其酶解產(chǎn)物對嗜熱鏈球菌增殖效果。以促進嗜熱鏈球菌增殖為指標(biāo)，即在600 nm處的吸光值（Optical density, OD），利用風(fēng)味中性蛋白酶酶解，并通過Box-Behnken中心組合設(shè)計對酶解工藝進行了優(yōu)化。該研究成果可以為水產(chǎn)品新型益生菌功能食品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚（3~5 kg）：購于上海市浦東新區(qū)農(nóng)工商附近菜市場（鮮活）。風(fēng)味中性蛋白酶（1946 U/mg）：山東隆大生物工程有限公司；嗜熱鏈球菌：購于上海魯微科技有限公司。

試驗中所有化學(xué)試劑均購于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。MSC300國產(chǎn)杯式超濾器：上海摩速科學(xué)器材有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理將鮮草魚置于裝有冰塊的密封箱，運輸至實驗室，宰殺后清洗干凈，然后剝皮（全程在0 ℃冰水混合物中操作），獲得的魚皮用0 ℃蒸餾水洗至中性，再用吸水紙擦干表面水分，用剪刀剪至約0.2 cm×0.2 cm碎片，放-20 ℃冰箱，備用。

1.2.2 草魚皮膠原蛋白肽制備工藝流程工藝流程：魚皮切碎物→加蒸餾水混勻→熱處理（100 ℃，30 min）→冷卻至酶解溫度→調(diào)pH值→加酶→酶解→滅酶（100 ℃，10 min）→離心（5000 r，20 min）→過濾→冷凍干燥。

本實驗選用的草魚皮，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)27.0%，而脂肪和灰分含量較低，僅占1.8%，0.3%，具有高蛋白、低灰分、低脂肪的特點[9,15]?？紤]在實際產(chǎn)業(yè)化過程中，盡量減少操作步驟，本研究中原材料沒有進行脫脂處理，而是通過4 ℃離心過濾操作除去大多數(shù)脂肪；酶解結(jié)束后采用100 ℃沸水處理10 min使酶失活。

1.2.3 單因素試驗風(fēng)味蛋白酶天然安全，反應(yīng)條件溫和、酶解產(chǎn)物品質(zhì)高，可應(yīng)用于各種動植物蛋白的酶解，后期風(fēng)味優(yōu)化，去除苦味，改善口感，采用風(fēng)味中性蛋白酶可制取良好酶解產(chǎn)物，提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低成本。風(fēng)味中性蛋白酶最適溫度為50 ℃、最適pH為7.0，因此本研究主要考察了酶解時間、料水比、加酶量三個單因素對嗜熱鏈球菌增殖效果的影響，選擇酶解時間4 h，料水比1:10（w/v），加酶量4%，固定其中兩個單因素，另一因素水平分別如下：酶解時間：1 h，2 h，3 h，4 h，5 h，6 h，7 h；料水比：1:5，1:10，1:15，1:20；加酶量：1%，2%，3%，4%，5%。

1.2.4 響應(yīng)面試驗在單因素的基礎(chǔ)上，選出三種因素最佳因素水平進行響應(yīng)面實驗設(shè)計，采用Box-Behnken模型設(shè)計，優(yōu)化促進嗜熱鏈球菌增殖的酶解工藝。

1.2.5 不同分子量草魚皮酶解物的制備酶解液離心過濾后，上清液用超濾膜進行逐級分離。膜的截留分子量分別為10 k Da，5 k Da和3 k Da，控制蠕動泵轉(zhuǎn)速為30 rpm，超濾壓力為0.1 MPa。分別收集四個組分GFSPH Ⅰ (>10 k Da）、GFSPH Ⅱ (5-10 k Da)、GFSPH Ⅲ (3-5 k Da）和GFSPH Ⅳ(< 3 k Da)。然后將各組分進行冷凍干燥，放-20 ℃冰箱，備用。

