牛玉娟,孫芹芹*,趙君,孫偉,張會(huì)霞 張桂華,肖一紅,商營(yíng)利,劉思當(dāng)**

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禽腺病毒Hexon蛋白多克隆抗體制備及特異性鑒定

牛玉娟1,2,3,孫芹芹1,2,3*,趙君1,2,3,孫偉4,張會(huì)霞1,2,3張桂華1,2,3,肖一紅1,2,3,商營(yíng)利1,2,3,劉思當(dāng)1,2,3**

1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院, 山東 泰安 271018 2. 山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 泰安 271018 3. 山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心, 山東 泰安 271018 4. 蓬萊市小門家獸醫(yī)站, 山東 煙臺(tái) 265603

本研究旨在制備禽腺病毒（FAdV）Hexon蛋白多克隆抗體并對(duì)其特異性進(jìn)行分析鑒定。通過(guò)構(gòu)建重組的原核表達(dá)載體pET-28a-Hexon，轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21 (DE3)，IPTG誘導(dǎo)，并運(yùn)用SDS-PAGE進(jìn)行重組蛋白的鑒定，最后純化蛋白。利用純化的融合蛋白進(jìn)行常規(guī)新西蘭大白兔免疫，以制備Hexon蛋白的多克隆抗體。采用間接免疫熒光、免疫組織化學(xué)和Western blot的方法鑒定多克隆抗體的特異性。結(jié)果表明，Hexon蛋白的原核表達(dá)量較高，并且是以包涵體的形式存在，分子質(zhì)量大小約為43 kDa；免疫兔后獲得能與FAdV發(fā)生特異性反應(yīng)且高效價(jià)的多克隆抗體。因此，本試驗(yàn)制備的FAdV Hexon蛋白的多克隆抗體證明特異性良好，為后期禽腺病毒病的診斷、致病機(jī)制研究及亞單位疫苗的研制提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

禽腺病毒;基因; 多克隆抗體; 特異性

禽腺病毒(fowl adenovirus, FAdV) 依據(jù)抗原的不同分為3個(gè)群，其中Ⅰ群腺病毒又可分為5個(gè)亞群（A~E）、12個(gè)血清型(FAdV-1至8a和8b至11)[1]。1963年和1987年分別在美國(guó)和巴基斯坦爆發(fā)了包涵體肝炎?。╥nclusion body hepatitis，IBH）和心包積液綜合征?。╤ydropericardium syndrome，HPS）[2,3]，主要侵害雛雞，多呈急性經(jīng)過(guò)，使世界養(yǎng)禽業(yè)遭受滅頂之災(zāi)[4-7]。我國(guó)于1976年首先在臺(tái)灣省發(fā)現(xiàn)禽腺病毒感染[8]，隨后在遼寧、山東、內(nèi)蒙古等多個(gè)省份相繼發(fā)現(xiàn)IBH的流行[9-11]，2015年爆發(fā)了HPS[12]。

迄今為止，國(guó)內(nèi)在該病毒的致病性機(jī)制、血清學(xué)診斷方法及亞單位疫苗開(kāi)發(fā)等方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究從心包積液綜合征臨床病例中分離得到FAdV，克隆其衣殼蛋白-Hexon部分基因，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET-28a-Hexon，轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21 (DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。

六鄰體蛋白（Hexon蛋白）是腺病毒的主要結(jié)構(gòu)衣殼蛋白之一，也是主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇和次要的種特異性抗原決定簇。根據(jù)六鄰體的三維結(jié)構(gòu)模式，幾個(gè)比較大的抗原表位區(qū)都位于前段loop1和中段loop2，具有型和群的特異性表位，能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的抗體[11,12]。因此，運(yùn)用軟件預(yù)測(cè)loop1和loop2中免疫原性較強(qiáng)的一段序列，進(jìn)行常規(guī)的原核表達(dá)，制備免疫原，而后對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行了三次免疫，以制備抗FAdV Hexon蛋白兔的多克隆抗體。制備特異性強(qiáng)且高效的多克隆抗體可為進(jìn)一步開(kāi)展FAdV流行病學(xué)調(diào)查、疾病診斷、致病機(jī)制研究和亞單位疫苗研制提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