1.3 魚皮酶解產(chǎn)物促進嗜熱鏈球菌生長活性的測定

1.3.1 化學(xué)限定培養(yǎng)基基本組成為了直觀測定酶解產(chǎn)物作為氮源對嗜熱鏈球菌增殖效果，本實驗選擇化學(xué)限定培養(yǎng)基培養(yǎng)嗜熱鏈球菌，化學(xué)限定培養(yǎng)基基本組成參考宋益善等[15]并稍加修改，如表1。

配置過程中，維生素和無機鹽用0.22 μm膜過濾以除雜菌，其余配置成溶液后121 ℃高壓滅菌30 min。維生素需避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 嗜熱鏈球菌增殖培養(yǎng) 5 mL嗜熱鏈球菌活化試管斜面加入1 mL無菌蒸餾水，震蕩制備菌懸液；接種量為2%（v/v），37 ℃培養(yǎng)18 h，培養(yǎng)過程中搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min。

1.3.3 嗜熱鏈球菌增殖效果OD值的測定采用紫外-可見分光光度計在600 nm處的吸光度值來表示嗜熱鏈球菌的增值效果，調(diào)零基準(zhǔn)為不加任何氮源、相同條件下的液體培養(yǎng)基。

表 1 化學(xué)限定培養(yǎng)基基本成分

1.4 酶解產(chǎn)物體外抗氧化活性研究

為進一步了解膠原蛋白肽的特性，進行了體外抗氧化活性測定。

式中：0—2 mL蒸餾水+2 mL DPPH溶液的吸光值；1—2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光值；2—2 mL樣品溶液+2 mL DPPH無水乙醇的吸光值。

式中：0—為空白對照的吸光度；A—加樣品溶液的吸光度；A0—不加顯色劑H2O2溶液的本底吸光度。

1.5 實驗數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件處理分析；響應(yīng)面數(shù)據(jù)Design Expert 7.1.3軟件處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解反應(yīng)時間對嗜熱鏈球菌增殖作用研究

酶解反應(yīng)時間對嗜熱鏈球菌增殖作用的影響如圖1所示。由圖可知，隨著反應(yīng)時間的增加，嗜熱鏈球菌的OD值逐漸增加，然后降低，并在4 h達(dá)到最高值。其可能原因是在酶解反應(yīng)前期，隨著時間的增加，更多的魚皮被酶解為多肽，但當(dāng)達(dá)到一定時間后，大部分草魚皮已被酶解，同時酶解產(chǎn)物中多肽也會被風(fēng)味中性蛋白酶酶解，導(dǎo)致多肽含量降低。顯著性差異分析表明，在0.05顯著水平上，4 h與5 h、3 h、6 h、7 h、2 h和1 h有顯著性差異；5 h與3 h無顯著性差異；5 h與6 h、7 h、2 h和1 h有顯著性差異；3 h與6 h、7 h、2 h和1 h有顯著性差異；6 h與7 h、2 h和1 h有顯著性差異；7 h與2 h和1 h有顯著性差異；2 h和1 h有顯著性差異。

2.2 料水比對嗜熱鏈球菌增殖作用研究

料水比對嗜熱鏈球菌增殖作用的影響如圖2所示。由圖可知，隨著加水量的增加，嗜熱鏈球菌的OD值先增加，然后下降，當(dāng)料水比為1:10時，嗜熱鏈球菌的OD值最高。這可能是因為酶解反應(yīng)是在水中進行的，料水比數(shù)值較低時，高濃度的底物蛋白過于聚集而不利于與風(fēng)味中性蛋白酶活性部位結(jié)合，從而產(chǎn)生較少的多肽；隨著加水量的增加，分子運動活躍，風(fēng)味中性蛋白酶與底物接觸機會增多，水解反應(yīng)充分，生成的多肽的量也增多；當(dāng)加水量達(dá)到一定數(shù)值后，酶與草魚皮的濃度降低，兩者過于分散，接觸機會減少，導(dǎo)致多肽含量生成量減少。顯著性差異分析表明，在0.05顯著水平上，料水比(w/v) 1:10與1:5、1:15和1:20有顯著性差異；料水比(w/v) 1:5與1:15(w/v)無顯著性差異；料水比(w/v) 1:5與1:20有顯著性差異；料水比(w/v) 1:15與1:20有顯著性差異。