禽腺病毒血清4型（FAdV-4）SDDM-4/15株、血清8b型（FAdV-8b）和血清11型（FAdV-11）由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存；pET-28a原核表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室提供；病毒DNA提取試劑盒和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均來(lái)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；rTag酶和限制性內(nèi)切酶H I和d III均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；FITC-羊抗兔二抗及DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京康為生物技術(shù)有限公司；Ni- NTA純化蛋白柱子購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司；ELC顯色液購(gòu)自上海文淵閣生物科技有限公司；原代雞胚腎細(xì)胞（CEK）；雞肝癌細(xì)胞（LMH）購(gòu)自ATCC；胎牛血清購(gòu)自BI公司。體重2.5 kg左右的新西蘭大白兔購(gòu)自濟(jì)南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 FAdV-4 Hexon基因的原核表達(dá)和純化

取病毒培養(yǎng)上清，采用病毒DNA提取試劑盒提取病毒基因組DNA，作為FAdV-4基因擴(kuò)增模板。用DNA star軟件預(yù)測(cè)n基因中免疫原性較強(qiáng)的一段序列（385-1419），并用Primers 6.0 軟件根據(jù)參考序列（Gene Bank 登錄號(hào)：KDA877411）設(shè)計(jì)特異性引物（小寫部分為酶切位點(diǎn)），F(xiàn): 5′-CGggatccCTGGCTCCCAAGGAGTCCATGTTT-3′（引入H I酶切位點(diǎn)）；R: 5′-CCCaagcttGACGCGCTTGTTCATGTACTCGTAG-3′（引入d III酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增1052 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)H I和d III雙酶切后與經(jīng)同樣酶切的pET-28a進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化入BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆采用雙酶切鑒定和序列測(cè)定分析，重組陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pET-28a-Hexon。將雙酶切與測(cè)序結(jié)果正確的陽(yáng)性菌接種于新鮮的LB培養(yǎng)基中，活化擴(kuò)大培養(yǎng)2~3 h，用終濃度為1 mmol/L的IPTG 37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)3 h。將陽(yáng)性菌液經(jīng)13000 r/min 4 ℃離心15 min后，用少量的PBS重懸菌體，然后進(jìn)行超聲破碎后，離心取上清和沉淀，用SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的在上清和沉淀中的表達(dá)。取超聲破碎后的包涵體，加入8 mmol/L的尿素溶解，利用Ni-NTA純化試劑盒純化融合蛋白，純化后的目的蛋白SDS-PAGE鑒定后，放于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 兔抗雞Hexon多克隆抗體的制備

初次免疫時(shí)，將鑒定純化好的融合蛋白與弗氏完全佐劑按1:1充分混勻乳化，進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射3只兔子（1 mg/只）。以后每2周用弗氏不完全佐劑與純化蛋白1:1混勻皮下注射，加強(qiáng)免疫2次。最后一次免疫一周之后，采血分離血清作為一抗，至-80 ℃保存。

1.4 間接免疫熒光鑒定多克隆抗體特異性

分別將FAdV-4 (SDDM-4/15)、FAdV-8b和FAdV-11接種CEK，病毒侵染3 d，觀察到攻毒的細(xì)胞形成明顯典型的細(xì)胞病變，采用多聚甲醛固定細(xì)胞，按常規(guī)間接免疫熒光步驟進(jìn)行分析鑒定。一抗為1:200倍稀釋，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，分別加入二抗為FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:300倍），37 ℃孵育1 h，PBS洗3次后，每孔加入50mL PBS溶液，置熒光顯微鏡下觀察。

1.5 免疫組織化學(xué)鑒定多克隆抗體的特異性

將之前進(jìn)行FAdV-4攻毒試驗(yàn)第4天固定的各個(gè)臟器進(jìn)行常規(guī)石蠟切片[10]，之后按照常規(guī)的免疫組織化學(xué)步驟進(jìn)行染色，切片孵育兔多克隆抗體（1:100倍），4 ℃過(guò)夜孵育，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG (1:800倍)，37 ℃孵育1 h，最后用DAB顯色試劑盒顯色。陰性對(duì)照用未免兔血清代替一抗。

1.6 Western blot 鑒定多克隆抗體的特異性

將MOI為10的FAdV-8b、FAdV-11和FAdV-4接種LMH，待接毒36 h后，收集細(xì)胞，裂解進(jìn)行Western blot分析鑒定。一抗為1:5000倍稀釋的兔抗Hexon的多克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:5000倍），ECL顯色。

2 結(jié)果

2.1 FAdV-4 部分Hexon基因的PCR擴(kuò)增

以提取的FAdV-4基因組為模板，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了與預(yù)期大小相符的1052 bp片段（圖1A）。之后PCR和I和III雙酶的鑒定結(jié)果（圖1B）均顯示重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-Hexon構(gòu)建成功，測(cè)序結(jié)果也證實(shí)插入的目的基因大小正確且閱讀框沒(méi)有移碼。

圖 1 FAdV-4 Hexon部分基因PCR擴(kuò)增電泳圖及重組表達(dá)載體pET-28a-Hexon雙酶切鑒定電泳

A：M. DL2000 DNA Marker； 1. FAdV-4部分基因擴(kuò)增產(chǎn)物1052bp； B：M. DL5000 DNA Marker；1. pET-28a載體；2. 重組pET-28a-Hexon雙酶切產(chǎn)物。

A: M. DL2000 DNA Marker; 1, FAdV-4partial gene amplification product 1052bp. B: M. DL5000 DNA Marker; 1. pET-28a plasmid; 2. Recombinant pet-28a-bienzymatic product.

2.2 融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)（圖2A），誘導(dǎo)后的pET-28a-Hexon在約43 kDa處有1條與預(yù)期大小相符的特異蛋白帶，而誘導(dǎo)前后pET-28a和誘導(dǎo)前的pET-28a-Hexon卻沒(méi)有相應(yīng)條帶，這與預(yù)期結(jié)果是一致的，說(shuō)明融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。通過(guò)比較上清與沉淀的包涵體蛋白條帶發(fā)現(xiàn)，絕大部分融合蛋白存在于沉淀包涵體中，而上清中僅有極少量甚至沒(méi)有該融合蛋白，說(shuō)明原核表達(dá)的該蛋白主要是以包涵體的形式存在菌體內(nèi)。

超聲波破碎重組誘導(dǎo)的菌體，離心分離包涵體，用Ni-NTA純化重組蛋白pET-28a-Hexon，SDS-PAGE結(jié)果表明純化效果較好（圖2B），純化的蛋白可以作為抗原免疫兔子。

圖 2 重組蛋白FAdV-4 Hexon的表達(dá)及鑒定

A：M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1. pET-28a誘導(dǎo)前；2. pET-28a誘導(dǎo)后； 3. 重組pET-28a-Hexon誘導(dǎo)前；4. 重組pET-28a-Hexon誘導(dǎo)后；B：M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1. pET-28a-Hexon誘導(dǎo)后超聲裂解上清；2. pET-28a-Hexon誘導(dǎo)后超聲裂解包涵體；3. 融合蛋白純化時(shí)流出液；4. 融合蛋白純化的洗脫液。

A: M. Protein relative molecular mass standard; 1. Before the induction of pET-28a; 2.After the induction of pET-28a; 3.Before the induction of recombinant pET-28a-Hexon; 4. After the induction of recombinant pET-28a-Hexon. B: M. Protein relative molecular mass standard; 1. Supernatant of induced pET-28a-Hexon with sonication; 2. Inclusion bodies of induced pET-28a-Hexon with sonication; 3. Fusion protein efflux; 4. Elution solution for fusion protein purification

2.3 間接免疫熒光鑒定多克隆抗體的特異性

間接免疫熒光結(jié)果顯示，pET-28a-Hexon重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的Hexon蛋白免疫兔子，制備的多克隆抗體，1:200倍稀釋能夠與FAdV-4發(fā)生特異性反應(yīng)發(fā)出亮綠色熒光，與FAdV-8b和FAdV-11不發(fā)生發(fā)應(yīng)（圖3）。陰性對(duì)照兔血清與FAdV-4、FAdV-8b和FAdV-11都不發(fā)生反應(yīng)（未提供圖）。因此，所制備的兔多克隆抗體能夠特異的結(jié)合FAdV-4。

圖 3 IFA鑒定兔多克隆抗體的特異性

A：CEK細(xì)胞感染FAdV-4 (400×)；B：CEK感染FAdV-8b (200×)；C：CEK感染FAdV-11 (200×)；D：正常的CEK (200×)。

A: CEK infected with FAdV-4 (400×); B: CEK infected with FAdV-8b (200×); C: CEK infected with FAdV-11 (200×); D: Uninfected CEK (200×).

2.4 免疫組織化學(xué)鑒定多克隆抗體的特異性

免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，pET-28a-Hexon重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的Hexon蛋白免疫兔子，制備的多克隆抗體，1:100倍稀釋能夠與FAdV-4特異性結(jié)合，在肝、胰腺、腺胃、腸道、心、肺、腎、脾組織切片中看到褐色陽(yáng)性顆粒（圖4）；用陰性兔血清作為一抗卻無(wú)特異性著色（未提供圖）。

圖 4 IHC鑒定兔多克隆抗體特異性

A：肝 (400×)；B：胰腺(400×)；C：腺胃(400×)；D：小腸(400×)；E：心臟(400×)；F：肺臟(400×)；G：腎臟(400×)；H：脾 (400×)。

A: Liver (400×); B: Pancreas (400×); C: Glandular stomach (400×); D: Epithelial cells in the intestine (400×); E: Heart (400×); F Lung (400×); G: Kidney (400×); H: Spleen (400×).