圖 1 酶解時間對嗜熱鏈球菌增殖作用的影響

圖 2 料水比對嗜熱鏈球菌增殖作用的影響

Fig.2 Effect of ratio of material to water on proliferation of

2.3 加酶量對嗜熱鏈球菌增殖作用研究

加酶量對嗜熱鏈球菌增殖作用的影響如圖3所示。由圖可知，隨著加酶量的增加，嗜熱鏈球菌的OD值逐漸增加，在加酶量為3%時OD值最大，之后隨著加酶量的增加而降低?？赡茉蚴钱?dāng)草魚皮數(shù)量一定時，隨著加酶量的增加，風(fēng)味中性蛋白酶與底物蛋白的接觸機會增加，水解反應(yīng)充分，生成的多肽增多，但加酶量繼續(xù)增大時，過多的酶進入反應(yīng)體系，導(dǎo)致過度酶解從而使多肽進一步分解為氨基酸，使多肽數(shù)量降低。其原因是氨基酸雖也可以被嗜熱鏈球菌生長所利用，但其增殖效果遠(yuǎn)不如寡肽[12]，從而導(dǎo)致嗜熱鏈球菌的OD值降低。顯著性分析表明，在0.05顯著水平上，加酶量3%與4%無顯著性差異；3%與2%、5%和1%有顯著性差異；4%與2%、5%和1%有顯著性差異；2%與5%和1%有顯著性差異；5%與1%有顯著性差異。從節(jié)約生產(chǎn)成本考慮，將加酶量定為3%。

圖 3 加酶量對嗜熱鏈球菌增殖作用的影響

2.4 促進嗜熱鏈球菌增殖酶解工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1 模型建立及其顯著性采用Box-Behnken Design（BBD）實驗設(shè)計方法，對促進嗜熱鏈球菌增殖酶解工藝進行響應(yīng)面優(yōu)化，分別對酶解時間，料水比，加酶量三因素在單因素基礎(chǔ)上進行三因素三水平試驗，以O(shè)D600為響應(yīng)值，結(jié)果如表2。

表 2 風(fēng)味中性蛋白酶響應(yīng)面分析

利用Design Expert 7.1.3軟件，以O(shè)D600為響應(yīng)值，對表2試驗數(shù)據(jù)二次多元回歸擬合，得到回歸模型方程：

OD600()=0.60+0.014A-0.022B+0.0065 C-0.001AB+0.00275AC+0.00025BC-0.056A2-0.11B2-0.034C2

式中A、B、C依次為酶解時間、料水比（w/v）、加酶量（%）。

通過方差分析對回歸方程進行了評價，并對其顯著性進行了檢驗，結(jié)果如表5所示。該模型的值為246.22，值小于0.0001，表明所得到的模型極顯著，模型誤差失擬項中值為4.57，值為0.0882，該模型失擬項不顯著即說明該方程對試驗擬合情況好，可靠性較高。此外該模型的決定系數(shù)（2）為0.9969和調(diào)整決定系數(shù)（R2）為0.9928，都接近1.0，表示該模型可用于嗜熱鏈球菌增殖酶解工藝實驗預(yù)測。該模型中，一次項B對嗜熱鏈球菌增殖影響極顯著（< 0.01），比較A、B、C3因素F值大小可知，3因素對嗜熱鏈球菌增殖影響大小的順序為：料水比>酶解時間>加酶量。二項式A2、B2、C2的值均小于0.0001，說明這些因素對嗜熱鏈球菌增殖影響極顯著；交互項AB、AC、BC對嗜熱鏈球菌增殖作用影響不顯著（< 0.05）。

表 3 風(fēng)味中性蛋白酶響應(yīng)面實驗方差分析

注：**表示極顯著（<0.01）; *表示顯著（<0.05）。

Note: **very significance（<0.01）；* Significance（<0.05）.

2.4.1 響應(yīng)面因素交互作用分析優(yōu)化工藝試驗中，酶解時間、料水比、加酶量三因素間的交互作用對嗜熱鏈球菌增殖的影響，如圖4。圖4（a）、（b）、(c)直觀地反映了各因素間的交互影響，可以看出AB、AC、BC交互作用的圖形均不陡峭，它們對嗜熱鏈球菌增殖作用影響均不顯著。

圖 4 各因素交互作用影響嗜熱鏈球菌增殖的響應(yīng)面圖

2.4.3 驗證性試驗 根據(jù)軟件分析，得到促進嗜熱鏈球菌增殖最佳條件為：酶解時間4.13 h，料水比1:9.89(w/v)，風(fēng)味中性蛋白酶加酶量3.1%，在此條件下，嗜熱鏈球菌OD600理論值0.600。結(jié)合實際，將酶解參數(shù)修改為酶解時間4.1 h，料水比1:10(w/v)，風(fēng)味中性蛋白酶加酶量3.1%，在此條件下進行三次重復(fù)驗證試驗，OD值為0.597±0.006，與模型預(yù)測值0.601基本一致。

2.5 不同分子量草魚皮膠原蛋白肽對嗜熱鏈球菌增殖效果

由圖5可知，相比于未分段的酶解物，GFSPH Ⅳ更能促進嗜熱鏈球菌生長。推測可能是促進嗜熱鏈球菌生長的多肽大多在分子量小于3000 Da。GFSPH Ⅰ、GFSPH Ⅱ、GFSPH Ⅲ也能促進嗜熱鏈球菌增長，但效果不如GFSPH Ⅳ，這是由于分子量小的肽更容易被嗜熱鏈球菌利用，且分子量越小，對嗜熱鏈球菌增殖效果越明顯，這表明分子量小于3000 Da的多肽是嗜熱鏈球菌最佳氮源，結(jié)果與Zhao Hongfei等[13]和Juillard V等[18]結(jié)果一致。顯著性差異分析表明，在0.05顯著水平上GFSPH Ⅳ與未分段、GFSPH Ⅲ、GFSPH Ⅱ和GFSPH Ⅰ有顯著性差異；未分段與GFSPH Ⅲ、GFSPH Ⅱ和GFSPH Ⅰ有顯著性差異；GFSPH Ⅲ與GFSPH Ⅱ無顯著性差異；GFSPH Ⅲ與GFSPH Ⅰ有顯著性差異；GFSPH Ⅱ與GFSPH Ⅰ無顯著性差異。

2.6 GFSPH Ⅳ添加量對嗜熱鏈球菌增殖效果

為分析GFSPH Ⅳ對嗜熱鏈球菌增殖作用，研究了不同GFSPH Ⅳ添加量（0.2 g/L, 0.4 g/L，0.6 g/L，0.8 g/L，1.0 g/L，2.0 g/L，3.0 g/L，4.0 g/L，5.0 g/L）對嗜熱鏈球菌增殖效果。由圖6可以看出，GFSPH Ⅳ添加量由0.2~3.0 g/L時，OD值先增加，隨后逐漸穩(wěn)定。因此，結(jié)合經(jīng)濟方面考慮，GFSPH Ⅳ最佳添加量為3.0 g/L。

圖 5 不同分子量酶解物對嗜熱鏈球菌增殖作用

圖 6 GFSPH Ⅳ添加量對嗜熱鏈球菌增殖效果

Fig.6 OD600values ofproliferated by different concentrates of GFSPH Ⅳ

2.7 體外抗氧化性研究

2.7.1 DPPH自由基清除能力不同濃度GFSPH Ⅳ對DPPH自由基清除能力見圖7。由圖可以看出，GFSPH Ⅳ對DPPH自由基均有較強的清除活性，在擬合范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，對自由基的清除率呈上升的趨勢。對樣品濃度與自由基清除率的數(shù)據(jù)選用二次函數(shù)模型進行擬和，可得到擬和方程，以自由基清除率為50%時樣品的濃度IC50來衡量樣品對DPPH自由基的清除能力。結(jié)果可得：=-0.17912+7.0131+11.971，2=0.9956，擬合范圍1~10 mg/mL，IC50=6.50 mg/mL。這表明GFSPH Ⅳ具有一定的DPPH清除能力，在濃度為5 mg/mL時，GFSPH Ⅳ DPPH清除能力達(dá)到42.71%，遠(yuǎn)高于張華[19]制備的比目魚皮多肽的DPPH清除率（15.38%），然而略低于賈韶千[20]制備的黃鱔魚骨多肽的DPPH清除率（90.85%）。