2.5 Western blot鑒定多克隆抗體的特異性

Western blot試驗(yàn)結(jié)果顯示，以兔多克隆抗體1:5000倍稀釋，在接毒FAdV-8b和FAdV-11的蛋白泳道中沒(méi)有出現(xiàn)約110 KD的特異性蛋白，在接毒FAdV-4的蛋白泳道中出現(xiàn)了約110 KD的特異性蛋白條帶（圖5），表明兔多克隆抗體能與FAdV-4的Hexon蛋白結(jié)合，具有良好的特異性。

圖 5 Western blot鑒定兔多克隆抗體的特異性

Fig.5 Identification of rabbit polyclonal antibody specificity by Western blot

3 討論

腺病毒編碼的Hexon蛋白是病毒顆粒的主要衣殼蛋白之一，種屬之間的基因同源性很低。該蛋白不僅是病毒的主要保護(hù)性抗原，也是不同血清型之間存在差異且有決定性的蛋白[11,12]。鑒于Hexon蛋白在FAdV血清學(xué)診斷中常被作為包被的抗原及在基因疫苗開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用，故開(kāi)展本研究。

目前，國(guó)內(nèi)很少關(guān)于FAdV-4型Hexon蛋白的原核表達(dá)及該蛋白特異性多克隆抗體制備的報(bào)道。 FAdV-4型毒株基因全序列為2814 bp，編碼937個(gè)氨基酸，包括四個(gè)高變環(huán)loop1、loop2、loop3和loop4和兩個(gè)非常保守的基座區(qū)P1和P2。根據(jù)多種血清型腺病毒Hexon蛋白的序列發(fā)現(xiàn)，塔底區(qū)多數(shù)是非常保守的，可變區(qū)也大多是位于loop1和loop2，因此這兩個(gè)區(qū)域是參與免疫反應(yīng)的主要抗原決定簇[13-15]。根據(jù)軟件預(yù)測(cè)免疫原性較好的一段蛋白位于loop1和loop2內(nèi)，分子質(zhì)量大小約為43 kDa。從SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果可知，該蛋白能在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)，經(jīng)IPTG 37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)3 h主要以包涵體的形式存在，為后續(xù)大量制備亞單位疫苗和建立ELISA血清學(xué)檢測(cè)提供了材料。

間接免疫熒光結(jié)果顯示，該多克隆抗體能與FAdV-4產(chǎn)生特異性熒光，與FAdV-8b和FAdV-11無(wú)特異性結(jié)合，具有良好的型特異性。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國(guó)目前流行的腺病毒主要為FAdV-4，因此制備的多克隆抗體能夠有效監(jiān)測(cè)FAdV-4的流行狀況，并且可用于FAdV-4臨床病例診斷及野毒的分離鑒定[16]。免疫組織化學(xué)顯示，針對(duì)Hexon蛋白的多克隆抗體可以與FAdV-4發(fā)生反應(yīng)，且特異性良好，可用于病毒定位與含量檢測(cè)，為該病致病機(jī)制的研究提供了技術(shù)手段。Western blot的方法進(jìn)一步鑒定了該多克隆抗體的特異性，且敏感性好，為后續(xù)研究病毒與宿主蛋白相互作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

針對(duì)Hexon蛋白的多克隆抗體能夠有效地檢測(cè)FAdV-4，且抗體效價(jià)及特異性較高，制備簡(jiǎn)單、成本低廉，為該病的診斷、致病機(jī)制研究及亞單位疫苗的研制提供了技術(shù)保障。

[1] Hess M. Detection and differentiation of avian adenoviruses: a review[J]. Avian Pathology, 2000,29(3):195-206

[2] Reece RL, Barr DA, Grix DC,Observations on naturally occurring inclusion body hepatitis in Victorian chickens[J]. Australian Veterinary Journal, 1986,63(6):201-202

[3] Anjum AD, Sabri MA, Iqbal Z. Hydropericarditis syndrome in broiler chickens in Pakistan [J]. Veterinary Record, 1989,124(10):247-248

[4] Gowda SRN, Satyanarayana ML. Hydropericardium syndrome in poultry[J]. Indian Journal Veterinary Pathology, 1994,18:159-161

[5] Balamurugan V, Kataria JM. The Hydropericardium Syndrome in Poultry – A Current Scenario[J]. Veterinary Research Communications, 2004,28(2):127-148

[6] Roy P, Vairamuthu S, Sakthivelan SM,. Hydropericardium syndrome in Japanese Quails (japonica )[J]. Veterinary Research, 2004,155(9):273-274

[7] Kim JN, Byun SH, Min JK,. Outbreaks of hydropericardium syndrome and molecular characterization of Korean fowl adenoviral isolates[J]. Avian Diseases, 2008,52(3):526-530

[8] Boyle DB, Mcferran JB. Avian adenoviruses isolated from poultry in Queensland[J]. Australian Veterinary Journal, 1976,52(12):587-589

[9] 朱廣柱,林鈞安.雞包涵體肝炎病理形態(tài)學(xué)觀察[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,1987,12(13):15-17

[10] 刁有祥,李久芹.雞包涵體肝炎的診斷[J].中國(guó)畜禽傳染病,1996,1(3):40-41

[11] 郝先譜,林曦.包涵體肝炎的病理學(xué)研究[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,1993,23(5):5-7

[12] Niu YJ, Sun W, Zhang GH,. Hydropericardium syndrome outbreak caused by fowl adenovirus serotype 4 in China in 2015[J]. Journal of General Virology, 2016,97(10):2684-2690

[11] Norby E. The relationship between the soluble antigens and the virion of adenovirus type 3. IV. Immunological complexity of soluble antigens[J]. Virology, 1969,37(4):565-576

[12] Norby E, Wadell G. Immunological relationships between hexon of certain human adenoviruses[J]. Journal Virology, 1969,4(5):663-670

[13] Toogood CIA, Murali R, Burnett RM,. The adenovirus type 40 hexon: sequence, predicted structure and relationship to other adenovirus hexons[J]. Journal of General Virology, 1989,70(12):3203-3214

[14] Russell WC. Adenoviruses: update on structure and function[J]. Journal of General Virology, 2009,90(1):1-20

[15] Toogood CI, Crompton J, Hay RT. Antipeptide antisera define neutralizing epitopes on the adenovirus hexon[J]. Journal of General Virology, 1992,73(6):1429-1435

[16] Li C, Li H, Wang D,. Characterization of fowl adenoviruses isolated between 2007 and 2014 in China[J]. Veterinary Microbiology, 2016,197:62-67

Preparation and Specificity Identification of Polyclonal Antibodies Against Fowl Adenovirus Hexon Protein

NIU Yu-juan1,2,3, SUN Qin-qin1,2,3*, ZHAO Jun1,2,3, SUN Wei4, ZHANG Hui-xia1,2,3, ZHANG Gui-hua1,2,3, XIAO Yi-hong1,2,3, SHANG Ying-li1,2,3, LIU Si-dang1,2,3**

1.271000,2.271000,3.271000,4.265603,

The purpose of this study is to prepare polyclonal antibodies against fowl adenovirus (FAdV) Hexon protein and to identify its specificity. The recombinant prokaryotic expression plasmid pET-28a-Hexon was constructed and transformed intoBL21 (DE3), IPTG induction, the recombinant protein was identified by SDS-PAGE, and the protein was purified. The polyclonal antibodies of Hexon protein was prepared by routine immunity in New Zealand white rabbits with purified fusion protein. The specificity of polyclonal antibodies was identified by indirect immunofluorescence, immunohistochemistry and Western blot. The results showed the prokaryotic expression of Hexon protein was high and existed in the form of inclusion body, and its molecular weight was about 43 kDa; Polyclonal antibodies having specific reaction with FAdV and high potency could be obtained in the immunized rabbits. The above results indicated the polyclonal antibody of FAdV Hexon protein prepared in this study proved to be of good specificity and provided a good material basis for the diagnosis, pathogenesis study and subunit vaccine development of avian adenovirus diseases.

Fowl adenovirus;gene; polyclonal antibody; specificity

S858;S852.4+3

A

1000-2324(2018)06-0928-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2018.06.005

2017-10-27

2017-12-06

山東省“雙一流”獎(jiǎng)補(bǔ)資金(2017)

牛玉娟(1989-),女,博士在讀,研究方向:專業(yè)基礎(chǔ)病理學(xué). E-mail:15215384671@163.com

*同等貢獻(xiàn):孫芹芹(1991-),女,碩士在讀,研究方向:專業(yè)動(dòng)物臨床病理學(xué). E-mail:18763809792@163.com

Author for correspondence. E-mail:liusid@sdau.edu.cn