圖 7 不同濃度GFSPH Ⅳ的DPPH清除能力

圖 8 不同濃度GFSPH Ⅳ的羥自由基清除能力

2.7.1 羥自由基清除能力不同濃度GFSPH Ⅳ對羥自由基清除能力見圖8。由圖可以看出，GFSPH Ⅳ對自由基均有較強的清除活性，隨著濃度的增加，對自由基的清除率呈上升的趨勢，當(dāng)濃度達(dá)到一定值時，清除率增加趨向平衡。對樣品濃度與自由基清除率的數(shù)據(jù)選用二次函數(shù)模型進行擬和，可得到擬和方程。結(jié)果可得：=-0.1142+5.607+17.393，2=0.9854，擬合范圍2~20 mg/mL，IC50=6.74 mg/mL。實驗結(jié)果與張華[19]制備的比目魚皮多肽的羥自由基清除能力相當(dāng)，而遠(yuǎn)高于蘇永昌[21]制備的海參多肽IC50（12.5 mg/mL）值。

3 結(jié)論

本文對風(fēng)味中性蛋白酶草魚皮酶解物對嗜熱鏈球菌增殖效果進行了研究，并對酶解條件進行了優(yōu)化。利用單因素試驗選出對嗜熱鏈球菌增殖較好的酶解時間、料水比和加酶量的最佳單因素水平，進行響應(yīng)面優(yōu)化，得到促進嗜熱鏈球菌增殖的最佳酶解工藝為：酶解時間4.13 h，料水比1:9.89（w/v），風(fēng)味中性蛋白酶加酶量3.1%，驗證實驗表明該模型與實際結(jié)果基本擬合，可較好地預(yù)測實驗結(jié)果。分段實驗結(jié)果表明，草魚皮膠原蛋白肽的分子量越小（＜3000Da），對嗜熱鏈球菌增殖效果越明顯。體外抗氧化性表明，GFSPH Ⅳ對DPPH自由基清除的IC50值為6.50 mg/mL，對羥自由基自由基清除的IC50值為6.74 mg/mL，說明GFSPH Ⅳ對DPPH自由基的清除能力強于羥自由基。GFSPH Ⅳ既可促進益生菌增殖，還具有抗氧化生物活性，可以為多組分功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

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Optimization of Hydrolysis Conditions for Peptides from Grass Carp Fish Skin: Promotion forProliferation and Characterization of Antioxidant Activity

GE Jun-miao1, LI Qi-le1, DAI Qi-hu1, CHEN Jian-kang1, JIANG Cai-bei1, ZHANG Lu1, SHENG Jie1,2, SONG Yi-shan1,2,3*

1.201306,2.201306,3.()201306,

The hydrolysates from grass carp fish skin were prepared by using flavor neutral protease, and the response surface methodology (RSM) was employed to optimize the enzymatic hydrolysis conditions, by using proliferation effect ongrowth of hydrolysate as the evaluation index. The results showed that the optimum conditions were hydrolysis time of 4.13 h, the ratio of water to raw material of 1:10 (w/v), enzyme concentration of 3.1%. The Grass Carp fish skin hydrolysate prepared under the optimum conditions was fractionated to four fragments according to molecular weight sizes: >10000 Da；5000~10000 Da；3000~5000 Da 0；< 3000 Da, in which the fragments with molecular weights of less than 3000 Da significantly radicals (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) > superoxide > hydroxyl).

; flavor neutral protease; polypeptides; Response Surface Methodology; antioxidant activity

TS254.9

A

1000-2324(2018)06-0968-07

10.3969/j.issn.1000-2324.2018.06.013

2018-06-05

2018-07-13

上海海洋大學(xué)科技發(fā)展專項基金（2018）資助(A2-0203-00-100229)

葛俊苗(1995-),女,在讀研究生,主要研究方向為功能性食品. E-mail:947852513@qq.com

Author for correspondence. E-mail:yssong@shou.edu.cn